EPS8L3對乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響及作用機(jī)制

勞征虹 吳云紅 毛華君 管亮

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤。盡管近年來乳腺癌的診治方法不斷改進(jìn)，但仍是危害女性生命健康的重要疾病，其發(fā)病機(jī)制仍有待探索[1]。Rac1是小GTP結(jié)合蛋白，在多種類型細(xì)胞骨架蛋白重構(gòu)和特異性基因表達(dá)中起調(diào)控作用。表皮生長因子受體激酶底物8樣蛋白（epidermal growth factor receptor kinase substrate 8-like protein,EPS8L）是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）信號通路細(xì)胞內(nèi)底物，包括 EPS8、EPS8L1、EPS8L2 和 EPS8L3，均由 N 端磷酸結(jié)合蛋白（phosphotyrosine binding protein,PTB）區(qū)域、中間真核生物蛋白結(jié)構(gòu)域（Src homology domain 3,SH3）和C端“效應(yīng)區(qū)域”組成[2]。EPS8在多種實(shí)體瘤中表達(dá)升高，包括乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、甲狀腺乳頭狀癌和口腔癌，并影響多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲轉(zhuǎn)移[3]。研究發(fā)現(xiàn)，EPS8可與Sos-1、Abi-1形成復(fù)合物參與Ras-Rac信號通路，從而介導(dǎo)細(xì)胞骨架蛋白的重組和血管生成[4-6]；同時還可調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9,MMP-9）的表達(dá)與活化、降解細(xì)胞外基質(zhì)，協(xié)同CXC趨化因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移[7-8]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，EPS8-Sos-1-Abi-1復(fù)合物的形成可調(diào)控EGFR介導(dǎo)蛋白激酶B（protein B,AKT）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK）的激活，促進(jìn)Ras-Rac信號傳導(dǎo)，加強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力[9-10]。EPS8L3與EPS8具有類似的主要功能結(jié)構(gòu)，但與腫瘤相關(guān)的研究報道不多。本研究旨在探討EPS8L3對乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響，并分析可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 乳腺癌細(xì)胞株MAD-MB-231購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。小牛血清、抗生素、DMEM培養(yǎng)基、PBS和含0.02%的胰酶購自美國GE公司。Trizol購自美國 Invitrogen公司，PrimeScriptTMⅣ 1st strand cDNA Synthesis Mix購自日本Takara公司。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)公司。紅外熒光成像系統(tǒng)購自美國LI-COR公司。Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD生物科學(xué)公司，Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、1%抗生素（含100 U/ml青霉素和 100 mg/ml鏈霉素）和 2 mmol/L谷胺酰胺的 DMEM 培養(yǎng)液中，在 37℃、5% CO2、濕度為95%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代1次。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用含0.02% EDTA的胰酶消化1 min，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成單細(xì)胞懸液（106/ml），以4 000個細(xì)胞/孔接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中。細(xì)胞生長至80%～90%融合時提取總RNA和蛋白。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3 shRNA設(shè)計(jì)合成和轉(zhuǎn)染 shRNA1-EPS8L3和shRNA2-EPS8L3引物設(shè)計(jì)與合成由廣州銳博公司完成。按Lipofectamine3000說明使用shRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌MAD-MB-231細(xì)胞，shRNA轉(zhuǎn)染后48 h更換為加入400μg/ml G418培養(yǎng)基，篩選 5 d后改為200μg/ml G418培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，篩選細(xì)胞命名為shRNA1-EPS8L3組和shRNA2-EPS8L3組，空白對照細(xì)胞為shRNA-NC組。轉(zhuǎn)染24 h后提取RNA和蛋白，qRT-PCR和Western blot檢測相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)情況。

1.4 各組細(xì)胞EPS8L3、Rac1 mRNA表達(dá)情況檢測 采用qRT-PCR法。根據(jù)Trizol說明書提取細(xì)胞RNA后用PrimeScriptTMⅣ 1st strand cDNA Synthesis Mix試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，生成的cDNA存于4℃或直接用于定量PCR。定量PCR條件為：95℃，30 s（1個循環(huán)），95℃、5 s，55 ℃、20 s（30 個循環(huán)），95 ℃、0 s，65 ℃、15 s，95 ℃、0 s。引物序列：EPS8L3-F：5'-CTGCTACAGTCCTGTCTAAGCC-3'；EPS8L3-R：5'-GAGAATGTGGGTTGGTAGGGCA-3'；Rac1-F：5'-CGGTGAATCTGGGCTTATGGGA-3'；Rac1-R：5'-GGAGGTTATATCCTTACCGTACG-3'；GAPDH-F：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'；GAPDH-R：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。以 2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 各組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。對數(shù)期生長的細(xì)胞洗滌后加入適當(dāng)體積的RIPA裂解液，冰浴30 min，12 000g離心5 min，收集上清液后用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。以每孔20μg蛋白進(jìn)行SDS凝膠電泳，濃縮膠電壓75 V，分離膠用120 V，電泳至溴酚藍(lán)跑出即可終止電泳。隨后在300 mA恒流下轉(zhuǎn)膜1 h，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后用5%磷酸鹽吐溫緩沖液封閉1 h，4℃下加入鼠抗人或兔抗人一抗孵育過夜，洗滌后再用二抗孵育30min。洗滌后在紅外熒光成像系統(tǒng)中檢測蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 各組細(xì)胞遷移能力檢測 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。各組細(xì)胞用胰酶消化后以5×105/孔的密度接種至六孔板中，用20μl槍頭均勻在孔中劃痕，用PBS洗滌3次去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后取出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察并拍照統(tǒng)計(jì)遷移的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 各組細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。各組細(xì)胞用胰酶消化后用無血清培養(yǎng)基重懸，取200μl 5×105細(xì)胞懸液加入Matrigel包被基底膜的Transwell小室上室，下室加入600μl含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。接種后繼續(xù)置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出小室，PBS洗滌后加入4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫溶液染色15 min。倒置顯微鏡下拍照，每個樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)10個視野，統(tǒng)計(jì)侵襲的細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞EPS8L3 mRNA表達(dá)水平比較 與shRNANC組相比，shRNA1-EPS8L3組和shRNA2-EPS8L3組細(xì)胞EPS8L3 mRNA表達(dá)水平均降低（均P＜0.05），見圖1。

圖1 各組細(xì)胞EPS8L3 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較 shRNA1-EPS8L3組、shRNA2-EPS8L3組、shRNA-NC組遷移細(xì)胞數(shù)分別為（232.00±16.00）、（324.70±21.20）、（514.70±6.11）個，侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（338.70±11.37）、（384.70±13.01）、（501.30±19.01）個。與 shRNA-NC 組相比，shRNA1-EPS8L3組和shRNA2-EPS8L3組細(xì)胞遷移、侵襲能力均減弱（均P＜0.05）。EPS8L3表達(dá)降低后能抑制乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力。提示隨著乳腺癌細(xì)胞EPS8L3表達(dá)下調(diào)，乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力受抑制。見圖2。

圖2 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較（a為各組細(xì)胞遷移能力比較；b為各組細(xì)胞侵襲能力比較，*P＜0.05）

2.3 各組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與shRNANC組相比，shRNA1-EPS8L3組和shRNA2-EPS8L3組上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-Cadherin）表達(dá)上調(diào)（均P＜0.05），間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白（Vimentin）、纖黏蛋白（Fibronectin）表達(dá)下調(diào)（均P＜0.05），見圖3。提示EPS8L3表達(dá)下調(diào)可能抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT過程。

圖3 各組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（a）及水平（b）比較

2.4 各組細(xì)胞Rac1 mRNA表達(dá)水平比較 與shRNANC組相比，shRNA1-EPS8L3組和shRNA2-EPS8L3組細(xì)胞Rac1 mRNA表達(dá)水平均降低（均P＜0.05），見圖4，提示乳腺癌細(xì)胞隨著EPS8L3表達(dá)下調(diào)，Rac1表達(dá)也下調(diào)。

圖4 各組細(xì)胞Rac1 mRNA表達(dá)水平比較（*P＜0.05）

3 討論

EPS8表達(dá)升高與多種腫瘤相關(guān)。在胰腺癌細(xì)胞中，EPS8表達(dá)明顯升高，且與細(xì)胞遷移能力呈正相關(guān)[11]。在宮頸癌組織中，EPS8表達(dá)顯著升高，且與Vimentin表達(dá)呈正相關(guān)，與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，和腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]。在口腔癌組織中，ESP8在32%原發(fā)腫瘤組織中表達(dá)升高，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)[13]。EPS8L3與EPS8具有類似的主要功能區(qū)域和不同的氨基酸長度，主要與遺傳性稀毛癥有關(guān)，在腫瘤研究中的報道不多，在肝細(xì)胞癌中表達(dá)升高，并與病理分級及不良預(yù)后相關(guān)[14]。因此，筆者推測EPS8L3與EPS8類似，可能在乳腺癌中促進(jìn)腫瘤發(fā)展。本研究結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)，EPS8L3表達(dá)下調(diào)可以抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移，影響EMT相關(guān)蛋白表達(dá)，提示EPS8L3可能通過刺激EMT過程加速乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，且EPS8L3可能通過Rac1促進(jìn)乳腺癌的EMT和侵襲轉(zhuǎn)移。

EPS8與腫瘤發(fā)生和增殖密切相關(guān)，能通過刺激Ras/ERK、AKT/FOXM1和MTOR/STAT3等下游通路促進(jìn)腫瘤生長。此外，通過與Abi-1-Sos-1和IRSp53形成復(fù)合物，ESP8可以激活Rac，引起actin重建，從而促進(jìn)腫瘤遷移。EPS8過表達(dá)也可以通過AKT通路刺激MMP-9生成和腫瘤侵襲。因此，EPS8L3可能通過與EPS8類似的保守區(qū)域刺激Rac1，促進(jìn)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移[3]。

Rac1是一種Rho家族的小GTP結(jié)合蛋白，具有Rho家族蛋白的鳥苷三磷酸酶結(jié)合區(qū)，與二磷酸鳥嘌呤核苷（guanosine diphosphate,GDP）和三磷酸鳥嘌呤核苷（guanosine triphosphate,GTP）具有高度的親和性。Rac1在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)中起到重要作用，具有分子開關(guān)的作用，與GDP結(jié)合時失活，與GTP結(jié)合時激活[15]，從而對腫瘤細(xì)胞周期、運(yùn)動、轉(zhuǎn)移和EMT等進(jìn)行調(diào)節(jié)。在乳腺癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、頭頸癌等多種腫瘤中檢測到Rac1過表達(dá)或過度激活[16]。Rac1與腫瘤細(xì)胞的EMT息息相關(guān)，并且在調(diào)節(jié)蛋白重組中有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子-β通過Rac1-NOXs-活性氧通路[17]和 Rac1/活性氧/核因子 κβ/IL-6/MMP-2通路[18]調(diào)節(jié)MMP-9和MMP-2的活性，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。此外，Rac1還可通過磷脂酰肌醇3激酶/c-Jun氨基末端激酶通路上調(diào)N-鈣黏蛋白，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[19]。Rac1可以通過Ras GTP酶活化類似蛋白IQ域GTP酶激活蛋白1與上游的蛋白相互作用[20]，誘導(dǎo)EMT發(fā)生。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，EPS8L3可能通過影響Rac1通路誘導(dǎo)EMT過程發(fā)生和腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展。