基于UPLC指紋圖譜和化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地青蒿藥材質(zhì)量

呂渭升 ，李振雨 ，侯栩軒 ，楊小龍 ，盧曉瑩 ，孫冬梅， ，陳向東 ，鄧淙友

1.廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244；2.江西一方天江藥業(yè)有限公司，江西 南昌 330006

青蒿為菊科植物黃花蒿Artemisia annuaL.的干燥地上部分，始載于《五十二病方》[1]，具有清透虛熱、涼血除蒸、解暑、截瘧功效[2]。青蒿主要化學(xué)成分包括黃酮類、香豆素類、萜類、苯丙酸類及揮發(fā)油等，主要有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗心律失常等藥理作用[3-5]，臨床多用于治療瘧疾、登革熱、慢性氣管炎[6-7]。青蒿生于曠野、山坡、路邊、河岸等處，廣泛分布于我國(guó)南北各地，尤以河南、廣西、廣東、重慶等地區(qū)產(chǎn)量較為集中[8]。

指紋圖譜從整體上對(duì)中藥進(jìn)行研究，能夠較全面反映中藥所含的復(fù)雜成分及相互關(guān)系，是符合中藥特點(diǎn)的質(zhì)量控制模式之一。目前中藥指紋圖譜廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的各環(huán)節(jié)，包括產(chǎn)地加工、采收時(shí)間、炮制加工等。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，所獲得的色譜指紋圖譜越來(lái)越復(fù)雜，其通常包涵大量多維的信息和數(shù)據(jù)，導(dǎo)致有效提取指紋圖譜更加困難?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)將多種數(shù)據(jù)分析方法如主成分分析、聚類分析和回歸分析等相結(jié)合，對(duì)多維、龐大、分散的數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選和提取，發(fā)掘數(shù)據(jù)間的定性、定量關(guān)系，解讀數(shù)據(jù)中蘊(yùn)藏的意義，為全面深入控制中藥質(zhì)量提供了有力保障。目前，指紋圖譜與關(guān)鍵成分定量相結(jié)合的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法已成功應(yīng)用于多種中藥，包括厚樸[9]、天麻[10]、蒲公英[11]等，但有關(guān)青蒿的研究相對(duì)較少。本研究對(duì)15批不同產(chǎn)地的青蒿藥材建立其UPLC指紋圖譜，同時(shí)對(duì)3,5-O-二咖啡?；鼘幩岷蜄|莨菪內(nèi)酯進(jìn)行含量測(cè)定，在此基礎(chǔ)上結(jié)合聚類分析、主成分分析（PCA）等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地青蒿藥材質(zhì)量，為全面、客觀、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)青蒿藥材質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters H-Class超高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司），Scientific Q-Exactive Obitriap MS四極桿-靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛公司），ME204E萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多公司），XP26百萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多公司），JJ600百分之一天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠），KQ500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HWS28恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司），Milli-Q級(jí)超純水系統(tǒng)（德國(guó)默克股份有限公司）。

液相用甲醇、乙腈（默克股份有限公司），磷酸、甲酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）為色譜級(jí)，其余試劑為分析純。新綠原酸（批號(hào)wkq18030107，含量98%），四川省維克奇生物科技有限公司；隱綠原酸（批號(hào)905-99-7，含量98%）、1-咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)18033004，含量99.9%），成都普菲德生物科技有限公司；夏佛塔苷（批號(hào)51938-32-0，含量95.60%）、東莨菪內(nèi)酯（批號(hào)110768-200504，含量100%）、綠原酸（批號(hào)110753-201817，含量96.8%）、3,5-O-二咖啡?；鼘幩幔ㄅ?hào)111782-201706，含量97.3%），中國(guó)食品藥品檢定研究院；東莨菪堿（批號(hào)DST210115-056，含量98%，成都樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司）；3,4-O-二咖啡?；鼘幩峒柞ィㄅ?hào)CFN90856，含量98%，Chem Face）。15批青蒿藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定，為菊科植物黃花蒿Artemisia annuaL.的干燥地上部分，符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》青蒿藥材項(xiàng)下規(guī)定，藥材來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 15批青蒿藥材樣品來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.4%磷酸溶液（B），質(zhì)譜分析時(shí)B為0.4%甲酸溶液；梯度洗脫（0～5 min，12%～15%A；5～10 min，15%～20%A；10～12 min，20%A；12～15 min，20%～25%A；15～35 min，25%～38%A；35～55 min，38%～65%A）；流速0.25 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備

取綠原酸對(duì)照品、東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品適量，加30%甲醇制成每1 mL含綠原酸50 μg、東莨菪內(nèi)酯35 μg的混合溶液。

2.3 供試品溶液制備

取青蒿藥材粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用30%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取青蒿藥材（S10）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定指紋圖譜，以3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸色譜峰為參照峰S，計(jì)算各共有指紋峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD，均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的青蒿藥材（S10）粉末共6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，分別測(cè)定6份樣品指紋圖譜，以3,5-O-二咖啡?；鼘幩嵘V峰為參照峰S，計(jì)算各共有指紋峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取青蒿藥材（S10）供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣分析，測(cè)定指紋圖譜，以3,5-O-二咖啡?；鼘幩嵘V峰為參照峰S，計(jì)算各共有指紋峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜建立及共有峰標(biāo)定

取15批青蒿藥材樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備15份供試品溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各樣品指紋圖譜，并導(dǎo)出指紋圖譜CDF格式文件，將15批青蒿藥材指紋圖譜導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）軟件，以樣品S1的指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，進(jìn)行保留時(shí)間校正和全峰匹配，15批青蒿藥材指紋圖譜共標(biāo)識(shí)出22個(gè)共有指紋峰，以平均數(shù)法生成青蒿藥材對(duì)照指紋圖。15批青蒿藥材指紋圖譜疊加圖見(jiàn)圖1，青蒿藥材對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖2。

圖1 15批青蒿藥材UPLC指紋圖譜

圖2 青蒿藥材對(duì)照指紋圖譜

2.6 相似度評(píng)價(jià)

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）計(jì)算15批青蒿藥材指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度，結(jié)果見(jiàn)表2。15批樣品中有12批相似度均在0.9以上，相似度最高的3批為重慶產(chǎn)區(qū)樣品；其余3批樣品相似度低于0.9，分別為S8（廣西玉林）、S9（廣西玉林）和S15（河南駐馬店）。

表2 15批青蒿藥材指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

2.7 共有峰指認(rèn)

通過(guò)對(duì)照品液相色譜保留時(shí)間比對(duì)及質(zhì)譜精確分子量、碎片離子對(duì)比分析，對(duì)22個(gè)共有峰進(jìn)行指認(rèn)。質(zhì)譜條件：采用加熱電噴霧離子源（HESI），噴霧電壓3.24 kV，正、負(fù)離子模式，掃描范圍100～1 500 m/z，鞘氣流速35 Arb，輔助氣流速10 Arb，毛細(xì)管溫度350 ℃，輔助器加熱溫度350 ℃，一級(jí)掃描分辨率70 000 FWHM，二級(jí)掃描分辨率17 500 FWHM，二級(jí)碰撞能量40 eV；S-lens電壓50 V。青蒿藥材正、負(fù)離子模式下總離子流圖及320 nm色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 青蒿藥材色譜圖

采用Compound Discoverer 2.1質(zhì)譜分析軟件對(duì)目標(biāo)色譜峰的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行解析，確定目標(biāo)成分的精確分子量、質(zhì)量數(shù)偏差及加合物離子信息，通過(guò)與mzCloud標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)下碰撞能量為40 eV的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，共指認(rèn)出10個(gè)峰，分別為1-咖啡?？鼘幩幔ǚ?）、新綠原酸（峰2）、東莨菪堿（峰3）、綠原酸（峰4）、隱綠原酸（峰5）、3-O-阿魏?？崴幔ǚ?）、東莨菪內(nèi)酯（峰7）、夏佛塔苷（峰10）、3,5-O-二咖啡?；鼘幩幔ǚ?2）、3,4-O-二咖啡?；鼘幩峒柞ィǚ?5）10個(gè)成分，化合物信息見(jiàn)表3。

表3 青蒿藥材化合物質(zhì)譜指認(rèn)

2.8 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.8.1 線性關(guān)系考察

精密稱取3,5-O-二咖啡?；鼘幩釋?duì)照品17.513 mg，置20 mL量瓶中，加30%甲醇制成每1 mL含852.01 μg的對(duì)照品貯備液。精密量取上述對(duì)照品貯備液5、2、1、0.5、0.2、0.1 mL，分別置10 mL容量瓶中，加30%甲醇至刻度，制成每1 mL含3,5-O-二咖啡?；鼘幩?26.00、170.40、85.20、42.60、17.040、8.52 μg的對(duì)照品溶液。精密稱取東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品2.019 mg，置25 mL量瓶中，加30%甲醇制成每1 mL含80.76 μg的對(duì)照品貯備液。精密量取上述對(duì)照品貯備液，按倍比稀釋法，依次制成每1 mL含東莨菪內(nèi)酯40.38、20.19、10.10、5.05、2.53、1.27 μg的對(duì)照品溶液。分別取上述不同濃度對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的回歸方程為：Y=18 823.57X+8 248.59，R2=0.999 9，表明在8.52～852.01 μg/mL范圍內(nèi)，3,5-O-二咖啡?；鼘幩釢舛扰c峰面積線性關(guān)系良好。東莨菪內(nèi)酯的回歸方程為：Y=38 439.11X+16 476.81，R2=0.999 9，表明在2.53～80.76 μg/mL范圍內(nèi)，東莨菪內(nèi)酯濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.8.2 精密度試驗(yàn)

取青蒿藥材（S10）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和東莨菪內(nèi)酯的峰面積RSD分別為0.47%和1.25%，均小于3.0%，表明該方法精密度良好。

2.8.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取青蒿藥材（S10）供試品溶液，分別在2、4、8、10、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算3,5-O-二咖啡?；鼘幩岷蜄|莨菪內(nèi)酯的峰面積RSD分別為0.23%和1.41%，均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份青蒿藥材（S10）粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，平行6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法分別計(jì)算3,5-O-二咖啡?；鼘幩岷蜄|莨菪內(nèi)酯的含量為3.425 mg/g和0.620 ng/g，RSD分別為1.36%和2.10%，均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8.5 加樣回收率試驗(yàn)

取青蒿藥材（S10）粉末約0.25 g，精密稱定，平行3組，每組3份，按1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例加入對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備9份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果顯示，3,5-O-二咖啡?；鼘幩峄厥章蕿?5.52%，東莨菪內(nèi)酯回收率為96.15%。根據(jù)2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法學(xué)驗(yàn)證指導(dǎo)原則”規(guī)定，樣品中待測(cè)成分含量在0.1%～1%范圍時(shí)，回收率限度為92%～105%。表明2種成分回收率良好。

2.9 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.9.1 主成分分析

PCA通過(guò)數(shù)據(jù)降維，樣品分布散點(diǎn)圖能夠直觀呈現(xiàn)樣品之間的距離。以22個(gè)共有指紋峰的峰面積為變量，采用PCA對(duì)15批青蒿藥材進(jìn)行分析，通過(guò)SIMCA14.1軟件對(duì)歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析，建立PCA模型。結(jié)果顯示所有樣本均在95%置信區(qū)間內(nèi)，模型解釋率參數(shù)R2X=0.958，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2=0.561，表明提取的主成分可以解釋95.8%的原始變量，模型預(yù)測(cè)能力為56.1%。15批青蒿藥材樣品的PCA得分圖見(jiàn)圖4A，15批青蒿藥材主要分為兩類，重慶產(chǎn)地為一類，其他產(chǎn)地為一類。不同產(chǎn)地藥材差異較大，其中重慶3批藥材較為聚集，表明重慶產(chǎn)地藥材差異較小，河南產(chǎn)地6批藥材與廣東、廣西產(chǎn)地藥材較為聚集。PCA各特征峰變量載荷結(jié)果見(jiàn)圖4B，根據(jù)變量離原點(diǎn)的距離判斷變量對(duì)主成分的影響權(quán)重，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)表示變量對(duì)主成分的影響權(quán)重越大。可以看出，分析變量對(duì)主成分1的影響權(quán)重大小依次為峰12、峰11，變量對(duì)主成分2的影響權(quán)重大小依次為峰9、峰8、峰15，這5個(gè)特征峰是PCA中有效體現(xiàn)不同產(chǎn)地青蒿樣品差異的強(qiáng)特征峰。

圖4 不同產(chǎn)地青蒿PCA得分圖和變量載荷圖

2.9.2 正交偏最小二乘判別分析

正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）可以將原始數(shù)據(jù)的差異劃分為兩部分，一部分與Y變量相關(guān)，另一部分與Y不相關(guān)即正交垂直的差異。與PLS-DA相比，其能夠過(guò)濾掉更多的不相關(guān)信息，提高模型的預(yù)測(cè)能力及有效性。為進(jìn)一步尋找不同產(chǎn)地的差異代謝物，以15批青蒿藥材的22個(gè)共有指紋峰的峰面積為變量，使用OPLS-DA模型驗(yàn)證各組分離情況，R2Y和Q2分別代表模型可解釋的變量和可預(yù)測(cè)度，可對(duì)模型的優(yōu)劣進(jìn)行判別。模型R2X=0.996，R2Y=0.999，Q2=0.833。重慶產(chǎn)地和其他產(chǎn)地青蒿藥材OPLS-DA得分圖見(jiàn)圖5。可以看出，重慶產(chǎn)地與其他產(chǎn)地藥材顯著分離，表明二者差異較大。

圖5 不同產(chǎn)地青蒿藥材OPLS-DA模型得分圖

變量重要性投影（VIP）在OPLS-DA中用于評(píng)價(jià)變量對(duì)分類的貢獻(xiàn)程度，可根據(jù)VIP值確定潛在的生物標(biāo)志物，有助于發(fā)現(xiàn)具有識(shí)別能力的重要變量。一般將VIP>1和P<0.05作為差異代謝物。不同產(chǎn)地青蒿藥材VIP見(jiàn)圖6。VIP>1的代謝物共有10個(gè)，分別是峰11（VIP=1.42）、峰16（VIP=1.45）、峰4（VIP=1.25）、峰12（VIP=1.25）、峰6（VIP=1.24）、峰20（VIP=1.23）、峰22（VIP=1.20）、峰7（VIP=1.12）、峰3（VIP=1.09）、峰5（VIP=1.07）。

圖6 不同產(chǎn)地青蒿藥材VIP

2.9.3 2種差異代謝物含量測(cè)定

OPLS-DA確定的10個(gè)差異代謝物中，峰3、4、5、6、7、12經(jīng)質(zhì)譜指認(rèn)，可分為兩類：東莨菪內(nèi)酯和東莨菪堿屬于香豆素類成分，綠原酸、隱綠原酸、3-O-阿魏?？崴?、3,5-O-二咖啡?；鼘幩釋儆诒奖犷悺檫M(jìn)一步明確不同產(chǎn)地青蒿藥材質(zhì)量差異，選擇東莨菪內(nèi)酯和3,5-O-二咖啡?；鼘幩徇M(jìn)行含量測(cè)定。

取15批青蒿藥材粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，采用外標(biāo)法計(jì)算各批樣品東莨菪內(nèi)酯和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。15批青蒿藥材樣品東莨菪內(nèi)酯的含量為0.207～1.186 mg/g，均值為0.494 mg/g；3,5-O-二咖啡?；鼘幩岬暮繛?.028～5.875 mg/g，均值為3.19 mg/g。

表4 15批青蒿藥材東莨菪內(nèi)酯和3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷繙y(cè)定結(jié)果（mg/g）

不同產(chǎn)地青蒿藥材東莨菪內(nèi)酯和3,5-O-二咖啡?；鼘幩岷勘容^見(jiàn)圖7?？梢钥闯?，不同產(chǎn)地樣品2種成分含量差異較明顯，其中重慶產(chǎn)地樣品東莨菪內(nèi)酯和3,5-O-二咖啡?；鼘幩岷烤哂谄渌?個(gè)產(chǎn)地，河南產(chǎn)地樣品2種成分含量均較低。

圖7 不同產(chǎn)地青蒿藥材東莨菪內(nèi)酯和3,5-O-二咖啡?；鼘幩岷勘容^

3 討論

本研究對(duì)供試品溶液制備方法進(jìn)行了考察，包括提取溶劑、提取方式、提取時(shí)間及提取溶劑用量，最終確定樣品最佳前處理方法。提取溶劑分別考察了甲醇、70%甲醇、30%甲醇、10%甲醇、乙醇、水，結(jié)果顯示，不同提取溶劑對(duì)青蒿藥材特征峰影響較大，以70%甲醇和30%甲醇為提取溶劑時(shí)總峰面積/稱樣量較大，而30%甲醇的峰型及分離效果最佳，最終選擇30%甲醇為提取溶劑。試驗(yàn)比較了超聲與回流2種提取方式，結(jié)果顯示，2種提取方式各特征峰的峰型及分離效果無(wú)明顯差別，但加熱回流時(shí)總峰面積/稱樣量高于超聲處理，因此選擇加熱回流作為青蒿藥材特征圖譜的提取方式。此外，對(duì)3種不同超聲時(shí)間以及3種料液比進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，以總峰面積/稱樣量為指標(biāo)，不同提取時(shí)間對(duì)青蒿藥材特征圖譜影響并不大，為保證提取完全，選擇加熱回流60 min。提取溶劑用量為50 mL以上時(shí)，總峰面積/稱樣量×溶劑用量無(wú)明顯變化，說(shuō)明50 mL已提取完全，最終選擇50 mL為提取溶劑用量。

本研究基于指紋圖譜對(duì)4個(gè)產(chǎn)地15批青蒿藥材進(jìn)行分析，共確定了22個(gè)共有峰，進(jìn)一步基于UPLC-MS技術(shù)對(duì)其中峰形好、分離度大的部分指紋峰進(jìn)行指認(rèn)，共指認(rèn)了10種化合物，主要包括1-咖啡?？鼘幩?、新綠原酸、東莨菪堿、綠原酸、隱綠原酸、3-O-阿魏?？崴岬?。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)一步分析可知，12批藥材的相似度>0.9，表明所建立的指紋圖譜有效可行，基于UPLC技術(shù)建立的青蒿指紋圖譜能夠相對(duì)全面地表征青蒿藥材中的化學(xué)成分，同時(shí)能有效區(qū)分和評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地青蒿藥材。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的青蒿藥材質(zhì)量存在一定差異，其中3批重慶產(chǎn)區(qū)樣品整體相似度較高。

為進(jìn)一步探究不同產(chǎn)地青蒿藥材成分差異，采用PCA及OPLS-DA對(duì)15批青蒿藥材進(jìn)行分析。PCA結(jié)果顯示，15批青蒿藥材差異較大，主要分為兩類，其中重慶產(chǎn)地為一類，其余產(chǎn)地為一類，表明重慶產(chǎn)地青蒿藥材與其他產(chǎn)地質(zhì)量差異較大。

通過(guò)OPLS-DA確定了10種差異代謝物，為進(jìn)一步探討不同產(chǎn)地青蒿藥材質(zhì)量差異，在指紋圖譜基礎(chǔ)上增加對(duì)香豆素類和苯丙酸類成分含量測(cè)定。東莨菪內(nèi)酯為香豆素類成分，具有抗菌消炎、祛痰止咳作用，對(duì)正常動(dòng)物體溫及大腸桿菌內(nèi)毒素致熱動(dòng)物體溫有顯著的降低作用[12]，具有較強(qiáng)的水溶性和穩(wěn)定性[13]，能夠反映青蒿發(fā)揮傳統(tǒng)功效“清熱解暑、除蒸”的藥理活性，被視為青蒿的有效成分之一。藥理研究表明，東莨菪內(nèi)酯在抗炎、抗腫瘤、降壓等方面有很好的療效[14]?？Х弱？鼘幩犷惢衔锸侵参矬w內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗菌消炎、抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)血糖、血脂、血壓及保肝等多種生物活性[15]。對(duì)咖啡酰奎寧酸類成分進(jìn)行藥理活性比較發(fā)現(xiàn)，綜合抗氧化活性，抗炎活性，抗菌、抗病毒作用，細(xì)胞保護(hù)作用，免疫調(diào)節(jié)作用，抗高血糖、高血脂作用，抗癌活性7個(gè)方面，3,5-O-二咖啡?；鼘幩崦黠@優(yōu)于其他3個(gè)苯丙酸成分[16]，測(cè)定其含量代表苯丙酸類成分含量，具有一定的參考意義。3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸為有機(jī)酸類成分，有報(bào)道咖啡酰奎尼酸衍生物具有抗炎、抗氧化、抗病毒等活性，可協(xié)同東莨菪內(nèi)酯發(fā)揮抗風(fēng)濕作用[17-18]。因此，選擇東莨菪內(nèi)酯和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明，重慶產(chǎn)地青蒿藥材2種差異代謝物的含量均高于其他3個(gè)產(chǎn)地，初步表明東莨菪內(nèi)酯和3,5-O-二咖啡?；鼘幩峥赡茏鳛閰^(qū)分重慶產(chǎn)地和其他產(chǎn)地的生物標(biāo)志物。但從產(chǎn)地質(zhì)量精準(zhǔn)性評(píng)價(jià)角度而言，需要擴(kuò)大種質(zhì)資源，增加不同采收期的比較分析來(lái)進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究建立的指紋圖譜能有效區(qū)分不同產(chǎn)地青蒿藥材，建立的東莨菪內(nèi)酯和3,5-O-二咖啡?；鼘幩岬暮繙y(cè)定方法豐富了青蒿中除青蒿素、山柰素外其他有效成分研究的內(nèi)容。然而，本研究?jī)H初步探究了不同產(chǎn)地青蒿藥材的差異性，今后將結(jié)合非靶向代謝組學(xué)和靶向代謝組學(xué)對(duì)青蒿整體代謝物進(jìn)行研究，同時(shí)結(jié)合基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等多組學(xué)平臺(tái)探究不同產(chǎn)地青蒿藥材質(zhì)量差異的機(jī)制。