PPARα保護(hù)小鼠胃黏膜免于乙醇誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的作用研究

胡 曉,郭 然,張旭光

胡曉,河北醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室 河北省石家莊市 050017

郭然,河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院普外三科 河北省石家莊市 050004

張旭光,日本信州大學(xué)醫(yī)學(xué)部代謝調(diào)控學(xué)研究室 日本長(zhǎng)野縣松本市 390-0803

0 引言

飲酒行為在當(dāng)今社會(huì)是普遍現(xiàn)象,但流行病學(xué)研究結(jié)果指出,長(zhǎng)期飲酒會(huì)導(dǎo)致胃黏膜慢性損傷,引起胃潰瘍等胃部疾病.在已知的發(fā)病機(jī)制中,長(zhǎng)期攝入酒精可破壞胃黏膜的防御能力,誘導(dǎo)胃內(nèi)活性氧產(chǎn)生增多,引起胃黏膜的氧化應(yīng)激損傷[1,2].目前,治療酒精性胃黏膜損傷的藥物主要是胃酸抑制劑,但長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)引起藥物性肝損傷、腸道菌群失調(diào)等不良反應(yīng)[3,4].因此,探尋對(duì)胃黏膜發(fā)揮保護(hù)作用的生物活性物質(zhì)具有重要的意義.

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptor α,PPARα)是核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一,其活化后可以調(diào)控多種核內(nèi)靶基因的表達(dá),具有促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化、調(diào)控脂質(zhì)代謝、抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng)[5-7].PPARα在胃黏膜內(nèi)也有廣泛表達(dá),但其在胃黏膜損傷相關(guān)疾病中發(fā)揮何種效應(yīng)至今還未見(jiàn)報(bào)道.本研究采用sv129品系的野生型和PPARα基因敲除小鼠,長(zhǎng)期投喂含4%乙醇的Lieber-DeCarli液體飼料,并選擇其中一組聯(lián)合應(yīng)用維生素E投喂PPARα敲除小鼠作為抗氧化效應(yīng)對(duì)照,檢測(cè)小鼠胃黏膜的表型變化,探究PPARα缺失是否會(huì)引起更嚴(yán)重的胃黏膜損傷,應(yīng)用抗氧化劑能否減輕損傷的程度,以期闡明PPARα對(duì)乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷是否具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制是否與改善胃內(nèi)氧化應(yīng)激水平有關(guān).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物分組、造模: 6 wk齡野生型小鼠(n=6)和課題組前期使用的PPARα敲除型小鼠(n=14)均維持在Sv129品系[5],PPARα敲除型小鼠整體缺乏PPARα蛋白的表達(dá),但生長(zhǎng)過(guò)程中未見(jiàn)其他器官的功能和形態(tài)異常,并且成熟后具有生育功能.小鼠隨機(jī)分為3組,分別為野生型單純乙醇飲食(wild-type with ethanol diet,WTEtOH)組、PPARα敲除型單純乙醇飲食(PPARα-knockout with ethanol diet,KO-EtOH)組、PPARα敲除型乙醇飲食聯(lián)合維生素E(PPARα-knockout with ethanol diet combined vitamin E,KO-EtOH+VE)組.WT-EtOH組和KO-EtOH組給予含4%乙醇的Lieber-DeCarli液體飼料;KO-EtOH+VE組則給予額外添加了維生素E(40 mg/kg)[8]的含4%乙醇Lieber-DeCarli液體飼料.對(duì)于小鼠的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)方式遵循美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》,經(jīng)日本信州大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)方針研究委員會(huì)批準(zhǔn).小鼠自由攝食,飼養(yǎng)期間各組小鼠無(wú)其他疾病和死亡情況.飼養(yǎng)16 wk后,麻醉并處死小鼠,打開(kāi)腹腔,摘除胃臟.

1.1.2 材料與試劑: Lieber-DeCarli液體飼料購(gòu)自于日本東方酵母工業(yè)株式會(huì)社;維生素E購(gòu)自于日本Alfresa株式會(huì)社;還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)含量檢測(cè)試劑盒和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測(cè)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)比色法定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于美國(guó)OxisResearch公司;總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒和RT-PCR(SYBR Green)Pre-Mix試劑購(gòu)自于日本Takara(寶)生物株式會(huì)社;4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)抗體購(gòu)自于英國(guó)Abcam公司.

1.2 方法

1.2.1 胃組織病理學(xué)檢測(cè): 將小鼠胃組織轉(zhuǎn)移至5%多聚甲醛溶液固定24 h后,流水沖洗,使用梯度乙醇脫水.二甲苯透明處理后浸蠟包埋,制作石蠟切片.采用常規(guī)HE染色,經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟、下降梯度乙醇水化、蘇木素和伊紅染色、上升梯度乙醇脫水、二甲苯透明,最后使用中性膠封片,制成病理切片.在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠的胃組織形態(tài)學(xué)病理變化.

1.2.2 生化法檢測(cè)血清中GSH、GSSG、MDA的含量:采用腹主動(dòng)脈取血法,收集小鼠血液樣本1.5 mL/只,在4 ℃、3000 r/min離心15 min,取上清液.按照制造商的試劑盒說(shuō)明嚴(yán)格操作,使用生化試劑盒測(cè)定血清中GSH、GSSG和MDA的含量.GSH、GSSG和MDA在血清中的含量表示為μmol/L.

1.2.3 生化法檢測(cè)胃組織中MDA、GSH、GSSG的含量和SOD、CAT的活性: 取小鼠胃組織稱(chēng)重,按質(zhì)量(g):體積(mL)=1:9加入預(yù)冷生理鹽水,機(jī)械勻漿后,3500 r/min離心15 min,吸取上清液制備成組織勻漿.根據(jù)制造商的試劑盒說(shuō)明嚴(yán)格操作,測(cè)定胃組織勻漿中MDA、GSH、GSSG的含量以及SOD、CAT的活性水平.GSH和GSSG在胃組織中的含量表示為μmol/g,MDA在胃組織中的含量表示為nmol/g,SOD和CAT在胃組織中的水平表示為U/g.

1.2.4 免疫組化法檢測(cè)胃組織中4-HNE的水平: 采用免疫組織化學(xué)染色法分析胃組織中4-HNE的表達(dá).制成的石蠟切片脫蠟水化,使用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù),在過(guò)氧化氫中室溫孵育15 min,胎牛血清中37 ℃封閉20 min.加入鼠源4-HNE抗體,4 ℃孵育過(guò)夜.經(jīng)PBS洗滌3次,加入生物素化的山羊抗鼠二抗,37 ℃孵育1 h.經(jīng)PBS洗滌3次,加入HPR標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液,37 ℃孵育20 min.經(jīng)PBS洗滌3次,DAB顯色,在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果.

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)胃組織內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá): 取小鼠胃組織在液氮條件下研磨成組織勻漿.采用TRIzol法提取組織勻漿內(nèi)總RNA,并測(cè)定RNA濃度和純度.按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)合成cDNA.實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)嚴(yán)格按照SYBR Green PCR試劑說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系,充分混勻放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,擴(kuò)增條件為: 95 ℃變性15秒,60 ℃退火/延伸30秒,延伸階段采取熒光值,于40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析.采用軟件自動(dòng)計(jì)算實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量表達(dá)的Ct值和閾值,GADPH作為內(nèi)參基因,采用2-△△Ct法分析各個(gè)檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量.引物序列如表1所示.

表1 PCR引物列表

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以mean±SE表示.所得數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,采用具有Bonferroni校正或Student’sttest檢驗(yàn)的one-way ANOVA進(jìn)行分析,以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 PPARα缺失加重乙醇飲食組小鼠胃黏膜的損傷程度 胃組織形態(tài)學(xué)改變?nèi)鐖D1所示,WT-EtOH組小鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)較清晰,腺體排列稍欠規(guī)則整齊,上皮細(xì)胞有輕微破損、脫落,固有層和黏膜肌層偶爾可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);而KO-EtOH組小鼠的胃黏膜和腺體結(jié)構(gòu)明顯損傷,固有層和黏膜肌層內(nèi)可見(jiàn)出血、變性壞死,并有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生,黏膜下層明顯水腫;KOEtOH+VE組小鼠的胃黏膜情況有所改善,結(jié)構(gòu)尚清晰,腺體排列尚規(guī)整但間隙稍有增寬,可見(jiàn)輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn),較為接近WT-EtOH組.

圖1 小鼠胃組織病理學(xué)改變. WT-EtOH組小鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)較清晰,固有層和黏膜肌層偶爾可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);KO-EtOH組小鼠的腺體結(jié)構(gòu)紊亂,固有層和黏膜肌層可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生,黏膜下層明顯水腫;KO-EtOH+VE組小鼠的胃腺體排列尚規(guī)整但間隙稍有增寬,固有層和黏膜肌層可見(jiàn)輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn),較為接近WT-EtOH組.WT-EtOH: 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;KO-EtOH: 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠;KO-EtOH +VE: 乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.

2.2 PPARα缺失影響乙醇飲食組小鼠血清和胃組織內(nèi)GSH和GSSG的水平 小鼠的血清和胃組織中GSH及GSSG的含量變化如圖2所示,KO-EtOH組在血清(圖2A)和胃組織(圖2B)中的GSH含量和GSH/GSSG比值均顯著低于WT-EtOH組(P＜0.01;P＜0.05);而相較于KO-EtOH組,KO-EtOH+VE組的血清GSH含量顯著上升(P＜0.05),血清GSH/GSSG比值也有上升趨勢(shì)(P=0.053).

圖2 小鼠血清和胃組織的GSH、GSSG的含量變化. A: 各組小鼠血清中的GSH、GSSG的含量變化及兩者的比值.aP＜0.01,cP＜0.05,乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;bP＜0.05,乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組;B: 各組小鼠胃組織中的GSH、GSSG的含量變化及兩者的比值.dP＜0.05,乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組.GSH: 還原性谷胱甘肽;GSSG: 氧化型谷胱甘肽;WT: 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;KO: 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組;KO+VE: 乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.

2.3 PPARα缺失引起乙醇飲食組小鼠血清和胃組織內(nèi)MDA的含量增多 小鼠血清和胃組織中的MDA含量變化如圖3所示,與WT-EtOH組相比,KO-EtOH組血清和胃組織中的MDA含量均顯著增多(P＜0.01;P＜0.05);而相較于KO-EtOH組,KO-EtOH+VE組的血清和胃組織中MDA含量均得到顯著降低的改善(P＜0.05).

圖3 小鼠血清和胃組織MDA的含量變化. aP＜0.01,cP＜0.05,乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;bP＜0.05,乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.MDA: 丙二醛;WT: 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;KO: 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組;KO+VE: 乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.

2.4 PPARα缺失導(dǎo)致乙醇飲食組小鼠胃黏膜4-HNE的陽(yáng)性表達(dá)上升 如圖4所示,相較于WT-EtOH組,KOEtOH組小鼠胃黏膜內(nèi)可見(jiàn)大片的褐色著色區(qū)域,提示在胃組織內(nèi)4-HNE陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞明顯增多;而KOEtOH+VE組內(nèi)未見(jiàn)明顯的陽(yáng)性著色區(qū)域.

圖4 小鼠胃組織4-HNE的表達(dá)情況.KO-EtOH組的胃組織內(nèi)可見(jiàn)大量4-HNE陽(yáng)性細(xì)胞(左側(cè)箭頭和虛線(xiàn)所示區(qū)域,右側(cè)三角箭頭所示區(qū)域).4-HNE: 4-羥基壬烯醛;WT-EtOH: 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;KO-EtOH: 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠;KO-EtOH+VE:乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.

2.5 PPARα缺失引起乙醇飲食組小鼠胃組織內(nèi)SOD和CAT的活性降低 小鼠胃組織內(nèi)的SOD和CAT的活性表達(dá)變化如圖5所示,與WT-EtOH組相比,KO-EtOH組胃組織中SOD的活性顯著降低(P＜0.01),CAT活性亦有降低趨勢(shì)(P=0.055);而相較KO-EtOH組,KO-EtOH+VE組小鼠胃組織中CAT的活性顯著提高(P＜0.05).

圖5 小鼠胃組織的SOD、CAT的活性變化.各組小鼠胃組織中的抗氧化酶SOD及CAT的活性變化.aP＜0.01,乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;bP＜0.05,乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.SOD: 超氧化物歧化酶;CAT: 過(guò)氧化氫酶;WT: 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;KO: 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組;KO+VE:乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.

2.6 PPARα缺失改變乙醇飲食組小鼠胃內(nèi)抗氧化酶類(lèi)的mRNA相對(duì)表達(dá)水平 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果如圖6所示,與WT-EtOH組相比,KO-EtOH組小鼠胃組織內(nèi)編碼Cu,Zn-SOD的mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯下降(P＜0.01),但是編碼Mn-SOD的mRNA相對(duì)表達(dá)水平無(wú)顯著改變;而相較于KO-EtOH組,KO-EtOH+VE組小鼠胃內(nèi)編碼CAT的mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.05).

圖6 小鼠胃組織內(nèi)抗氧化酶類(lèi)的mRNA相對(duì)表達(dá)水平變化.各組小鼠胃組織內(nèi)的編碼Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT的mRNA相對(duì)表達(dá)情況.aP＜0.01,乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;bP＜0.05,乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組 vs 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.Cu·Zn Sod: 銅鋅超氧化物歧化酶;Mn-Sod: 錳超氧化物歧化酶;WT: 乙醇飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠組;KO: 乙醇飲食喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組;KO+VE: 乙醇飲食聯(lián)合維生素E喂養(yǎng)的PPARα敲除型小鼠組.

3 討論

本項(xiàng)研究結(jié)果顯示了在長(zhǎng)期攝入乙醇的情況下,PPARα的缺失會(huì)造成更為嚴(yán)重的胃黏膜損傷,而應(yīng)用抗氧化劑維生素E可緩解病理?yè)p傷程度.這些結(jié)果提示PPARα缺失引起更為嚴(yán)重的乙醇誘導(dǎo)性胃黏膜損傷,其發(fā)生機(jī)制可能和胃內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇有關(guān).上述結(jié)果表明PPARα對(duì)于乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用.

血中谷胱甘肽氧化還原對(duì),GSH和GSSG,是機(jī)體內(nèi)非常重要的氧化還原對(duì).GSH在酶的催化作用下能夠清除過(guò)氧化氫或其他氧自由基,同時(shí)生成GSSG;在還原酶的作用下,GSSG又能還原為GSH.GSH與GSSG的比值(GSH/GSSG)是機(jī)體氧化還原狀態(tài)的主要?jiǎng)討B(tài)指標(biāo)[9].有研究指出,低水平的氧化應(yīng)激反應(yīng)即可誘導(dǎo)GSH升高,從而使比值上升;但細(xì)胞毒性物質(zhì)若持續(xù)存在,GSH/GSSG的比值下降,則表明細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡并向氧化方向偏移,進(jìn)而造成氧化應(yīng)激損傷[10,11].在本實(shí)驗(yàn)中,PPARα的缺失使KO-EtOH組小鼠血清中GSH水平顯著下降,GSSG水平升高,倆者比值相較于WTEtOH組明顯下降,而經(jīng)過(guò)維生素E處理后GSH含量和GSH/GSSG比值稍有改善.這些結(jié)果表明在長(zhǎng)期攝入乙醇的情況下,缺少PPARα?xí)鹦∈髾C(jī)體的氧化還原狀態(tài)向氧化反應(yīng)進(jìn)一步偏移,加劇氧化應(yīng)激反應(yīng).PPARα可能通過(guò)改變機(jī)體的氧化還原狀態(tài),使其避免向氧化方向發(fā)展,從而起到抗氧化的保護(hù)作用.

乙醇作為外源性侵襲因素,與胃黏膜的接觸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可以削弱黏膜屏障功能,并在代謝過(guò)程中通過(guò)脫氫和氧化反應(yīng)、吸引中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等方式引起胃內(nèi)氧自由基生成增加[1,12,13].氧自由基引起黏膜細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度越劇烈,胃組織中的MDA、4-HNE等脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物含量越多[14,15].近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),PPARα及其配體對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化和氧自由基的清除具有重要調(diào)控作用,在多種相關(guān)疾病模型中均有防治作用.在腎組織中,激活PPARα能夠下調(diào)脂質(zhì)過(guò)氧化水平,減輕足細(xì)胞損傷,從而起到改善糖尿病腎病的作用[16].Ibarra-Lara等[17]發(fā)現(xiàn)激活PPARα后能夠增加大鼠心肌缺血模型SOD和CAT的活性,減輕了再灌注過(guò)程中的氧化應(yīng)激損傷.SOD和CAT是體內(nèi)重要的氧自由基清除酶類(lèi),其活力高低可以反映機(jī)體清除氧自由基的能力[18].本實(shí)驗(yàn)中,對(duì)比WT-EtOH組,KO-EtOH組小鼠胃組織中抗氧化酶類(lèi)SOD和CAT的活性降低,同時(shí)MDA的含量和4-HNE的陽(yáng)性表達(dá)水平均明顯升高,說(shuō)明在PPARα缺失的情況下,小鼠胃內(nèi)氧自由基的清除水平下降,加劇了乙醇誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷.而在PPARα敲除組別中,小鼠經(jīng)維生素E處理后胃內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的形成明顯減少,也進(jìn)一步證實(shí)缺少PPARα可引起小鼠胃內(nèi)氧自由基生成增多,表明PPARα在胃組織中具有促進(jìn)氧自由基清除,減輕脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的作用.值得注意的是,KO-EtOH組小鼠胃組織內(nèi)Cu,Zn-SOD的mRNA相對(duì)表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下調(diào),應(yīng)用維生素E后也未能明顯提升其表達(dá)量,而Mn-SOD的表達(dá)水平并未出現(xiàn)顯著差異;CAT的mRNA相對(duì)表達(dá)水平在KOEtOH組僅呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì),但應(yīng)用維生素E后顯著增加了CAT的活性.在酒精性肝損傷的研究中發(fā)現(xiàn),PPARα缺陷小鼠肝內(nèi)SOD的表達(dá)明顯下降,并且肝內(nèi)Cu,Zn-SOD的表達(dá)和PPARα的表達(dá)水平呈正相關(guān)[19];而在心功能不全模型小鼠的研究中發(fā)現(xiàn),PPARα缺陷可引起心肌的Mn-SOD表達(dá)和活性顯著降低,引起心肌收縮功能紊亂[20];也有研究證實(shí),長(zhǎng)期攝入乙醇后大鼠胃內(nèi)的CAT主要發(fā)揮氧化代謝作用,當(dāng)大鼠胃黏膜處于低pH值環(huán)境時(shí),CAT的表達(dá)和活化情況主要與乙醇脫氫形成乙醛的過(guò)程有關(guān)[21].本實(shí)驗(yàn)中,KO-EtOH組對(duì)比其他組別在SOD和CAT的活性和mRNA表達(dá)結(jié)果呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì),這說(shuō)明在乙醇誘導(dǎo)的小鼠慢性胃黏膜損傷過(guò)程中,PPARα的缺乏可能更傾向于導(dǎo)致胃內(nèi)Cu,Zn-SOD的表達(dá)與活化受到抑制.

4 結(jié)論

綜上所述,PPARα的缺失引起小鼠體內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡,加劇胃內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),抗氧化酶SOD和CAT的活性及SOD的表達(dá)受到抑制,從而加重了乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜氧化應(yīng)激損傷.從酒精性胃黏膜損傷的發(fā)病機(jī)制出發(fā),探尋具有抑制氧化應(yīng)激水平的生物活性物質(zhì)可起到保護(hù)胃黏膜作用的同時(shí),還可以減少臨床不良反應(yīng).PPARα作為重要的生物活性轉(zhuǎn)錄因子,已有研究證實(shí)其激動(dòng)劑可以作為酒精性肝病的有效治療策略[22].本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了長(zhǎng)期攝入乙醇的情況下,PPARα對(duì)于胃黏膜氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用,未來(lái)將進(jìn)一步研究PPARα激動(dòng)劑是否具有改善酒精性胃黏膜損傷的藥理效應(yīng),為臨床治療提供新的理論依據(jù)和作用靶點(diǎn).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

長(zhǎng)期飲酒使乙醇持續(xù)與胃黏膜接觸,引起胃內(nèi)活性氧物質(zhì)生成增多,黏膜屏障功能持續(xù)受損,進(jìn)而造成慢性胃黏膜氧化應(yīng)激損傷.目前酒精性胃黏膜損傷多以抑酸治療為主,但長(zhǎng)期應(yīng)用后會(huì)產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng),且停藥后復(fù)發(fā)率較高.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

探究對(duì)于胃黏膜具有保護(hù)作用的新型治療藥物,為酒精性胃黏膜損傷的防治提供新的思路和靶點(diǎn).

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探究過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptor α,PPARα)在乙醇誘導(dǎo)的慢性胃黏膜損傷過(guò)程中的作用及分子機(jī)制,驗(yàn)證PPARα在胃黏膜內(nèi)具有抗氧化效應(yīng).

實(shí)驗(yàn)方法

使用野生型和PPARα敲除型小鼠,通過(guò)乙醇誘導(dǎo)慢性胃黏膜損傷病理模型,輔以維生素E作為抗氧化對(duì)照.通過(guò)HE染色法觀察小鼠胃黏膜組織病理學(xué)改變,通過(guò)生化法檢測(cè)小鼠血清和胃組織中的還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽和丙二醛的含量以及胃組織中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)的活性,通過(guò)免疫組化法檢測(cè)小鼠胃組織中4-羥基壬烯醛的表達(dá)水平,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)小鼠胃組織中SOD和CAT的mRNA相對(duì)表達(dá)水平.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

缺少PPARα加劇了乙醇誘導(dǎo)的小鼠胃黏膜病理?yè)p傷,引起小鼠機(jī)體內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡并向著氧化方向發(fā)展.缺少PPARα激化了胃黏膜內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),并降低了胃內(nèi)抗氧化酶SOD的活性和mRNA表達(dá)水平.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

缺少PPARα可導(dǎo)致乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜氧化應(yīng)激損傷進(jìn)一步加重,提示PPARα可通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和提高抗氧化酶的表達(dá)及活性,對(duì)乙醇誘導(dǎo)的慢性胃黏膜損傷起到一定的保護(hù)作用.

展望前景

本研究驗(yàn)證了PPARα作為生物活性轉(zhuǎn)錄因子,在胃黏膜內(nèi)具有抗氧化的生物學(xué)效應(yīng),為防治慢性酒精性胃黏膜損傷提供了新思路和新策略.在未來(lái)的臨床治療手段研究中,將通過(guò)使用外源性激動(dòng)劑,解析PPARα激活后對(duì)酒精性胃黏膜損傷是否具有療效,明確外源性PPARα激動(dòng)類(lèi)藥物在酒精性胃黏膜損傷的防治中可能具有的重要臨床意義和開(kāi)發(fā)價(jià)值.