高宇鶴 徐西林 李志剛 赫龍 薛玉滿 張曉峰*

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,黑龍江 哈爾濱150040 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱150001

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是指由于各種病因誘發(fā)骨細(xì)胞壞死的一種常見疾病,病理過程為“病因?qū)е鹿侨毖?進(jìn)而細(xì)胞壞死,成骨細(xì)胞分化使骨修復(fù),然而持續(xù)病因作用導(dǎo)致骨吸收大于骨生成,因此外力致使股骨頭塌陷”[1]。ONFH的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,使其成為骨科難治疾病之一。存在很多學(xué)說來解釋ONFH的發(fā)病機(jī)制,例如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成骨分化異常、脂代謝異常、骨質(zhì)疏松及骨細(xì)胞凋亡學(xué)說等[2]。中國年增加5萬～10萬例SONFH患者,且該數(shù)字呈上升趨勢[3]。高發(fā)病率、高致殘率迫使人們急需尋找有效的治療方法。眾多研究證實(shí),表觀遺傳修飾在調(diào)節(jié)骨壞死、凋亡和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化方面起著重要作用,因此可能是潛在治療靶點(diǎn)。

表觀遺傳學(xué)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究中,在2010年以前,年發(fā)文量不足5篇,之后逐年增多,2016-2018年,為發(fā)文量的高峰期[4]。中醫(yī)藥治療股骨頭壞死的療效明顯、創(chuàng)傷小,早期可減輕患者痛苦。因此,本文通過綜述表觀遺傳學(xué)中DNA、RNA甲基化、組蛋白在防治股骨頭壞死中的作用機(jī)制,以期為中醫(yī)藥防治ONFH提供足夠的理論。

1 DNA 甲基化與股骨頭壞死

DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的催化下,腺嘌呤或胞嘧啶通過共價(jià)結(jié)合S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的甲基團(tuán),形成5-甲基胞嘧啶(5 mC)的過程[5-6]。在激素性O(shè)NFH中,激素可以誘導(dǎo)BMSCs中ABCB1基因過甲基化修飾,使P糖蛋白合成減少,然而降低其甲基化能恢復(fù)細(xì)胞功能[7]。地塞米松通過DNA甲基化調(diào)控BMSCs分化[8]。另外在酒精性O(shè)NFH中,114個(gè)位點(diǎn)中23個(gè)位點(diǎn)顯示高甲基化,并在OPG/RANKL/RANK基因中發(fā)現(xiàn)多個(gè)CpG位點(diǎn)處于異常甲基化狀態(tài)[9]。ONFH組BMSCs增殖能力降低與FZD1 基因的異常CpG島高甲基化相關(guān)[10]。王鵬等[8]在中晚期時(shí)使用地塞米松干預(yù)BMSCs后,發(fā)現(xiàn)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1與H3K27 me3增加、H3K4me3減少有關(guān)。

10-11易位蛋白(ten-eleven-translocation protein,TET)酶家族在DNA去甲基化過程中起到關(guān)鍵調(diào)控功能,促使DNA主動(dòng)去甲基,5 mC在TET酶的不斷氧化下,依次形成5hmC、5fC、5caC產(chǎn)物[11-12]。另外5hmC在激素性O(shè)NFH組上調(diào),并且TET3通過影響5hmC水平,進(jìn)而改變骨細(xì)胞凋亡[13]。研究認(rèn)為激素性O(shè)NFH是一種多基因病,3個(gè)關(guān)聯(lián)基因NR3C1、MTHFR和IGFBP3與DNA甲基化存在交互作用[14]。

2 組蛋白修飾與股骨頭壞死發(fā)病機(jī)制

與DNA結(jié)合形成核小體的組蛋白是構(gòu)成染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白,通常經(jīng)過乙?；?、甲基化、磷酸化、腺苷酸化等對(duì)組蛋白進(jìn)行修飾[15]。

2.1 組蛋白去乙?；揎椗c股骨頭壞死

組蛋白去乙?；扇ヒ阴；?HDACs)催化,促進(jìn)核小體及其周圍DNA的相互結(jié)合,繼而使基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生沉默。哺乳動(dòng)物中包含4類HDACs,其中Ⅰ類為HDAC1、2、3和8;Ⅱ類包括HDAC4、5、6、7、9和10;第Ⅲ類又稱沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶類(Sir2-related enzymes,Sirtuins);Ⅳ類HDACs主要是HDAC11。其中Sirtuins家族包括SIRT1～7,均以一個(gè)輔助因子NAD+為結(jié)合域與核心催化結(jié)構(gòu)域相構(gòu)成[16]。

研究發(fā)現(xiàn)SIRT3在激素處理的BMSCs中降低[17],用花青素和白藜蘆醇處理成骨細(xì)胞時(shí)通過增加 SIRT1與SIRT3減少細(xì)胞凋亡[18]。SIRT6通過促進(jìn)成骨分化從而預(yù)防股骨頭壞死[19]。過表達(dá)SIRT6的小鼠在缺血性手術(shù)后抵抗骨細(xì)胞死亡,而SIRT6敲除表現(xiàn)出加重的骨質(zhì)流失和嚴(yán)重的畸形。另外在股骨遠(yuǎn)端骨骺發(fā)生缺血性損傷后,SIRT6靶向維生素D受體(VDR)-RANKL通路對(duì)預(yù)防ONFH至關(guān)重要[20]。用SIRT6治療的髓系細(xì)胞中,骨缺血壞死手術(shù)中誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能會(huì)減少[21]。

C/EBPα與成脂有關(guān),實(shí)驗(yàn)證明C/EBPα通過PPARγ通路促進(jìn)BMSCs的成脂分化,具體機(jī)制是C/EBPα通過抑制 HDAC1上調(diào)PPARγ啟動(dòng)子區(qū)域的H3K27乙酰化水平,阻止脂肪分化,從而減緩激素性O(shè)NFH 的進(jìn)展[22]。HDAC9與ONFH的成骨相關(guān)信號(hào)通路有關(guān),在臨床上發(fā)現(xiàn)激素性和酒精性O(shè)NFH患者HDAC9c-S水平顯著上調(diào)[23]。當(dāng)敲低HDAC9后發(fā)現(xiàn),經(jīng)過MAPK 信號(hào)通路抑制hBMSC的成骨分化[24]。另外下調(diào)HDAC9將誘發(fā) BMSCs的成骨及成血管能力降低,成脂能力升高[25]。成骨分化降低導(dǎo)致低骨量,而低骨量與骨特異性基因啟動(dòng)子的 H3K27乙酰化減少有關(guān)[26]。

2.2 組蛋白去甲基化修飾與股骨頭壞死

組蛋白去甲基化酶可根據(jù)特殊結(jié)構(gòu)域的不同分為兩類:一個(gè)是具有Tower結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶家族(lysine-specifichistone demethylase,LSD);另一個(gè)含Jumonji C(JmjC)結(jié)構(gòu)域。后者為已知最大的一類組蛋白去甲基化酶,并根據(jù)不同結(jié)構(gòu)域分為KDM2、3、4、5、6、7亞家族[27]。

研究證明KDM4A 的過表達(dá)促進(jìn)了BMSC成骨分化[28]。在血瘀型激素性O(shè)NFH中,KDM6A mRNA減少[29]。KDM4A 直接結(jié)合 Sfrp4和C/ebpα的啟動(dòng)子,去除組蛋白甲基化標(biāo)記 H3K9me3,并降低二者啟動(dòng)子區(qū)域CpG的DNA甲基化水平[30]。

KDM5家族是一個(gè)重要的表觀遺傳狀態(tài)修飾酶家族,包含5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域:JmjN、ARID、JmjC、PhD 和一個(gè) C5HC2 鋅指[31]。包括KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D。KDM5A是BMSCs成骨分化的負(fù)調(diào)控因子,KDM5B作為一種成骨、成肌細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控因子參與Runx2的雙位點(diǎn)表觀遺傳調(diào)控[32]。

KDM5D是一種男性特異性蛋白[33]。在腎虛血瘀型激素性O(shè)NFH大鼠中發(fā)現(xiàn)沉默KDM5D基因?qū)е翨MSCs中Runx2、OPN、OCN降低[34]。KDM5D在人類成年男性神經(jīng)嵴衍生干細(xì)胞(NCSC)分化時(shí)高度上調(diào),使 H3K4me2/H3K4me1去甲基化。并且與女性NCSC相比,KDM5D是男性NCSC更快成骨分化的主要驅(qū)動(dòng)因素,若KDM5D 的藥理學(xué)抑制顯著降低了雄性成骨分化能力[35]。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)男性患者的Y染色體上的兩個(gè)基因KDM5D和RPS4Y1發(fā)生下調(diào)[36]。在存在SLE但無ONFH組發(fā)現(xiàn)KDM5D表達(dá)降低,而激素組與SLE組比較,差異表達(dá)倍數(shù)前20的基因包含KDM5D,說明激素明顯影響KDM5D[34]。與野生型小鼠相比,缺少Y染色體以及KDM5D功能喪失突變的小鼠在甲基化水平上沒有差異,因此Y染色體的遺傳變異影響常染色體區(qū)域的DNA甲基化水平[37]。綜上,已知SLE患者會(huì)在臨床上大量使用激素會(huì)導(dǎo)致ONFH,而ONFH的男性患病率又高于女性,可能男性O(shè)NFH易感性與KDM5D的高水平有關(guān)。

KDM6A與骨細(xì)胞的生成有關(guān),Xia等[38]證實(shí)表達(dá)骨基質(zhì)酸性蛋白的成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞中的組蛋白去甲基化酶(UTX,又稱KDM6A)通過H3K27 me3 修飾正向調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化。Wang等[39]證明UTX 減弱激素對(duì)成骨和成脂的失調(diào),具體是減少Dkk1啟動(dòng)子中的 Runx2啟動(dòng)子甲基化和H3K27 me3富集,而β-catenin和Dkk1又可調(diào)節(jié)激素對(duì)UTX的抑制。UTX 抑制會(huì)加劇骨量丟失、骨小梁破壞和脂肪堆積。

2.3 組蛋白甲基化修飾與股骨頭壞死

H3K27 me3是常見的組蛋白甲基化修飾之一,具有轉(zhuǎn)錄抑制作用,與靶基因及mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯呈負(fù)相關(guān)[40]。Zhang等[41]發(fā)現(xiàn)缺氧經(jīng)過HIF-1α/EZH2信號(hào)軸促進(jìn)LncRNA Tmem235啟動(dòng)子H3K27 me3的修飾,抑制其表達(dá),導(dǎo)致BMSCs缺氧凋亡。Bitirim等[42]證實(shí)經(jīng)雌激素處理后脂肪形成相關(guān)基因的H3K27 me2和H3K27 me3增加可能是由雌激素受體α和組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(EZH2)的直接相互作用介導(dǎo)的,雌激素調(diào)節(jié) H3K27甲基化從而抑制MSC的脂肪分化,說明具有表觀遺傳轉(zhuǎn)換開關(guān)的作用。因此可以從表觀遺傳學(xué)上分析高齡女性易發(fā)生骨病的原因,隨著年齡增加,內(nèi)源性雌激素水平下降,使抑制性的組蛋白修飾物減少,導(dǎo)致BMSC的脂肪分化不受抑制,最后導(dǎo)致骨細(xì)胞水平下降,骨含量減少,誘發(fā)ONFH。

3 RNA甲基化與股骨頭壞死

N6-甲基腺苷 (m6A) 是真核細(xì)胞中最豐富的RNA甲基化修飾類型,廣泛存在于真核細(xì)胞的mRNA和非編碼RNA中[43]。

Cheng等證明通過m6A使甲基轉(zhuǎn)移酶(METTL14)增加 PTPN6 mRNA 的m6A修飾,并增強(qiáng)穩(wěn)定性,以此上調(diào) PTPN6,進(jìn)而加強(qiáng)METTL14對(duì)激素性O(shè)NFH的BMSCs的增殖和成骨分化[44]。

FTO是一種m6A去甲基化酶,并且研究發(fā)現(xiàn)FTO rs62033406 A>G是中國漢族人群ONFH的危險(xiǎn)因素[45]。YTH家族中的YTHDF1蛋白主要通過與mRNA的m6A位點(diǎn)結(jié)合發(fā)揮作用[46]。FTO在骨質(zhì)疏松癥和骨壞死患者中顯著下調(diào),并且FTO 以YTHDF1依賴性方式介導(dǎo) PPARG-mRNA 3'UTR 中的m6A去甲基化,并降低PPARG mRNA 穩(wěn)定性,另外PPARG 的過表達(dá)會(huì)減輕FTO介導(dǎo)的BMSC成骨分化[47]。

4 中醫(yī)藥基于表觀遺傳學(xué)治療股骨頭壞死進(jìn)展

4.1 中醫(yī)藥調(diào)控DNA甲基化治療股骨頭壞死

研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可能通過ABCB1啟動(dòng)子去甲基化使類固醇相關(guān)性骨壞死患者的MSCs受益[48]。左歸丸使Runx2、Osterix、OC、β-catenin基因去甲基化從而促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化[49]。葛根素抑制雌激素受體的啟動(dòng)子甲基化及增加其mRNA表達(dá)從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化[50]。

4.2 中醫(yī)藥調(diào)控組蛋白甲基化治療股骨頭壞死

在調(diào)控組蛋白修飾方面,證明新橙皮苷(neohesperidin,NH)通過抑制 lncRNA-HOTAIR與lncRNA-SNHG1的組蛋白修飾來改善類固醇誘導(dǎo)的股骨頭壞死,NH增加了BMSCs的活力和HOTAIR與SNHG1的H3K27 me3占有率,但降低了二者的表達(dá)及H3K4me3的占有率[51-52]。活血通絡(luò)膠囊通過抑制lncRNA-MIAT 改善股骨頭壞死,具體機(jī)制是由于顯著增加了MIAT啟動(dòng)子區(qū)域中H3K27 me3的占有率并減少了H3K4me3[53]。毛殼素處理絨山羊脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞后可以顯著降低組蛋白H3K9 me2和H3K9 me3的甲基化修飾作用[54]。補(bǔ)腎健脾活血方促進(jìn)組蛋白去甲基化酶JMJD2B的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)BMSCs成骨分化[55]。仙靈骨葆膠囊可通過抑制miR-100-5p的表達(dá)促進(jìn)JMJD3/RUNX2通路的激活促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[56]。

4.3 中醫(yī)藥調(diào)控組蛋白乙?；委煿晒穷^壞死

白藜蘆醇可以在骨關(guān)節(jié)炎[57]、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[58]中發(fā)揮促成骨作用,在股骨頭壞死中也不例外,大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇調(diào)控去乙?；笇?duì)不同種骨細(xì)胞,如(前)成骨細(xì)胞、(前)破骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)白藜蘆醇通過增強(qiáng) SIRT3 表達(dá)并降低大鼠的氧化水平,通過激活 AMPK/PGC-1α/SIRT3 軸促進(jìn)BMSCs 成骨分化[17]。白藜蘆醇通過SIRT1激活至少部分地通過減弱 p44/p42 MAP 激酶通路來抑制 IGF-I 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞遷移[59]。白藜蘆醇通過提高SIRT1、Runx2、ALP等成骨因子的表達(dá)從而對(duì)前成骨細(xì)胞發(fā)揮骨保護(hù)作用[60]。白藜蘆醇通過上調(diào)SIRT1而增強(qiáng)成骨細(xì)胞的增殖,并抑制DEX誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞線粒體自噬的發(fā)生[61]。白藜蘆醇通過激活導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化的SIRT1和 Runx2 來反轉(zhuǎn) TNF-β和NAM抑制的BMSCs成骨[62]。對(duì)于破骨細(xì)胞,白藜蘆醇通過激活Sirt1而上調(diào)FoxO1從而抑制破骨細(xì)胞的形成[63]。

蝦青素在乙醇處理的巨噬細(xì)胞中的抗炎和抗氧化特性可能至少部分是通過其對(duì) SIRT1 和HDAC4的相反作用來介導(dǎo)的,從而使SIRT1能夠抵消乙醇誘導(dǎo)的HDAC4激活[64]。乙醇顯著降低了SIRT1 性和細(xì)胞NAD+水平,但蝦青素顯著減弱了RAW 264.7減少,并上調(diào)SIRT1[65]。水飛薊賓抑制氧化應(yīng)激以促進(jìn)成骨分化。此外證實(shí)通過激活SIRT1/SOD2信號(hào)通路促進(jìn)MC3T3-E1的成骨分化[66]。藍(lán)莓汁部分通過 SIRT1 保護(hù)骨細(xì)胞和骨前體細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[67]?；罟枪嘧⒁嚎纱龠M(jìn)SIRT1核轉(zhuǎn)移和LC3蛋白介導(dǎo)自噬泡形成使細(xì)胞自噬水平增加,拮抗地塞米松對(duì)BMSCs活力及成骨分化和鈣化的抑制作用[68]。巖白菜素可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSC的成骨分化并抑制其成脂分化,RUNX2、COL1A1和SIRT1的表達(dá)水平顯著增加,PPARγ蛋白表達(dá)減少[69]。芫花素升高ALP、Runx2表達(dá),下調(diào)HDAC1而促進(jìn)MC3T3-E1向成骨細(xì)胞分化[70]。研究證實(shí),姜黃素可作為表觀遺傳開關(guān),通過抑制 EZH2 特異性調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化,并顯著提高了成骨標(biāo)志物的表達(dá)水平,包括 Runx2、Osterix、骨橋蛋白和骨鈣素[71]。海參腸肽(SCIP)顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和礦化結(jié)節(jié),增加軟骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。而SCIP 補(bǔ)充劑通過整合素介導(dǎo)的組蛋白乙?；T導(dǎo)軟骨細(xì)胞去分化為骨祖細(xì)胞,然后通過Wnt/β-catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)再分化為成骨細(xì)胞[72]。

4.4 中醫(yī)藥調(diào)控RNA甲基化治療股骨頭壞死

中藥小分子蟛蜞菊內(nèi)酯可靶向結(jié)合RNA甲基化酶Nsun4,調(diào)控Nsun4的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)RNA的m5C甲基化水平,促進(jìn)BMSCs成軟骨分化[73]。墨旱蓮提取物升高BMSCs成骨分化過程中總RNA的m6A甲基化水平,促進(jìn)了甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL4表達(dá)水平[74]。

5 總結(jié)與展望

綜上所述,表觀遺傳在ONFH對(duì)BMSC的成骨與成脂分化、血管生成,骨細(xì)胞凋亡、壞死等途徑發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在臨床上通過采集ONFH患者壞死股骨頭組織、尿液樣本進(jìn)行檢測分析,發(fā)現(xiàn)異常高DNA甲基化、組蛋白修飾、ncRNA等表觀遺傳修飾與ONFH的進(jìn)程密切相關(guān),這表明表觀遺傳的改變與ONFH成一定相關(guān)性。

雖然表觀遺傳學(xué)發(fā)展迅速,但基于此過程的治療多集中在動(dòng)物模型尚未在臨床中推廣應(yīng)用。隨著對(duì)股骨頭壞死發(fā)病機(jī)制中表觀遺傳學(xué)修飾的認(rèn)識(shí)的不斷提高,希冀找尋一種新的表觀遺傳的臨床治療方法,從而達(dá)到抑制成脂分化、促進(jìn)成骨分化、減少成骨細(xì)胞程序性死亡等目的。因此,更多的中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)研究來詳細(xì)地描述表觀遺傳學(xué)在ONFH參與機(jī)制,并運(yùn)用其實(shí)現(xiàn)臨床價(jià)值。