小鼠囊胚胞外囊泡對子宮內(nèi)膜上皮細胞E-cadherin和vimentin表達的影響

劉穎， 段乳俠， 張浩棟， 方廖瓊

小鼠囊胚胞外囊泡對子宮內(nèi)膜上皮細胞E-cadherin和vimentin表達的影響

劉穎， 段乳俠， 張浩棟， 方廖瓊△

（西南大學蠶桑紡織與生物質科學學院，重慶 400716）

探討小鼠囊胚細胞外囊泡（EVs）對小鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞（mEECs）上皮鈣黏素（E-cadherin）和波形蛋白（vimentin）表達的影響。以孕4.5 d的BABL/c小鼠囊胚為材料，利用超高速離心分離純化小鼠囊胚EVs，粒度儀分析粒徑，透射電子顯微鏡觀察形態(tài)，Western blot分析Tsg101和CD63的表達；酶消化結合差速貼壁篩選法制備原代mEECs，流式細胞術分析細胞角蛋白8（CK8）的陽性率鑒定mEECs純度。建立囊胚EVs與mEECs共培養(yǎng)模型，共聚焦顯微鏡觀察PKH26標記的囊胚EVs進入mEECs的形態(tài)過程，Western blot和細胞免疫化學法分析共培養(yǎng)中mEECs中E-cadherin和vimentin表達的變化。（1） 小鼠囊胚EVs平均粒徑（226.6±3.8） nm，表現(xiàn)囊泡超微形態(tài)，表達Tsg101和CD63蛋白標志物。（2） 原代mEECs形態(tài)均勻，CK8陽性細胞率80%以上。（3） 與0 h相比，mEECs與囊胚EVs共培養(yǎng)48和96 h時E-cadherin表達水平顯著降低（<0.01），vimentin表達水平顯著升高（<0.01）。小鼠囊胚EVs可下調(diào)E-cadherin表達，上調(diào)vimentin表達，誘導mEECs發(fā)生上皮-間充質轉化。

囊胚；細胞外囊泡；子宮內(nèi)膜上皮細胞；上皮-間充質轉化

上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）是上皮細胞失去其特性和形態(tài)，并獲得侵襲性間充質表型的復雜生物學過程［1］。在此過程中，上皮細胞黏附性下降，獲得遷移和侵襲的能力，轉變?yōu)殚g充質細胞。EMT過程中細胞主要表現(xiàn)為上皮鈣黏素（E-cadherin）、細胞角蛋白（cytokeratin， CK）等上皮細胞標志物的下調(diào)，以及神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）等間充質細胞標志物的表達上調(diào)［1-3］。

EMT參與胚胎植入和植入后復雜胚胎結構的形成等早期胚胎發(fā)育過程中［4］。受精卵發(fā)育至囊胚階段后，必須植入子宮內(nèi)膜才能在體內(nèi)繼續(xù)發(fā)育［5］。而胚胎的成功植入取決于可行的胚胎和子宮內(nèi)膜容受的同步性［6］，這種同步性是在胚胎與母體子宮內(nèi)膜的“crosstalk”中實現(xiàn)的。通過母-胎交互，母體子宮內(nèi)膜上皮細胞發(fā)生EMT，上皮細胞由原來的緊密連接轉變?yōu)樗缮⒌倪B接，子宮內(nèi)膜表現(xiàn)出對胚胎的容受性狀態(tài)，提供胚胎植入的窗口［7］。

細胞外囊泡（extracellular vesicles， EVs）是一種細胞間通訊的重要媒介。源細胞釋放這種包含蛋白質、DNA、mRNA、miRNA、lncRNA、細胞因子等多種生物活性物質、直徑約100～1 000 nm的脂質雙分子膜囊泡［8］，可與靶細胞結合［9］，參與靶細胞增殖、遷移、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學過程［10］。有研究表明，來自高轉移腫瘤細胞［11］和子宮內(nèi)膜異位癥組織［12］的EVs可以介導受體細胞的子宮內(nèi)膜上皮細胞發(fā)生EMT，并觀察到不同物種的植入前胚胎分泌EVs且具有調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜局部免疫的能力［13-14］。

現(xiàn)已證實，人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin， hCG）［15］、多種細胞因子、生長因子［16］及Wnt信號通路［17］等參與了母-胎交互過程，但母體與胚胎交流的具體機制仍未完全闡明。因此我們推測囊胚EVs可能在胚胎著床過程的“母胎對話”中發(fā)揮胚胎信使的作用，影響子宮內(nèi)膜上皮細胞的生物學行為，以利于胚胎植入。本研究提取原代小鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞（mouse endometrial epithelial cells， mEECs）和囊胚EVs，通過對共培養(yǎng)體系中E-cadherin和vimentin的檢測，驗證小鼠囊胚EVs誘導mEECs發(fā)生EMT的可能性。

材料和方法

1　動物

SPF級BALB/c小鼠，10～12周齡，體重21 g左右，共300只（雌鼠200只，雄鼠100只），在獨立通氣籠具系統(tǒng)條件下喂養(yǎng)，由重慶醫(yī)科大學動物中心提供，許可證號：SYXK（渝）2018-0003。腹腔注射孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin， PMSG；每只10 U）45 h后繼續(xù)注射hCG（每只10 U），雌鼠與雄鼠按2∶1分別配對過夜；檢測陰栓為懷孕，此時記為D1，繼續(xù)培養(yǎng)至D4.5，用于后續(xù)提取囊胚EVs的實驗。

2　主要試劑及儀器

分散酶II和胰蛋白酶購自Roche；子宮內(nèi)膜上皮細胞專用培養(yǎng)基購自Gbico；PMSG和hCG購自寧波三生藥業(yè)有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）和0.25%胰蛋白酶購自HyClone；雙抗、FITC標記的山羊抗兔Ⅱ抗、HRP標記的山羊抗兔Ⅱ抗、Hanks平衡鹽溶液（Hanks' balanced salt solution， HBSS）、BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗小鼠E-cadherin、vimentin、CK8、腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101， Tsg101）、CD63和GAPDH單克隆抗體購自Abcam。

熒光倒置顯微鏡購自Olympus；透射電子顯微鏡購自Hitachi；激光共聚焦顯微鏡購自Leica；粒度分析儀購自Malvern；流式細胞分析儀購自Beckman Coulter；CO2培養(yǎng)箱購自Shel-Lab。

3　主要方法

3.1原代mEECs分離純化將10～12周齡的健康BABL/c雌鼠的子宮內(nèi)膜剪成約2 cm長的片段，加入消化液（4 mL HBSS+0.5 mL 50 g/L分散酶II+0.5 mL 60 g/L胰蛋白酶）4 ℃消化90 min，室溫消化30 min，加入2 mL完全培養(yǎng)液（含10% FBS和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液）終止消化；子宮內(nèi)膜片段轉移至新的含5 mL HBSS的培養(yǎng)皿中涮洗20 s；加0.5 mL 5% BSA，靜置5 min；取上清，繼續(xù)靜置7 min；棄上清，加入2 mL HBSS靜置7 min；棄上清，加入完全培養(yǎng)液將細胞懸液在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；30 min后將細胞培養(yǎng)懸液轉移至新的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，所得即是mEECs。

3.2細胞免疫熒光染色檢測CK8、E-cadherin和vimentin表達制作原代mEECs爬片，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定10 min；PBS清洗2次，加入Triton X-100通透液通透10 min；PBS清洗3次后，5% BSA室溫封閉1 h；加入兔抗小鼠CK8單克隆抗體4 ℃孵育過夜，然后Ⅱ抗37 ℃避光孵肓1 h；DAPI染色15 min，PBS清洗3次后加入抗熒光淬滅劑封片觀察。在48孔板中提前放入細胞爬片，接種mEECs（1×109cells/cm2），細胞貼壁后加入30 μL囊胚EVs懸液；細胞免疫熒光檢測共培養(yǎng)0、48和96 h時E-cadherin和vimentin的表達，步驟同上。

3.3流式細胞術檢測CK8陽性率用胰酶消化mEECs，用完全培養(yǎng)液配成1×106mL-1的細胞懸液，4%多聚甲醛室溫固定30 min；300×離心5 min，沉淀用PBS清洗2次；300×離心5 min，棄上清加入兔抗小鼠CK8單克隆抗體4 ℃孵育過夜；300×離心5 min，沉淀用PBS清洗2次；300×離心5 min，棄上清加入Ⅱ抗室溫避光孵育20 min；PBS清洗細胞2次，300×離心5 min；PBS重懸細胞后流式細胞儀檢測。

3.4囊胚EVs制備與鑒定收集200個D4.5的BABL/c小鼠囊胚，紅細胞裂解液室溫裂解15 min，PBS洗3次后加入pH 2.5的HCl，透明帶消失后加入2 mL胰酶，37 ℃恒溫搖床消化30 min；10% FBS（去囊泡）中止消化；4 ℃、300×離心15 min，取上清；4 ℃、2 000×離心15 mim，上清過濾后4 ℃、50 000×離心70 min，收集沉淀1；上清繼續(xù)4 ℃、100 000×離心70 min，收集沉淀2；PBS混合沉淀1、2，得到囊胚EVs。

PBS稀釋囊胚EVs為1×1010mL-1，取10 μL包埋銅網(wǎng)，過夜晾干，透射電鏡觀察囊胚EVs形態(tài)，參考吳偉東等［18］的操作方法。PBS稀釋囊胚EVs為1×1012mL-1，比色皿內(nèi)加入1 mL，Malvern粒度儀檢測囊胚EVs的粒徑分布。提取囊胚EVs蛋白，Western blot檢測Tsg101和CD63蛋白表達，步驟見3.6。

3.5囊胚EVs與mEECs共培養(yǎng)及形態(tài)觀察對囊胚EVs進行PKH26染色，7 min后加入FBS終止染色，4 ℃、100 000×離心70 min，收集被染色的囊胚EVs沉淀，30 μL PBS重懸，與第2代的mEECs共培養(yǎng)（1×109/cm2）。在0和96 h時，加入DAPI染細胞核，激光共聚焦顯微鏡下觀察囊胚EVs進入mEECs的情況。

3.6Western blot檢測E-cadherin和vimentin表達30 μL EVs懸液和1×109cells/cm2的mEECs共培養(yǎng)0、48和96 h后，分別加入含羅氏蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；變性后取5 μg總蛋白樣品進行SDS-PAGE；120 V，轉膜60 min，TBST緩沖液清洗PVDF膜3次，5% BSA封閉，加入兔抗小鼠E-cadherin和vimentin單克隆抗體，4 ℃孵育過夜；加入HRP標記的Ⅱ抗，孵育2 h。清洗后ECL法顯色，以GAPDH為內(nèi)參照，采用ImageJ軟件進行灰度分析。

4　統(tǒng)計學處理

用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。實驗均重復3次。

結果

1　mEEC分離純化結果

分散酶II與胰蛋白酶消化后差速貼壁得到的細胞懸液先培養(yǎng)30 min，此時貼壁的為雜細胞，而mEECs未貼壁（圖1A）；繼續(xù)將未貼壁細胞轉移至新的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3 h，有形狀橢圓如鵝卵石的上皮細胞貼壁，雜細胞較少（圖1B）。培養(yǎng)2 d后，mEECs長滿培養(yǎng)皿的90%。

Figure 1. Morphological changes of isolated and purified mEECs after 30 min （A； scale bar=20 μm） and 3 h （B； scale bar=200 μm） of incubation.

接著對分離純化得到的mEECs進行細胞免疫熒光染色和流式細胞術，檢測上皮細胞標志物CK8的表達。DAPI染胞核，呈藍色熒光；胞質內(nèi)的CK8蛋白呈綠色熒光；綠色熒光包裹藍色熒光的細胞被認為是mEECs，只有藍色熒光的是雜細胞。如圖2所示，mEECs的胞核被綠色熒光包圍，純度很高，雜細胞很少，且形態(tài)均勻。流式細胞術檢測CK8的陽性率可達80%左右（圖3）。這說明通過分散酶II與胰蛋白酶消化后差速貼壁的方法得到了純度高、形態(tài)均勻且可用于后續(xù)實驗的原代mEECs。

Figure 2. The expression of CK8 detected by cellular immunofluorescence staining （scale bar=20 μm）.

Figure 3. The positive rate of CK8 detected by flow cytometry.

2　囊胚EVs的鑒定結果

光學顯微鏡觀察植入前的囊胚形態(tài)，可見明顯囊胚腔及其內(nèi)細胞團，外層為滋養(yǎng)層細胞（圖4A）。透射電鏡顯示小鼠囊胚EVs呈典型的圓球狀，可見脂質雙分子層（圖4B）。EVs表達CD63和Tsg101這2種標志蛋白（圖4C）。EVs的粒徑大部分在115～255 nm之間，主要集中在112和185 nm處，平均粒徑為226.6 nm（圖4D）。

Figure 4. Identification results of blastocyst EVs. A： morphological changes of mouse blastocyst observed by microscopy （scale bar=25 μm）； B： transmission electron microscopy showed typical round spherical shape of mouse blastocyst EVs （scale bar=2 μm）； C： protein expression of Tsg101 and CD63 （markers of EVs） detected by Western blot； D： nanoparticle size detection of blastocyst EVs.

3　mEEC攝入囊胚EVs

激光共聚焦顯微鏡觀察共培養(yǎng)體系中mEECs攝取囊胚EVs的過程，0 h時只可見藍色熒光，囊泡還未進入mEECs中聚集；96 h后紅色熒光周圍包裹著藍色熒光，說明mEECs胞核被囊胚EVs包圍，見圖5。

Figure 5. Fluorescence staining results of mEECs co-cultured with PKH26-prestained blastocyst EVs for 0 and 96 h（scale bar=20 μm）.

4　囊胚EVs降低mEECs中E-cadherin表達，誘導vimentin表達

將囊胚EVs與mEECs共培養(yǎng)，分別收集培養(yǎng)了0、48和96 h的mEECs，提取總蛋白，進行Western blot檢測；同時制作共培養(yǎng)體系中的mEECs爬片，細胞免疫熒光染色進行檢測。Western blot（圖6A、7A）和細胞免疫熒光染色（圖6B、7B）結果均顯示，隨著培養(yǎng)時間的增加，E-cadherin的表達顯著下降，vimentin的表達顯著上升（與0 h相比，均0.01）。

Figure 6. Results of E-cadherin expression by mEECs in co-culture system. A： Western blot； B： cellular immunofluorescence staining （scale bar=5 μm）. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs 0 h.

Figure 7. Results of vimentin expression by mEECs in co-culture system. A： Western blot； B： cellular immunofluorescence staining （scale bar=5 μm）. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs 0 h.

討論

EVs是細胞膜向外出芽形成的小囊泡［19］。Tsg101是囊泡發(fā)生相關蛋白［20］；CD63屬于四跨膜蛋白超家族，是EVs中最重要的進化保守蛋白［21］。對EVs的鑒定主要包括大小、形態(tài)、特異性蛋白、濃度等。但納米粒子跟蹤分析法結合透射電子顯微鏡仍然是鑒定EVs的主流方法［22］。我們將從D4.5孕鼠子宮腔中得到的囊胚，經(jīng)紅細胞裂解液洗滌、稀鹽酸酸解、胰酶消化后，采用超高速差速離心制備出平均粒徑為（226.6±3.8） nm的微粒，透射電鏡觀察微粒呈脂質雙分子膜圓球狀，直徑集中分布在112和185 nm處并且表達囊泡特異性蛋白CD63和Tsg101。這些結果從形態(tài)、超微結構及特異性蛋白表達，均顯示小鼠囊胚EVs的存在，且與牛［23］、豬［24］、鼠［14］及人［25］等不同物種的胚胎囊泡表現(xiàn)出結構的相似性，而這些囊泡在妊娠早期胚胎與母體的相互作用中發(fā)揮重要作用［26］。

CK8常表達于單純上皮細胞，并被用于子宮內(nèi)膜上皮細胞的鑒定。目前還缺乏理想的子宮內(nèi)膜上皮細胞模型，原代提取的方法也不夠成熟和統(tǒng)一。子宮內(nèi)膜上皮細胞的分離純化，一般采用組織塊分離法和酶消化法從子宮內(nèi)膜獲得。組織塊分離法所需時間長，不易形成單層貼壁細胞，難得到純度高的子宮內(nèi)膜上皮細胞［27］。而僅通過一種酶進行消化，由于組織來源不同，難以控制消化時間，雜細胞較多［28］。本研究采用分散酶II與胰蛋白酶共同作用并且控制時間消化子宮內(nèi)膜上皮細胞，因為子宮內(nèi)膜上皮細胞與基質細胞對胰蛋白酶的耐受性不同［29］，胰蛋白酶短時間作用時基質細胞會先消化下來。后續(xù)純化過程，則是利用基質細胞會比上皮細胞先貼壁生長的特點，重復幾次貼壁后取細胞懸液培養(yǎng)。細胞免疫熒光染色直觀顯示CK8的表達，結合流式細胞術檢測CK8陽性率達到80%以上，并且細胞形態(tài)均勻呈橢圓形，貼壁生長狀態(tài)良好。所以，分散酶II與胰蛋白酶消化后差速貼壁是一種良好的分離純化原代子宮內(nèi)膜上皮細胞的方法。

E-cadherin屬于Ⅰ類經(jīng)典鈣黏素，是跨膜糖蛋白的一種，介導上皮細胞之間的黏附，對維持細胞連接有重要作用［30］。EMT往往表現(xiàn)為E-cadherin表達的缺失［31-32］。vimentin是間充質細胞標志蛋白，是中間纖維蛋白家族的一員，具有維持細胞骨架的作用［33］，細胞vimentin表達的上調(diào)也被認為是EMT的分子標志［34］。我們檢測到，隨著與小鼠囊胚EVs共培養(yǎng)時間的增加，mEECs表達E-cadherin水平顯著下降（0.01），表達vimentin能力顯著上升（0.01），提示mEECs發(fā)生EMT。子宮內(nèi)膜上皮細胞的間充質轉化是胚胎植入過程中的重要事件，子宮內(nèi)膜上皮細胞的細胞骨架發(fā)生改變，細胞間連接松散，有利于囊胚的滋養(yǎng)層細胞的侵入和黏附［35］。

本項工作采用分散酶II與胰蛋白酶消化、差速貼壁篩選，獲得純化的原代mEECs；觀察到植入前小鼠囊胚EVs的存在；在與小鼠囊胚EVs共培養(yǎng)體系中，mEECs表達E-cadherin能力下降，表達vimentin能力增加，以利于胚胎植入。我們推測，囊胚EVs能夠促進子宮內(nèi)膜上皮細胞發(fā)生EMT，這或許是胚胎植入過程中胚胎與母體子宮上皮交互“對話”的結果。

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Mouse blastocyst-derived extracellular vesicles regulate expression of E-cadherin and vimentin in endometrial epithelial cells

LIU Ying， DUAN Ruxia， ZHANG Haodong， FANG Liaoqiong△

（，，，400716，）

To find out whether the extracellular vesicles （EVs） secreted by mouse blastocysts affect the expression of E-cadherin and vimentin in mouse endometrial epithelial cells （mEECs）.A female mouse uterus was utilized to gather mouse blastocysts on day 4.5 of pregnancy. Transmission electron microscopy， Western blot， and nanoparticle tracking were applied to describe the EVs. Enzyme digestion and differential adhesion screening were applied to obtain primary mEECs. Flow cytometry was used to quantify the proportion of mEECs that were positive for cytokeratin 8 （CK8）. The morphological processes of EVs labeled by PKH26 into mEECs were observed by fluorescence confocal microscopy. Western blot and cellular immunofluorescence were utilized to evaluate the expression of E-cadherin and vimentin of mEECs in co-culture system.The mean particle size of EVs was （226.6±3.8） nm and characterized with Tsg101 and CD63 proteins. The primary mEECs labeled with CK8 were enriched， with a positive rate of more than 80%. After 48 and 96 h of co-culture with EVs， mEECs expressed significantly lower levels of E-cadherin and significantly higher levels of vimentin （<0.01）.Mouse blastocyst EVs may induce epithelial-mesenchymal transition of mEECs by decreasing E-cadherin expression and increasing vimentin expression.

blastocyst； extracellular vesicles； endometrial epithelial cells； epithelial-mesenchymal transition

R329.2+8； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.017

1000-4718（2023）02-0345-07

2022-09-02

2022-12-03

Tel： 023-68250171； E-mail： lqfang06@163.com

（責任編輯：盧萍，羅森）