基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的黃楊堿抑制腎癌細(xì)胞的作用機制及實驗驗證研究

馬旭東，楊進(jìn)，陳林，吳波，李嘉，王威威，梁國標(biāo)

1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 563000；

2.成都大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，四川 成都 610081；

3.郫都區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科，四川 成都 611730

腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見和最具風(fēng)險的腫瘤之一，約占全世界所有確診癌癥數(shù)的5%[1]，主要發(fā)生在男性中[2]。并且在未來幾年中，腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)的發(fā)病率和死亡率仍將繼續(xù)攀升，至2040年全球腎癌死亡人數(shù)估計高達(dá)30多萬[2]。腎細(xì)胞癌可以被分為不同的分子和組織學(xué)亞型[3]，透明細(xì)胞癌、乳頭狀腎細(xì)胞癌和嫌色細(xì)胞癌是腎細(xì)胞癌中最常見的亞型(≥90%)，而剩余的亞型≤10%。重要的是，每種亞型在預(yù)后和治療方面都具有特異性[4]。由于缺乏早期癥狀，大量腎細(xì)胞癌患者在發(fā)現(xiàn)時已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)治療困難。因此，藥物治療對于大多數(shù)腎細(xì)胞癌患者非常重要。

近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和國內(nèi)外研究者的不斷努力，不斷涌現(xiàn)出許多有潛力治療腎細(xì)胞癌的新療法，例如針對哺乳動物雷帕霉素靶點(mTOR)和蛋白酪氨酸激酶(RTK)信號的靶向治療[5]。最近，基于免疫治療的新策略也被開發(fā)出來，旨在針對癌癥免疫細(xì)胞之間的相互作用(免疫檢查點抑制劑)，這種方案在RCC治療中取得了一些成功[6]。雖然使用免疫治療的患者生存率明顯高于單獨化療，但總體預(yù)后仍較差。因此，醫(yī)學(xué)界迫切需要找到一種新的、有效的抗腎細(xì)胞癌的藥物。

有證據(jù)表明，一些天然產(chǎn)物有確切的治療作用，如抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、促進(jìn)線粒體損傷、促進(jìn)氧化應(yīng)激等[7-8]。黃楊堿(cyclovirobuxine D，CVB-D)是一種生物堿，來源于中國黃楊和其他同屬植物。已發(fā)表的研究表明，CVB-D能通過CTHRC1-AKT/ERK-Snail信號通路抑制結(jié)直腸癌的發(fā)展[9]。此外，CVB-D在胃癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞中都有一定的抑制作用[10-11]。目前CVB-D的抗癌作用和詳細(xì)機制較為復(fù)雜，而CVB-D對腎癌的具體作用及機制尚不明確，故本研究希望進(jìn)一步探索CVB-D對腎癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與生物信息學(xué)分析

1.1.1 CVB-D的預(yù)測靶點從PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)數(shù)據(jù)庫篩選CVB-D的潛在治療靶點。基因符號名稱在UniprotKB數(shù)據(jù)庫(https://www.UniProt.org/)中手動規(guī)范化。

1.1.2 腎癌的潛在靶基因腎癌相關(guān)的靶基因來自DisGeNET(https://www.disgenet.org/)。搜索策略:設(shè)置關(guān)鍵字為“renal cell carcinoma”，物種確定為智人。

1.1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為了闡明黃楊堿藥物作用靶點與腎癌靶點之間的相互作用，使用Venny 2.1.0在線軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)獲得交集基因并繪制Venn圖。然后將交集靶點基因提交到STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://STRING-db.org)，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)模型，將生物物種設(shè)置為智人(Homo sapiens)，最小相互作用閾值設(shè)置為中置信度(＞0.4)。通過CytoScape(3.7.2)調(diào)整并作圖，再使用CytoHubba插件進(jìn)一步分析網(wǎng)絡(luò)中的Hub基因。

1.1.4 富集分析使用基因本體論(GO)分析和京都百科全書(KEGG)通路富集分析來探索交集基因的生物學(xué)途徑和潛在的功能。將交集靶點基因分別輸入到DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)和KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/)，限定物種為人，設(shè)置P＜0.05，分析主要的生物過程和代謝途徑，并進(jìn)行富集分析，保存結(jié)果，并使用微生信(https://www.bioinformatics.com.cn)在線工具將數(shù)據(jù)可視化。

1.1.5 核心靶點基因生物信息學(xué)分析從癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)集(https://portal.gdc.com)獲得腎透明細(xì)胞癌的RNAseq數(shù)據(jù)(level3)和相應(yīng)的臨床信息。GTEx數(shù)據(jù)來自V8版本(https://gtexportal.org/home/datasets)。使用R軟件v4.0.3進(jìn)行統(tǒng)計分析。P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。并利用基因表達(dá)分析交互分析數(shù)據(jù)集(GEPIA,http://gepia.cancer-pku)進(jìn)一步分析腎透明細(xì)胞癌患者總生存期(OS)與核心基因表達(dá)水平的相關(guān)性(P＜0.05，其他選項設(shè)置為默認(rèn)值)。

1.2 實驗驗證

1.2.1 實驗材料和試劑人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系786-O、Caki-1皮膚轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞均購自中科院細(xì)胞庫，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)，胰蛋白酶(Biosharp)，胎牛血清(Gibco)，黃楊堿試劑(Med Chem Express)，CCK-8試劑盒和BCA試劑盒(ThermoFisher)，EGFR抗體(ABclonal)、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K抗體(華安生物)、β-actin抗體(ABclonal)、鼠兔IgG二抗(華安生物)。

“食品安全學(xué)”是學(xué)院食品質(zhì)量與安全專業(yè)重要的專業(yè)核心課程，同時也是學(xué)校設(shè)立的大學(xué)公共選修課，該課程具有綜合性、實踐性和應(yīng)用性等特點，課程內(nèi)容理論性較強，與多個學(xué)科存在交叉，細(xì)小知識點較多，因此作為公選課要讓其他專業(yè)的學(xué)生學(xué)習(xí)好該課程，教學(xué)方式的選擇是教學(xué)效果達(dá)成的重要因素。近年來，“互聯(lián)網(wǎng)+”在各行各業(yè)反響強烈，充分利用互聯(lián)網(wǎng)優(yōu)勢，把互聯(lián)網(wǎng)的創(chuàng)新成果融合到社會的各個領(lǐng)域，其中，“互聯(lián)網(wǎng)+教育”是在尊重教育本質(zhì)特性的基礎(chǔ)上，利用互聯(lián)網(wǎng)重塑教學(xué)方法，備受各界專注[1]。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)786-O和Caki-1細(xì)胞在添加10%胎牛血清，100 U/mL青霉素-鏈霉素混合抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞均放置在37℃，5%CO2濕化培養(yǎng)箱中。

1.2.3 CCK-8增殖實驗將腎癌細(xì)胞系Caki-1和786-O以2×104細(xì)胞/mL的密度接種在96孔板(每孔100μL培養(yǎng)基)中。接種24 h后，用無水乙醇(對照組)和黃楊堿[20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、140μmol/L]分別處理腎癌細(xì)胞，每個濃度包括5個重復(fù)。24 h后吸去96孔板中培養(yǎng)基，并在每孔中加入混有10μL CCK-8試劑的100μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育4 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下讀取吸光度，測量細(xì)胞增殖和活力，以上實驗重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞克隆形成實驗用6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每孔接種1 000個細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后，藥物干預(yù)24 h；然后，將細(xì)胞置于正常培養(yǎng)基中10 d。移去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞兩次。加入通用組織固定劑15 min后取出。加入結(jié)晶紫染色液染色10～20 min，沖去染色劑，晾干后用手機拍照。計算細(xì)胞克隆的數(shù)量。

1.2.5 倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化取對數(shù)生長期786-O和Caki-1細(xì)胞，接種于6孔板內(nèi)，貼壁培養(yǎng)24 h后，用黃楊堿30μmol/L、60μmol/L個濃度給藥，并設(shè)空白對照組，于24 h后使用倒置熒光顯微鏡觀察786-O和Caki-1細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)測凋亡按說明書測定細(xì)胞凋亡率。在60 mm培養(yǎng)皿中添加約2×105個細(xì)胞，并用黃楊堿(0μmol/L、30μmol/L、60μmol/L)不同濃度進(jìn)行處理。處理24 h后，收集細(xì)胞，在300μL結(jié)合緩沖液中重懸，在4℃黑暗中用PI和Annexin V-FITC染色約30 min。結(jié)果用流式細(xì)胞儀分析。

1.2.7 Western blot檢測通路靶點蛋白質(zhì)表達(dá)采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測EGFR、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)。取對數(shù)生長期786-O、Caki-1細(xì)胞，以5×105個，2 mL完全培養(yǎng)基接種6孔板，貼壁培養(yǎng)24 h后棄去每孔中舊培養(yǎng)基，分別用黃楊堿(30μmol/L、60μmol/L)兩個濃度給藥，并設(shè)空白對照組，收集各組干預(yù)24 h后的細(xì)胞提取總蛋白，并用BCA法測定各組蛋白濃度，經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，孵育對應(yīng)的一抗(1∶1 000)和二抗(1∶20 000)，顯影后用Image J軟件分析，并用目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法所有驗證實驗均至少進(jìn)行3次，實驗的計量數(shù)據(jù)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，所有的統(tǒng)計學(xué)分析都使用Graphpad Prism V9軟件進(jìn)行。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃楊堿和腎細(xì)胞癌的靶向基因本研究從Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫中獲得黃楊堿136個治療靶點。從DisGeNET數(shù)據(jù)庫收集的腎細(xì)胞癌靶點數(shù)量為2 084個。

2.2 構(gòu)建PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與分析黃楊堿和腎細(xì)胞癌的靶點通過Venny 2.1.0取交集，獲得68個CVB-D治療腎細(xì)胞癌的預(yù)測靶點(圖1A)。PPI網(wǎng)絡(luò)由STRING v11.0構(gòu)建，并用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化(圖1B)。該PPI網(wǎng)絡(luò)包括68個節(jié)點和465條邊，平均節(jié)點度13.7。圓形節(jié)點代表每個蛋白質(zhì)，節(jié)點大小越大，度值越高。節(jié)點之間的直線表示兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用。線越粗，相互作用越強。Hub基因由cytoHubba插件計算。利用MCC、Degree方法計算出前10個Hub基因(圖1C、1D)，并將結(jié)果進(jìn)行交集得到5個核心靶點基因為：ALB、IGF1、AKT1、EGFR、SRC。

圖1 黃楊堿與腎細(xì)胞癌的交叉靶點分析Figure 1 Analysis of the intersection targets of CVB-D and RCC

2.3 GO和KEGG通路富集分析為了探究黃楊堿和腎細(xì)胞癌交集基因的生物學(xué)功能，本研究進(jìn)行了兩種富集分析：(A)GO富集分析和(B)KEGG富集分析。黃楊堿主要參與的生物學(xué)過程包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過程的正向調(diào)控、細(xì)胞周期的正向調(diào)控等(圖2A)。分子功能主要集中在蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、鋅離子結(jié)合等方面(圖2A)。所涉及的主要通路有:癌癥通路、PI3K-AKT通路、前列腺癌、癌癥中蛋白聚糖、MAPK信號通路等(圖2B)。

圖2 黃楊堿與腎細(xì)胞癌交集靶基因的富集分析Figure 2 Enrichment analysis of target genes at the intersection of CVB-D and RCC

2.4 核心靶點表達(dá)與RCC的相關(guān)性分析在腎細(xì)胞癌中對ALB、IGF1、AKT1、EGFR、SRC這5個核心靶點進(jìn)行表達(dá)差異篩選和生存分析篩選，結(jié)果顯示5個核心靶點中EGFR在腎癌組織中表達(dá)增高最為顯著(圖3A)。生存分析篩選得出高表達(dá)AKT1與腎細(xì)胞癌患者生存時間密切相關(guān)(圖3B)。故推測EGFR可能與黃楊堿治療腎細(xì)胞癌的作用密切相關(guān)。

圖3 核心靶點的差異表達(dá)和預(yù)后分析Figure 3 Differential expression and prognostic analysis of Hub genes

2.5 黃楊堿對腎細(xì)胞癌786-O、Caki-1細(xì)胞活性及增殖的影響通過細(xì)胞活力測定評價黃楊堿對786-O和Caki-1細(xì)胞的毒性作用。與對照組相比，用黃楊堿(0、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、140μmol/L)處理后腎癌細(xì)胞存活率顯著降低，且呈濃度依賴性(圖4A，786-O 24 h IC50：51.51μmol/L；Caki-1 24 h IC50：42.19μmol/L)。且黃楊堿能明顯抑制腎癌細(xì)胞的集落形成(圖4B)，說明黃楊堿具有明顯抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞的作用。

圖4 黃楊堿對腎癌細(xì)胞的抑制作用Figure 4 Inhibitory effect of CVB-D on RCC

2.6 黃楊堿對786-O和Caki-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響在顯微鏡下可觀察到，空白對照組腎癌細(xì)胞786-O、Caki-1正常增殖，形態(tài)飽滿，細(xì)胞間連接緊密。黃楊堿30μmol/L、60μmol/L組可見細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞皺縮且變得圓滑，懸浮細(xì)胞數(shù)量明顯增多。提示黃楊堿對腎癌細(xì)胞有抑制作用，如圖5所示。

圖5 光鏡下觀察黃楊堿作用前后細(xì)胞形態(tài)的變化Figure 5 Morphological changes of cells observed under light microscope before and after treatment with CVB-D

2.7 黃楊堿能誘導(dǎo)786-O、Caki-1細(xì)胞凋亡根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)黃楊堿可能參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制腎癌細(xì)胞增殖。因此，本探究采用流式細(xì)胞術(shù)探究黃楊堿對腎癌細(xì)胞凋亡的影響。黃楊堿處理后786-O和Caki-1細(xì)胞早期和晚期凋亡增加(圖6A)，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果一致。此外，還研究了Bax/Bcl-2的表達(dá)，因為它們在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。Western blot結(jié)果顯示黃楊堿處理腎癌細(xì)胞后，抗凋亡的Bcl-2表達(dá)降低，促凋亡的Bax表達(dá)增加(圖6B)，表明黃楊堿能促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡。

圖6 黃楊堿對786-O和Caki-1細(xì)胞凋亡的影響Figure 6 Effect of CVB-D on apoptosis of 786-O and Caki-1 cells

2.8 黃楊堿能抑制腎透明細(xì)胞癌中EGFR、p-PI3K、p-AKT的表達(dá)黃楊堿作用786-O和Caki-1細(xì)胞24 h后，與空白對照組比較，CVB-D處理組腎癌細(xì)胞的EGFR、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(圖7)，提示黃楊堿對EGFR、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)具有抑制作用。

圖7 Western blot檢測黃楊堿處理786-O和Caki-1細(xì)胞后EGFR、p-PI3K、p-AKT的表達(dá)Figure 7 Expression of EGFR,P-PI3K,and P-Akt in 786-O and Caki-1 cells treated with CVB-D detected by Western blot

3 討論

腎細(xì)胞癌是最常見的癌癥之一，通過手術(shù)治療，局限性腎細(xì)胞癌預(yù)后較好，但實際臨床工作中大多數(shù)患者在診斷時已是轉(zhuǎn)移性腎癌。轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌治療難度大，主要原因是耐藥、反應(yīng)率低、預(yù)后差[5]，常規(guī)臨床治療效果不理想。因此，迫切需要找到新的治療方法和藥物。

黃楊堿具有多種生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤等。黃楊堿對多種癌癥都有抑制作用，包括結(jié)直腸癌[9]、胃癌[10]、乳腺癌[11]、肺癌[13]等。雖然許多研究都提出黃楊堿的抗腫瘤活性，但黃楊堿在腎細(xì)胞癌中的詳細(xì)機制尚未完全闡明。在本研究中，通過預(yù)測黃楊堿治療腎癌潛在靶點得到68個靶基因?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理分析構(gòu)建腎細(xì)胞癌與黃楊堿之間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，獲得核心靶點基因ALB、IGF1、AKT1、EGFR、SRC。生信分析結(jié)果顯示，EGFR在腎癌組織中高表達(dá)，ALB、IGF1、AKT1在腎癌組織中低表達(dá)；生存分析顯示AKT1低表達(dá)的患者總生存期較高表達(dá)患者短。這表明ALB、IGF1、AKT1、EGFR、SRC參與多種腫瘤發(fā)展和信號通路，也表明黃楊堿可能是通過作用于以上靶點從而對腎細(xì)胞癌發(fā)揮直接或者間接的調(diào)控作用。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是ErbB家族酪氨酸受體激酶的成員之一，在促進(jìn)細(xì)胞增殖、對抗細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要作用[14-15]。EGFR的擴增和突變已被證明是許多癌癥的驅(qū)動因素，如非小細(xì)胞肺癌[16]、腎癌[17]和基底樣乳腺癌[18]等。例如，Smith等[19]發(fā)現(xiàn)EGFR可能是hif-2α依賴性腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵決定因素，也是VHL腎癌治療的可靠靶點。有報道稱，下調(diào)EGFR可促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞的增殖[20]，且本研究中生物信息學(xué)分析表明EGFR在腎細(xì)胞癌中高表達(dá)，故推測黃楊堿可能通過調(diào)控EGFR靶點對腎癌細(xì)胞起抑制作用。

本研究首次利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)，具體分析了黃楊堿治療腎細(xì)胞癌的分子機制。GO和KEGG富集分析表明黃楊堿治療腎透明細(xì)胞癌的關(guān)鍵靶點主要涉及凋亡、增殖、自身磷酸化、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程和PI3K-AKT、MAPK、Rap1等信號通路。通過上述分析提示黃楊堿可能通過EGFR-PI3K-AKT通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在腎細(xì)胞癌中發(fā)揮作用。體外實驗進(jìn)一步證實黃楊堿的確能抑制786-O和Caki-1細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且呈濃度依賴性，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果一致。此外，實驗發(fā)現(xiàn)黃楊堿處理后腎癌細(xì)胞系786-O和Caki-1中EGFR的表達(dá)降低且磷酸化PI3K、AKT表達(dá)降低。因此，本研究推測黃楊堿可能通過調(diào)控EGFR的表達(dá)抑制PI3K-AKT的磷酸化誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡從而抑制腎癌細(xì)胞。當(dāng)然EGFR具體通過什么機制調(diào)控PI3K-AKT通路還需要后續(xù)研究進(jìn)一步驗證。

綜上，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)分析和體外實驗驗證，對黃楊堿治療腎細(xì)胞癌的作用及機制進(jìn)行預(yù)測和驗證，表明黃楊堿可能通過多靶點、多途徑調(diào)控腎細(xì)胞癌的進(jìn)展。本研究，首次證實黃楊堿可能通過抑制EGFR-PI3K-AKT通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡，在腎細(xì)胞癌中發(fā)揮重要作用，為未來腎細(xì)胞癌的進(jìn)一步研究提供新的思路。