豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離鑒定、耐藥性分析及益生菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用

楊 麗，孫小美，金梅林

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/ 生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）也被稱為魏氏梭菌，是一種重要的人畜共患病原菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，可以通過消化道或呼吸道侵入機(jī)體，在腸道大量繁殖并產(chǎn)生多種毒素，導(dǎo)致腸道損傷，從而引起人或動(dòng)物的魏氏梭菌病[1-2]。根據(jù)產(chǎn)生毒素種類和致病性的不同，主要分為A、B、C、D、E 5 個(gè)型[3-5]。

豬的產(chǎn)氣莢膜梭菌病主要是由A 型、C 型引起的一種急性、致死性腸道傳染病[6]。產(chǎn)氣莢膜梭菌在生豬養(yǎng)殖中具有較高的發(fā)病率和死亡率，主要侵害1 周齡仔豬，俗稱仔豬紅?。坏窃谟守i、母豬上也常有報(bào)道，感染后表現(xiàn)為血痢，腹部脹氣，病程短，又稱“猝死癥”[1,6]。目前，養(yǎng)殖場針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的預(yù)防和感染主要使用抗生素，然而，隨著抗生素耐藥性的增加和國家減抗限抗的要求，產(chǎn)氣莢膜梭菌防控問題更加突出。益生菌作為一種營養(yǎng)和免疫促進(jìn)劑，廣泛應(yīng)用于飼料添加劑中，文獻(xiàn)報(bào)道某些益生菌具有抑菌活性[7-10]，但益生菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制效果是否具有普遍性并不確定。

某大型豬場母豬發(fā)生零星、急性死亡的病例，發(fā)病豬出現(xiàn)脹氣、排出氣泡樣紅褐色液狀糞便，根據(jù)流行特點(diǎn)、臨床癥狀初步診斷為豬產(chǎn)氣莢膜梭菌病，本研究采集糞便樣品進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)，同時(shí)檢測了益生菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用，為產(chǎn)氣莢膜梭菌的臨床用藥及防控提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

培養(yǎng)基、藥敏紙片為商品化產(chǎn)品，益生菌為筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 方 法

1）樣品采集和細(xì)菌分離鑒定。采集的肛拭子棉簽置于無菌EP 管中，加入強(qiáng)化梭菌液體培養(yǎng)基（RCM），37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，增菌培養(yǎng)液劃線接種于強(qiáng)化梭菌固體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落純化培養(yǎng)，革蘭氏染色鏡檢；分離菌株接種于牛奶發(fā)酵培養(yǎng)基，46 ℃需氧培養(yǎng)2～5 h；水浴提取基因組模板，16 s 通用引物（27F/1492R）擴(kuò)增鑒定。

2）分離菌株P(guān)CR 分型。采用試劑盒提取菌株基因組模板，PCR 分型引物參考文獻(xiàn)[11]，具體引物序列見表1。

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌主要毒素基因特異性引物

3）分離菌株藥敏試驗(yàn)。采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法測定分離菌株對(duì)抗生素的敏感性，每種藥敏紙片3 個(gè)重復(fù)。

4）益生菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌抑制效果。復(fù)蘇培養(yǎng)益生菌菌株，將滅菌牛津杯置于涂布有產(chǎn)氣莢膜梭菌的TSA 培養(yǎng)基上，加入200 μL 益生菌發(fā)酵液，37 ℃培養(yǎng)20～24 h，觀察益生菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制效果，測定抑菌圈直徑，每株益生菌3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離鑒定和培養(yǎng)特性

本研究采集肛拭子樣品20 份，經(jīng)過富集培養(yǎng)、平板劃線分離共挑取80 個(gè)菌株進(jìn)行鑒定，成功分離到4 株產(chǎn)氣莢膜梭菌，編號(hào)為2#、17#、22#、25#，樣品陽性檢出率為25%。產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性肛拭子在增菌培養(yǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生大量氣體沖開EP 管蓋，導(dǎo)致管內(nèi)培養(yǎng)液減少，如圖1 所示，在TSA 瓊脂培養(yǎng)皿內(nèi)的單菌落直徑1～3 mm，邊緣不整齊，菌落乳白色不透明，4 株菌菌落形態(tài)有差異。分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色為陽性（圖2），粗短大桿菌，兩端鈍圓，單個(gè)或成對(duì)排列，在實(shí)驗(yàn)室人工培養(yǎng)中未見芽孢形成，2#和17#菌株可觀察到有莢膜形成，17#和25#菌株在液體培養(yǎng)過程中產(chǎn)氣明顯。分離菌株在牛奶發(fā)酵培養(yǎng)基中呈現(xiàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌特有的“爆裂發(fā)酵”現(xiàn)象（圖3）。

圖1 采集肛拭子在EP 管內(nèi)增菌培養(yǎng)

圖2 產(chǎn)氣莢膜梭菌革蘭氏染色光學(xué)顯微照片（100X 油鏡）

圖3 產(chǎn)氣莢膜梭菌在牛奶培養(yǎng)基中呈“爆裂發(fā)酵”

16s rDNA 序列經(jīng)比對(duì)和產(chǎn)氣莢膜梭菌同源性最高，因此，確定分離菌株為產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）。在MEGA6 中用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)4 株菌的遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR 分型

4 株產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因PCR 分型鑒定結(jié)果如表2 和圖5 所示，參考文獻(xiàn)[4-5]，根據(jù)α、β、ε、ι 4 種最主要的致病性毒素，4 株菌分為3 個(gè)不同的類型，2#菌α、ε 陽性為D 型產(chǎn)氣莢膜梭菌，17#菌α、β 陽性為C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌，22#和25#菌α、β、ε 陽性為B 型產(chǎn)氣莢膜梭菌。此外，分離獲得的4 株菌β2 毒素和腸毒素cpe 基因均為陽性，NetB 毒素陰性。

圖5 產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

表2 4 株產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因PCR 分型結(jié)果

2.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥性分析

本研究中測定4 株產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)8 類抗生素的敏感性，結(jié)果顯示（表3），β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、酰胺醇類和呋喃類對(duì)分離到的4 株產(chǎn)氣莢膜梭菌均有不同程度的抑制作用，其中β-內(nèi)酰胺中的頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢呋辛、氨芐西林、羧芐西林，四環(huán)素類中的多西環(huán)素、米諾環(huán)素，酰胺醇類中的氟苯尼考抑菌效果好，抑菌圈直徑在20 mm 以上。4 株菌對(duì)氨基糖苷類（阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素）、大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素、麥迪霉素、阿奇霉素）、多肽類（桿菌肽、多粘菌素B）、磺胺類（復(fù)方新諾明、甲氧芐啶）及林可霉素完全耐藥。氨基糖苷類中的新霉素、卡那霉素、丁胺卡那對(duì)2#和22#有較弱的抑制作用，但對(duì)17#沒有抑菌效果。檢測結(jié)果表明，抗生素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果具有菌株差異性，本研究中環(huán)丙沙星對(duì)22#菌株的抑菌直徑為31.20 mm，但對(duì)25#菌株的抑菌圈直徑只有11.09 mm。

表3 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離菌株抗生素敏感性 mm

續(xù)表3

2.4 益生菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌抑制作用

共檢測17 個(gè)種屬39 株益生菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用，結(jié)果如圖6 所示：干酪乳桿菌-6、動(dòng)物乳桿菌、植物乳桿菌、敏捷乳桿菌-1、卷曲乳桿菌、枯草芽孢桿菌-1、枯草芽孢桿菌-3、地衣芽孢桿菌對(duì)4 株產(chǎn)氣莢膜梭菌均有抑制效果。綜合比較，枯草芽孢桿菌-3 對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制效果較為突出，抑菌圈直徑在15 mm 以上。

圖6 益生菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用

3 討 論

本研究分離獲得的4 株產(chǎn)氣莢膜梭菌在菌落形態(tài)、菌體形態(tài)和培養(yǎng)特性上具有差異，16s rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)4 株菌的遺傳進(jìn)化關(guān)系不同。根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因PCR 分型鑒定結(jié)果，4株菌分為3 個(gè)不同的類型，2#菌為D 型，17#菌為C 型，22#菌和25#菌為B 型，分離獲得的4 株菌β2 毒素和腸毒素cpe 基因陽性，NetB 毒素陰性。在產(chǎn)氣莢膜梭菌引起豬病的臨床研究中，目前報(bào)道的只有A 型和C 型[3,8,12-15]，還未見B 型和D 型的報(bào)道，B 型和D 型主要引起羔羊痢疾和羊腸毒血癥[16]。但不同動(dòng)物源產(chǎn)氣莢膜梭菌的跨物種傳播已有研究報(bào)道，最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物園狼能夠感染雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌并導(dǎo)致死亡[17]。本研究首次同時(shí)從豬的臨床樣品中分離到B、C、D 3 種毒素類型的產(chǎn)氣莢膜梭菌，說明B 型和D 型也會(huì)引起豬的產(chǎn)氣莢膜梭菌病，也說明了豬場產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的復(fù)雜性，給該病的預(yù)防和治療帶來了更大的挑戰(zhàn)。

抗生素敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、酰胺醇類和呋喃類對(duì)4 株產(chǎn)氣莢膜梭菌均有一定的抑制作用。董秀梅等[17]從臨床病料中分離到1 株產(chǎn)氣莢膜梭菌，藥敏紙片結(jié)果顯示，其分離株對(duì)氟苯尼考、頭孢呋辛鈉、頭孢噻肟敏感，與本研究結(jié)果類似，但其分離株也對(duì)喹諾酮類（諾氟沙星、環(huán)丙沙星）敏感，而本研究中4 株菌對(duì)諾氟沙星不敏感，對(duì)環(huán)丙沙星的敏感性具有極大的菌株差異性。張疏桐等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類較為敏感，對(duì)阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素等氨基糖苷類耐藥，與本研究結(jié)果一致。因此，在產(chǎn)氣莢膜梭菌感染中，可優(yōu)先考慮β-內(nèi)酰胺類和氟苯尼考等藥物。

在全球養(yǎng)殖限抗、禁抗的大背景下，益生菌作為抗生素的替代物之一，具有綠色、安全、有效的優(yōu)點(diǎn)，拮抗病原菌的同時(shí)能夠調(diào)節(jié)腸道菌群、維持和修復(fù)腸道物理和化學(xué)屏障、提高機(jī)體免疫力等[9-10,19]。在本研究采集樣品的豬場中，根據(jù)臨床癥狀初步確定為產(chǎn)氣莢膜梭菌感染后，推薦豬場使用益生菌復(fù)合制劑，一段時(shí)間后，母豬整體的健康狀態(tài)得到改善，出現(xiàn)脹氣的母豬數(shù)量明顯減少。因此，在成功分離獲得產(chǎn)氣莢膜梭菌后，檢測了益生菌菌株的體外抑制效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，益生菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用具有種屬、菌株差異性[20]，其中，植物乳桿菌和動(dòng)物乳桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制效果具有廣譜性，植物乳桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌機(jī)制已有研究報(bào)道[21]。相比較于乳酸菌，芽孢桿菌環(huán)境耐受性更強(qiáng)，本研究篩選到1 株枯草芽孢桿菌，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出較好的抑菌效果，其抑菌機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。