CRISPR/dCas9 系統(tǒng)的研究進展和應用

劉雅睿

（中國海洋大學 海洋生命學院，山東青島 266003）

基因編輯是研究基因功能的重要方法之一，目前研究人員大多使用人工核酸內(nèi)切酶（Engineered Endonuclease，EEN）進行基因編輯，常見的EEN包括鋅指核酸內(nèi)切酶（Zinc Finger Endonuclease，ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN）以及CRISPR/Cas（Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated proteins）系統(tǒng)[1]。基于蛋白質(zhì)-DNA 識別的ZFN、TALEN 定位新位點時需要設計復雜的蛋白質(zhì)，因此很難應用于高通量技術。與其相比，基于sgRNA 指導的CRISPR/Cas 系統(tǒng)具有多樣性、模塊化、高效率的特點，且易于設計合成，是基因組編輯及基因表達調(diào)控方面的理想工具。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是存在于許多細菌和大部分古菌中的適應性免疫系統(tǒng)，可以抵御病毒、質(zhì)粒等外源遺傳物質(zhì)入侵細胞[2]。CRISPR 系統(tǒng)由多樣的Cas9蛋白和引導RNA（guide RNA，gRNA）組成。引導RNA 包含兩部分，分別是成熟的crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（trans-activating RNA）。當外源遺傳物質(zhì)（如DNA）入侵生物體時，個體的CRISPR 系統(tǒng)會以外源DNA 的原間隔序列鄰近基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM）序列為靶點，捕獲切割PAM 鄰近的外源DNA，并將其作為間隔序列整合到CRISPR的兩個重復序列之間，轉(zhuǎn)錄后得到pre-crRNA，再經(jīng)過剪切得到的成熟的crRNA，與tracrRNA 形成雙鏈gRNA 結(jié) 構(gòu)。gRNA 與Cas9 蛋 白 組成 具 有DNA 內(nèi)切酶活性的復合物，在gRNA 的引導下與外源DNA特異性結(jié)合，并使用Cas9 蛋白的核酸結(jié)構(gòu)域?qū)ν庠碊NA 進行切割。

不同生物體內(nèi)的CRISPR 系統(tǒng)有所不同，可以大致分為I 型、Ⅱ型、Ⅲ型三類。其中釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Ⅱ型CRISPR 系統(tǒng)由成熟的crRNA、tracrRNA 構(gòu)成的sgRNA（single guide RNA）及Cas9 蛋白組成。Cas9-sgRNA 復合物與目標DNA 結(jié)合后，Cas9 蛋白的HNH、RuvC 結(jié)構(gòu)域分別切割與gRNA 互補的DNA 目標鏈和非目標鏈，導致雙鏈斷裂。如果Cas9 蛋白的HNH 結(jié)構(gòu)域第840 位由組氨酸突變?yōu)楸彼?，且RuvC 結(jié)構(gòu)域第10 位由天冬氨酸突變?yōu)楸彼?，這兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域就會處于失活狀態(tài)，失去剪切DNA 的能力，通常把這種核酸酶失活的Cas9 蛋白稱為dCas9（deficient Cas9）蛋白。dCas9 雖然失去了剪切DNA 的能力，但依然能在sgRNA 的引導下與DNA 特異性結(jié)合，因此可以用于基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳學修飾、活細胞成像等領域[3]。本文根據(jù)已有報道，總結(jié)了CRISPR/dCas9 系統(tǒng)在不同領域的研究進展及應用現(xiàn)狀，并對其未來的研究進行展望。

1 dCas9 對基因組轉(zhuǎn)錄的調(diào)控

dCas9 是依賴RNA 的DNA 結(jié)合蛋白，可以不改變目標基因序列，直接對目標基因轉(zhuǎn)錄進行修飾及調(diào)控。將dCas9 與不同效應物融合進行工程化改造，便可以實現(xiàn)序列特異性基因組調(diào)控。典型應用就是CRISPRi（CRISPR interference）和CRISPRa（CRISPR activation）。

CRISPRi 意為CRISPR 干擾技術，可以干擾RNA的轉(zhuǎn)錄。在以細菌為代表的原核生物中，dCas9可以通過空間位阻單獨阻斷RNA 聚合酶（RNA Polymerase，RNAP）的轉(zhuǎn)錄延伸，從而阻斷轉(zhuǎn)錄。QI 等[4]的研究表明，CRISPRi的沉默效應可以被誘導和逆轉(zhuǎn)，且通過全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序發(fā)現(xiàn)CRISPRi sgRNA 引導的基因沉默具有高度特異性，沒有顯著的脫靶效應。而在真核生物中，單一dCas9 的CRISPRi 抑制轉(zhuǎn)錄效率較低，為了提高CRISPRi 效果，可以將dCas9 與抑制轉(zhuǎn)錄的復合物結(jié)合來沉默基因表達。如GILBERT等[5]將dCas9 和抑制轉(zhuǎn)錄的Krüppel 相關框（KRAB）結(jié)構(gòu)域融合，可以有效抑制人類細胞轉(zhuǎn)錄。

CRISPRa 即通過CRISPR 系統(tǒng)激活或增強轉(zhuǎn)錄。BIKARD 等[6]將RNAP 的ω 亞基融合到dCas9的C 端，這個復合物可以定向到啟動子區(qū)域，有效募集RNAP 以激活基因表達。此外，dCas9 還可以與哺乳動物細胞中的VP64、p65AD 等轉(zhuǎn)錄激活因子相結(jié)合，激活基因表達。為了提高CRISPRa 的效率，可以同時招募多種轉(zhuǎn)錄激活因子來上調(diào)基因轉(zhuǎn)錄，常見的有協(xié)同激活誘導因子（Synergistic Activation Mediator，SAM）、SunTag、VPR（VP64-p65-Rta）系統(tǒng)。（1）KONERMANN 等[7]設計的SAM 系統(tǒng)以sgRNA和dCas9 為支架募集多種協(xié)同作用激活因子，在該系統(tǒng)中，dCas9-VP64 與含有兩個MS2 RNA 的sgRNA結(jié)合，形成的MS2-VP64 可以招募同源蛋白MCP，形成MCP-p65-HSF1 激活結(jié)構(gòu)域。（2）SunTag 是一種重復多肽支架，與dCas9 結(jié)合后，抗GCN4 可以招募多個轉(zhuǎn)錄激活因子放大基因表達信號。如LIU 等[8]使用dCas9-SunTag-VP64 激活內(nèi)源性Oct4 和Sox2，觸發(fā)細胞重編程，誘導產(chǎn)生多功能干細胞。（3）VPR系統(tǒng)則是將VP64-p65-Rta 串聯(lián)融合后與dCas9 連接，形成三方激活域。CHAVEZ 等[9]的實驗發(fā)現(xiàn)dCas9-VPR 對內(nèi)源基因的激活能力遠高于dCas9-VP64（22 ～320 倍），且VPR 可通過多基因靶向激活多位點，提高整個基因組的表達水平。

除了可以將單個dCas9 蛋白與轉(zhuǎn)錄抑制或激活因子融合，調(diào)節(jié)某個特異性基因的轉(zhuǎn)錄之外，還可以通過支架RNA（scaffold RNA，scRNA）來對同一細胞內(nèi)的不同基因進行多模式調(diào)控。ZALATAN 等[10]將CRISPR/dCas9 的sgRNA 與RNA 適配體相融合，構(gòu)建scRNA。RNA 適配體可以招募與激活因子或阻遏物融合的RNA 結(jié)合蛋白調(diào)控轉(zhuǎn)錄，通過在每個scRNA 上設計多個RNA 募集位點，便可以獨立調(diào)整每個靶位點的激活或抑制強度，能同時調(diào)節(jié)多個基因的轉(zhuǎn)錄表達。

2 dCas9 的表觀遺傳學修飾

表觀遺傳是指DNA 序列改變之外基因組功能表達發(fā)生的可遺傳變化，其中以DNA 與組蛋白修飾為代表的染色質(zhì)編輯是表觀遺傳學領域的重要部分。dCas9 可以用類似調(diào)控靶向基因轉(zhuǎn)錄的方式，招募表觀遺傳修飾域來改變其靶向DNA 位點的表觀遺傳標記，從而導致相關基因表達的變化。

（1）DNA 甲基化是重要的表觀遺傳標記之一，其甲基化活性對目標區(qū)域具有特異性，并且可以在有絲分裂中遺傳。VOJTA 等[11]將dCas9 與DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A 結(jié)合，其融合蛋白能在以PAM 序列下游27 bp 為中心，約35 bp 寬的區(qū)域中靶向CpG 甲基化，且多個gRNA 可以將dCas9-DNMT3A 復合物靶向多個相鄰位點，使啟動子甲基化水平升高，從而沉默基因表達。（2）而在DNA 去甲基化方面，Tet雙加氧酶的催化結(jié)構(gòu)域可以氧化甲基形成5-羥甲基胞嘧啶，然后通過DNA 糖基化酶將其恢復為未修飾胞嘧啶來實現(xiàn)去主動甲基化。如LIU 等[12]構(gòu)建了dCas9-Tet1 融合蛋白在分裂細胞中有效靶向去甲基化，激活基因表達；XU 等[13]將MS2 RNA 的兩個拷貝插入到sgRNA 中，dCas9 與Tet 催化域（Tet-CD）連接，兩者融合形成dCas9-Tet1-CD 和MS2-Tet1-CD，可精準實現(xiàn)目標基因的去甲基化和激活，提高轉(zhuǎn)錄效率。

組蛋白修飾也是重要的表觀遺傳標記。組蛋白是DNA 纏繞的線軸，是染色質(zhì)的主要成分。組蛋白修飾包括賴氨酸或精氨酸甲基化、賴氨酸乙?；?、賴氨酸泛素化或絲氨酸磷酸化等，這些修飾能改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和組織，從而調(diào)節(jié)基因調(diào)控過程。例如組蛋白H3K4 二甲基化和三甲基化以及許多殘基上的乙?；ǔＥc活躍轉(zhuǎn)錄的基因有關，而H3K9 和H3K27 二甲基化和三甲基化會壓縮染色質(zhì)使其沉默[14]。THAKORE 等[15]發(fā)現(xiàn)dCas9-KRAB 靶向調(diào)節(jié)珠蛋白基因的H2S 增強子時，會特異性誘導增強子處H3K9me3，使珠蛋白基因表達沉默；KEARNS 等[16]將從腦膜炎雙球菌（Neisseria meningitidis）中加工得到的Nm dCas9 與組蛋白去甲基化酶LSD1 連接形成Nm dCas9-LSD1 復合物，靶向作用于小鼠胚胎干細胞的增強子，發(fā)現(xiàn)dCas9-LSD1 靶向增強子區(qū)域的H3K4me2、H3K27ac 顯著下調(diào)，有效抑制了由靶向增強子控制的基因表達；而HILTON 等[17]采用另一種方法，將Sp dCas9 和Nm dCas9 與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300 的催化核心域（p300core）融合，dCas9-p300core 使增強子和啟動子的H3K27 乙酰化增加，從而增強轉(zhuǎn)錄水平。

3 dCas9 的實際應用

CRISPR/dCas9 系統(tǒng)和其他基因編輯技術一樣存在脫靶效應，學者們針對脫靶效應的改善也進行了大量的工作，如GUILINGER 等[18]將dCas9 與FokI核酸酶結(jié)構(gòu)域融合，嘗試降低其脫靶效應。雖然CRISPR/dCas9 系統(tǒng)仍有缺點，但它引入可逆DNA 表觀遺傳修飾，調(diào)控多個基因靶向表達的特性已經(jīng)在基因組成像、植物研究及癌癥治療方面得到了實際應用。

3.1 dCas9 在基因組成像領域的應用

染色質(zhì)的時空組織和動力學在調(diào)節(jié)基因組功能中起關鍵作用。目前細胞成像主要依賴于熒光標記的DNA 結(jié)合蛋白，常見的熒光原位雜交技術（Fluorescent in Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）雖然能通過改變核酸探針的堿基序列來與不同目標序列匹配，但樣本固定和DNA 變性使FISH 不能實時成像。而CRISPR 系統(tǒng)既有核酸探針的靈活性，又具有能與DNA 結(jié)合的蛋白，因此CRISPR 系統(tǒng)是核細胞動態(tài)成像的理想工具。

CHEN 等[19]首次利用CRISPR 系統(tǒng)構(gòu)建了活細胞成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)由增強型綠色熒光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）、dCas9 及結(jié)構(gòu)優(yōu)化的sgRNA 構(gòu)成。研究人員對sgRNA 進行了AU 堿基對翻轉(zhuǎn)，以去除Pol-Ⅲ終止子，防止轉(zhuǎn)錄過早終止，還擴展了結(jié)合dCas9 的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，這些改造提高了成像效率。該成像系統(tǒng)能可視化重復或非重復的基因組序列，報告端粒的長度變化和運動，還可以檢測整個細胞周期基因位點的動態(tài)。TANENBAUM 等[20]使用SunTag 招募多達24 個綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）拷貝，可以對活細胞的單個蛋白質(zhì)分子進行長期成像。DENG 等[21]發(fā)現(xiàn)體外組裝的熒光dCas9-sgRNA 復合物可以有效且特異性地在近著絲粒區(qū)、著絲粒、G 富集端粒和編碼基因位點附近標記DNA 靶序列，他們將這種方法命名為CASFISH （Cas9-mediated Fluorescence in Situ Hybridization），即Cas9 介導的熒光原位雜交。研究證實，CASFISH 可用于具有多種顏色的多個序列特異性基因組區(qū)域成像，且這些多重標記較為穩(wěn)定；學者們還制備了成年小鼠大腦的低溫恒溫器切片，并對著絲粒和端粒進行了CASFISH 測定，表明固定的細胞和組織也可以通過體外組裝的熒光標記的dCas9-sgRNA 復合物進行有效標記。WANG 等[22]報道了一種稱為CRISPR 活細胞熒光原位雜交（CRISPR Live-cell Fluorescent in Situ Hybridization，CRISPR LiveFISH）的實時成像方法：CRISPR LiveFISH 將dCas9 和熒光標記的sgRNA 在體外組成熒光核糖核蛋白（fRNP），通過電穿孔將fRNP 復合物導入活細胞中，隨后與DNA 靶序列結(jié)合。CRISPR LiveFISH與活細胞兼容，可以跟蹤基因組編輯、染色體易位和轉(zhuǎn)錄的實時動態(tài)，且dCas9-gRNA-DNA 復合物十分穩(wěn)定、不易降解，提高了信噪比，可用于診斷染色體疾病。

3.2 dCas9 在植物研究中的應用

CRISPR/dCas9 系統(tǒng)在植物中的研究應用以轉(zhuǎn)錄調(diào)控為主。在植物的生長過程中，增強對外界的脅迫耐受性十分重要，而植物的耐受性又受到體內(nèi)復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，包括代謝、信號傳導和轉(zhuǎn)錄調(diào)控之間的多方面相互作用[23]。因此，使用CRISPR/dCas9 調(diào)控部分目標基因的轉(zhuǎn)錄可能有利于增強作物的脅迫抗性，從而提高其產(chǎn)量和經(jīng)濟價值。例如PARK 等[24]使用dCas9-VP16-p65 激活目標基因AVP1 轉(zhuǎn)錄，使擬南芥積累更多的K+、Na+，提高了植物對干旱脅迫的耐受性。

除了通用的調(diào)控轉(zhuǎn)錄方法，CRISPR/dCas9 系統(tǒng)還可以與植物轉(zhuǎn)錄效應子結(jié)合，特異性地調(diào)控轉(zhuǎn)錄。植物特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子包含了植物獨有的、高效的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，在調(diào)節(jié)復雜的生物過程中起著核心作用。例如乙烯響應因子/乙烯響應元件結(jié)合蛋白（ERF/EREBP）家族包含的強激活結(jié)構(gòu)域EDLL 和阻遏結(jié)構(gòu)域SRDX，可以與dCas9 融合激活或抑制基因表達[25]。MORADPOUR 等[26]概述了目前促進植物中CRISPR 轉(zhuǎn)錄激活的3 種策略：（1）將各種激活劑與dCas9 串聯(lián)，較常用的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域包括dCas9-VP64、dCas9-EDLL 以及將兩者結(jié)合的dCas9-VP64-EDLL；（2）使用修飾的gRNA 支架來招募轉(zhuǎn)錄激活因子，多采用MS2 適配體插入sgRNA 的莖環(huán)形成新的gRNA 支架，構(gòu)建更強的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)；（3）使用多路轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)來同步激活植物中的多個基因，如LOWDER 等[27]開發(fā)的高激活效率CRISPR-Act2.0 系統(tǒng)，可以上調(diào)單子葉植物和雙子葉植物中的多個基因表達。

在抑制植物轉(zhuǎn)錄方面，以dCas9 結(jié)合阻遏結(jié)構(gòu)域SRDX 為主，目前已經(jīng)報告了擬南芥中和本塞姆氏煙草中利用dCas9-3xSRDX 抑制轉(zhuǎn)錄的實例[28-29]。

3.3 dCas9 在癌癥治療中的應用

癌癥是一種以癌基因和腫瘤抑制基因的多種遺傳和表觀遺傳改變?yōu)樘卣鞯募膊　＝陙?，癌癥治療策略已經(jīng)從手術轉(zhuǎn)向有針對性的精準醫(yī)療。除了遺傳異常外，表觀遺傳失調(diào)是癌癥的共同特征，其中，異常的DNA 甲基化和可逆的組蛋白修飾是與癌癥關聯(lián)最明顯的表觀遺傳改變，參與腫瘤的發(fā)生、分化和轉(zhuǎn)移[30]。CRISPR/dCas9 作為一種能定向進行表觀遺傳編輯的分子工具，可以逆轉(zhuǎn)表觀遺傳學修飾，在抗癌治療中頗有前景。用于表觀遺傳編輯的表觀遺傳效應子大致分為組蛋白和DNA 修飾劑，其酶促反應可以催化轉(zhuǎn)錄激活或抑制組蛋白/DNA 修飾。表觀遺傳編輯的第一種策略是僅使用催化結(jié)構(gòu)域來構(gòu)建表觀遺傳效應電路，以避免酶的共價變構(gòu)調(diào)節(jié)問題；第二種策略是在真核系統(tǒng)中利用原核DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶進行修飾[31]。

治療性sgRNA-dCas9 首先應用于體外細胞系。RAHMAN 等[32]總結(jié)了dCas9 對癌癥的體外作用：dCas9 通過與表觀遺傳效應子融合形成sgRNAdCAS9-EE，靶向乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌癌細胞的原癌基因（GRN、FHL2、CNKSR1）或抑癌基因（PTEN、BRCA1、CDKN2A、RASSF1、HIC1等），抑制腫瘤的侵襲和遷移。另一方面，CRISPR 系統(tǒng)的內(nèi)在機制決定了它只能在其靶細胞內(nèi)部發(fā)揮作用，可以通過物理方法、以腺病毒為代表的病毒載體或合成脂質(zhì)、聚合物和無機顆粒等非病毒載體這三種方法將sgRNA-dCas9 系統(tǒng)遞送到體內(nèi)。CRISPR/dCas9 的癌癥體內(nèi)治療中可分為三階段[33]：第一階段，藥物在血液循環(huán)過程中保持穩(wěn)定；第二階段，藥物在腫瘤組織中積累；第三階段，藥物進入癌細胞，從核內(nèi)體逸散到細胞質(zhì)，最后進入細胞核調(diào)節(jié)目標基因。同時，CRISPR/dCas9 與轉(zhuǎn)錄效應物融合后，可以與癌癥治療藥物聯(lián)合發(fā)揮作用，這些藥物的作用機制是調(diào)節(jié)癌基因和腫瘤抑制基因的表達或使多重耐藥基因失活[34]。兩者的協(xié)同作用或互補性可以增強治療效果。

4 結(jié)語

本文介紹了CRISPR/dCas9 系統(tǒng)的作用機制，總結(jié)了近年來CRISPR/dCas9 系統(tǒng)在基因組調(diào)控、表觀遺傳學修飾，以及其在基因組成像、植物研究、癌癥治療方面的實際應用。隨著修飾工具的優(yōu)化與開發(fā)，CRISPR/dCas9 在不同領域得到了更廣泛的應用。但CRISPR/dCas9 技術仍面領著挑戰(zhàn)，實際操作中依舊存在脫靶效應、sgRNA 設計、目標位點選擇和sgRNAdCas9 遞送系統(tǒng)方面的難題。隨著科學家對CRISPR系統(tǒng)原理的理解不斷深入，CRISPR/dCas9 技術會更為成熟，并在更多的領域中得到應用。