酶聯(lián)免疫雙抗原夾心法檢測(cè)HCV抗體的應(yīng)用與分析

孫鵬 嵇俊

丙型肝炎是由丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）引起的一種以肝損害為主的一組全身性傳染病疾病,其可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌，給患者的生命安全帶來了嚴(yán)重的威脅[1]。我國(guó)是丙型肝炎的高流行區(qū)，傳播途徑以輸血、針刺及吸毒等方式為主，其中輸血傳播較常見，經(jīng)輸血、血液制品傳播疾病[2-3]，流行病學(xué)顯示，此病在全球中感染率約占3%，感染者約有2億人，每年新發(fā)丙型肝炎病例約3.5萬例，其中50%～80%的感染者無明顯癥狀并可進(jìn)展為慢性感染，20%的感染者最終可進(jìn)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌[4-6]。且由于患病率逐年升高，已成為嚴(yán)重的社會(huì)、公共衛(wèi)生問題。由于目前尚無疫苗和特效藥物，對(duì)無償獻(xiàn)血人群進(jìn)行的篩查和早期診斷已成為控制臨床輸血性丙型肝炎傳播的重要手段。血站目前普遍采用第三代間接法檢測(cè)抗-HCV，該方法檢測(cè)能力雖有所提高，但在靈敏度、特異性以及檢測(cè)窗口期方面仍存在明顯不足，如何進(jìn)一步提高酶聯(lián)免疫法HCV抗體的檢測(cè)效能，成為采供血機(jī)構(gòu)亟待解決的問題之一。有鑒于此，實(shí)驗(yàn)室擬對(duì)優(yōu)化的第四代雙抗原夾心法HCV抗體檢測(cè)試劑進(jìn)行驗(yàn)證，并在實(shí)踐中加以引進(jìn)和應(yīng)用?，F(xiàn)將工作匯報(bào)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對(duì)象為，（1）選擇2020年10月13日—2021年12月31日在淮安市中心血站無償獻(xiàn)血陰性樣本83 209例，2020年第三代試劑抗-HCV單試劑陽性而HCV-RNA檢測(cè)陰性標(biāo)本28例，合計(jì)83 237例。（2）11例陽性樣本:經(jīng)江蘇省血液中心確認(rèn)抗-HCV為陽性歸隊(duì)樣本5例；HCV抗體酶免陰性而HCV-RNA陽性樣本2例；2020年衛(wèi)健委臨檢中心測(cè)評(píng)HCV-RNA陽性樣品4例，合計(jì)11例。（3）北京康徹思坦丙型肝炎病毒抗體性能驗(yàn)證血清盤精密度樣本24例，陰性及陽性樣本各20例。

1.2 方法

（1）采用試劑盒內(nèi)的陰、陽性對(duì)照和抗-HCV質(zhì)控品，在不低于10 d試驗(yàn)運(yùn)行前提下，累計(jì)進(jìn)行至少20批次常規(guī)檢測(cè)，每批次試驗(yàn)包括空白對(duì)照1孔，陽性對(duì)照2孔，陰性對(duì)照3孔，室內(nèi)質(zhì)控1孔，匯總各批數(shù)據(jù)分析其重復(fù)性。（2）取參考血清盤中精密性樣品（0.1 NCU/mL），在不低于10 d試驗(yàn)運(yùn)行的前提下，累計(jì)進(jìn)行24次常規(guī)檢測(cè)；將上述標(biāo)本插入常規(guī)標(biāo)本序列，一批內(nèi)進(jìn)行24次檢測(cè)。匯總各組數(shù)據(jù)，計(jì)算其批間、批內(nèi)精密度。（3）取參考血清盤中已知血清狀態(tài)標(biāo)本共40份，插入常規(guī)檢測(cè)，匯總數(shù)據(jù)計(jì)算其敏感性、特異性和準(zhǔn)確度。（4）取江蘇省血液中心新近確認(rèn)HCV核酸陽性歸隊(duì)標(biāo)本、以往HCV酶免陰性而核酸陽性標(biāo)本、2020年衛(wèi)健委室間質(zhì)評(píng)核酸陽性標(biāo)本，共計(jì)11例作為HCV抗體確證陽性試驗(yàn)組；取原第三代酶免試劑陽性而核酸陰性標(biāo)本、本室2020年10月13日—2021年12月無償獻(xiàn)血者陰性樣本，二者共計(jì)83 237例（以核酸檢測(cè)結(jié)果為確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)），作為HCV抗體確證陰性試驗(yàn)組。匯總各組檢測(cè)結(jié)果并做統(tǒng)計(jì)分析。

儀器與試劑：加樣設(shè)備為Microlab Star全自動(dòng)加樣儀，由瑞士哈美頓博納圖斯股份公司提供。全自動(dòng)酶聯(lián)免疫后處理系統(tǒng)為FAME24/20，由瑞士哈美頓博納圖斯股份公司提供。均定期檢定校驗(yàn)合格。

北京萬泰雙抗原夾心法酶聯(lián)免疫抗-HCV檢測(cè)試劑（批號(hào)CS20200708、CS20200810、CS20201114、CS20210101、CS20210507、CS20210810）、廈門新創(chuàng)間接法酶聯(lián)免疫抗-HCV檢測(cè)試劑（批號(hào)2019125825）、上?？迫A間接法酶聯(lián)免疫抗-HCV檢測(cè)試劑（批號(hào)202002041、202008121、202008141、202102041、202106151）。北京康徹思坦室內(nèi)質(zhì)控品（抗-HCV含量0.05 NCU/mL，批號(hào): 202005010、202007002、202107013）、北京康徹思坦肝炎病毒抗體性能驗(yàn)證血清盤（批號(hào)J202004002），均按照使用說明要求操作并在有效期內(nèi)使用。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）樣品反應(yīng)孔吸光度值（absorbance，A）＜臨界值（cut off，CO），判為HCV抗體陰性；樣品反應(yīng)孔A值≥臨界值（cut off，CO），判為HCV抗體陽性。

（2）重復(fù)性試驗(yàn)符合率=樣本實(shí)際陰性（陽性）數(shù)/血清盤確認(rèn)陰性（陽性）數(shù)×100%；精密度試驗(yàn)以樣本吸光度值/臨界值（S/CO）作為統(tǒng)計(jì)觀察指標(biāo)，計(jì)算S/CO均值和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。

本文參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《血站技術(shù)操作規(guī)程（2019 版）》中關(guān)于重復(fù)性和精密度試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行：重復(fù)性試驗(yàn)可接受標(biāo)準(zhǔn)為20次檢測(cè)結(jié)果不能出現(xiàn)大于1次陰性陽性對(duì)照不符合生產(chǎn)商要求；精密性試驗(yàn)可接受標(biāo)準(zhǔn)為批內(nèi)變異系數(shù)應(yīng)在15%以內(nèi)，批間變異系數(shù)應(yīng)在20%以內(nèi)；

（3）敏感性=真陽性例數(shù)/診斷金標(biāo)準(zhǔn)陽性例數(shù)×100%；特異性=真陰性例數(shù)/診斷金標(biāo)準(zhǔn)陰性例數(shù)×100%；準(zhǔn)確度=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%；陽性檢出率=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性檢出率=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陰、陽性對(duì)照重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

由陰、陽性對(duì)照重復(fù)試驗(yàn)可知：60孔陰性對(duì)照A值均≤0.1，符合率達(dá)到100%；40孔陽性對(duì)照OD值均≥0.80，符合率達(dá)到100%。此外，20孔空白對(duì)照在正常試驗(yàn)條件下未出現(xiàn)異常的顯色或波動(dòng)，符合率達(dá)到100%；20孔室內(nèi)質(zhì)控血清的吸光度值/臨界值也均處于2～5之間。說明第四代試劑在本室的應(yīng)用能夠較好地滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 批內(nèi)、批間精密度試驗(yàn)結(jié)果

參考血清盤精密性樣品（0.1 NCU/mL），按既定方案進(jìn)行批內(nèi)和批間精密度試驗(yàn)，批內(nèi)和批間精密度均符合血站技術(shù)操作規(guī)程（2019）版相關(guān)規(guī)定，詳見表1。

表1 批內(nèi)和批間試驗(yàn)樣本S/CO數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

2.3 敏感性、特異性試驗(yàn)結(jié)果

取參考血清盤中已明確血清狀態(tài)的陰、陽標(biāo)本共40份，插入常規(guī)標(biāo)本一同檢測(cè)，共檢出20份陰性和20份陽性結(jié)果，與參考血清盤真值符合率達(dá)100%。同時(shí)，按照單一檢測(cè)方法2×2四格表資料統(tǒng)計(jì)，分別計(jì)算其敏感性和特異性，均為100%。說明該試劑盒在對(duì)各濃度參考學(xué)清樣本具有很好的檢出與鑒別能力。

2.4 第四代與第三代試劑平行比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比對(duì)

經(jīng)第四代與第三代試劑的平行比對(duì)，其中陽性對(duì)照組11例，第四代試劑陽性檢出率為81.82%，第三代試劑陽性檢出率為27.27%，第四代試劑敏感性明顯高于第三代試劑，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.342，P＜0.05）；陰性對(duì)照組83 237例，第四代試劑陰性檢出率為99.99%，第三代試劑陰性檢出率為99.88%，第四代試劑特異性為99.99%，高于第三代的99.88%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=32.238，P＜0.05）。以上數(shù)據(jù)說明第四代試劑較第三代試劑在靈敏度和特異性等核心指標(biāo)方面均表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。詳見表2。

表2 第四代與第三代試劑平行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)（例）

3 討論

丙型肝炎是丙肝病毒主要通過輸血及血制品傳播導(dǎo)致的一種嚴(yán)重傳染性疾病，為達(dá)到控制輸血傳播HCV、保障臨床供血安全的目標(biāo)，必須采用敏感準(zhǔn)確的方法對(duì)無償獻(xiàn)血的血樣進(jìn)行相關(guān)篩查。酶免疫分析（enzyme immunoassay，EIA）方法作為HCV抗體檢測(cè)的重要手段，之前曾歷經(jīng)三代的技術(shù)發(fā)展。最早由美國(guó)Chiron公司于20世紀(jì)80年代末利用丙肝病毒抗原重組C100-3融合蛋白，構(gòu)建出首代HCV抗體檢測(cè)方法。它可在感染丙肝病毒12～26周后檢測(cè)出抗體，但因其僅針對(duì)非編碼抗原NS4區(qū)域設(shè)計(jì)，造成特異性差、靈敏度也較低。90年代初，出現(xiàn)以丙肝病毒抗原NS3區(qū)C33C與NS4區(qū)融合表達(dá)抗原C200、合并C區(qū)核心抗原C22-3作固相包被的第二代HCV抗體檢測(cè)試劑盒。它彌補(bǔ)了首代方法的部分不足，使HCV抗體檢測(cè)的敏感性和特異性有所提高。研究顯示，其檢出率較首代檢測(cè)方法提高5%～40%，同時(shí)由于抗C33C比抗C100-3早出現(xiàn)30～90 d，可使窗口期進(jìn)一步縮短至10周左右。進(jìn)入21世紀(jì)，國(guó)內(nèi)的采供血機(jī)構(gòu)已經(jīng)普遍采用第三代酶聯(lián)免疫間接法檢測(cè)HCV抗體，它是在第二代的基礎(chǔ)上，增加了一個(gè)非編碼抗原NS5，不僅提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性，還令檢驗(yàn)窗口期又縮短了1周左右?？傮w而言，這些EIA檢測(cè)抗體技術(shù)兼具價(jià)格低廉、快捷簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，但基于方法學(xué)上的缺陷，其不可避免易受諸多因素的影響，如試劑抗原、抗體與酶結(jié)合物不純；獻(xiàn)血者血樣溶血或有高免疫蛋白、類風(fēng)濕因子和超氧化物歧化酶等的存在；操作過程中加樣時(shí)間、孵育狀態(tài)、震蕩程度、洗板效果等因素的波動(dòng)均會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的偏差。尤其需要關(guān)注的是其窗口期問題，由于丙肝病毒從感染到抗體產(chǎn)生期限較長(zhǎng)，造成其血清轉(zhuǎn)陽時(shí)間也偏長(zhǎng)，需進(jìn)一步縮短檢出周期才能切實(shí)減少威脅輸血安全的隱患[8-10]。

血站目前普遍采用第三代間接法檢測(cè)抗-HCV?？茖W(xué)研究表明，人體感染丙肝病毒后，機(jī)體出現(xiàn)的生理性免疫學(xué)反應(yīng)具有一定的規(guī)律，由于IgG類抗體出現(xiàn)的時(shí)間遲緩,造成目前采用酶聯(lián)免疫間接法來檢測(cè)的第三代HCV抗體試劑，對(duì)早期感染者采集的血樣不夠敏感，且眾多的干擾因素，還會(huì)導(dǎo)致一定的假陽性。西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院就曾對(duì)獻(xiàn)血者中經(jīng)2個(gè)廠家試劑ELISA HCV抗體試劑進(jìn)行檢測(cè)為陽性的137份樣本進(jìn)行重組免疫印跡法確證，假陽性率高達(dá)35.29%[11]。本次研究所涉及的酶免雙抗原夾心法HCV抗體檢測(cè)試劑，采用基因工程重組表達(dá)抗原作為原料取代原先使用的酶標(biāo)二抗，提高了檢測(cè)特異性，隨著灰區(qū)和假陽性標(biāo)本的大量減少，避免了不必要的獻(xiàn)血資源的浪費(fèi)及醫(yī)療糾紛。其次，該試劑在間接法檢測(cè)IgG的基礎(chǔ)上，增加了針對(duì)IgM類抗體的檢測(cè)，由于IgM在人體的免疫反應(yīng)中早于IgG出現(xiàn)，這樣就可使窗口期提前7～30 d；同時(shí)，借助生物素-親和素級(jí)聯(lián)放大技術(shù)也提高了檢測(cè)靈敏度，其最低檢出限可達(dá)0.2 NCU/mL，降低了丙肝病毒的傳播風(fēng)險(xiǎn)；另外，雙抗原夾心法HCV抗體檢測(cè)利用對(duì)抗體進(jìn)行兩次特異性反應(yīng)，形成包被抗原-抗體-標(biāo)記抗原復(fù)合物，可降低間接酶聯(lián)免疫吸附法引起的假陽性[12]；其加樣量由間接法的10 μL提高到50 μL，避免掛針等造成的誤差，保證了實(shí)驗(yàn)操作的穩(wěn)定性和檢測(cè)的重復(fù)性，也降低輸血的風(fēng)險(xiǎn)以及血液篩查的成本。

綜上所述，在目前血站行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為開展核酸檢測(cè)同時(shí)至少進(jìn)行1次血清學(xué)檢測(cè)，且采用先血清學(xué)檢測(cè)再對(duì)陰性標(biāo)本進(jìn)行核酸篩查的檢驗(yàn)策略為背景下,通過本次研究并立足長(zhǎng)遠(yuǎn)考量，不管是對(duì)雙抗原夾心法HCV抗體檢測(cè)試劑自身精密度、重復(fù)性、敏感性、特異性、抗干擾性以及最低檢出限的驗(yàn)證，還是與第三代酶免間接法HCV抗體試劑的比對(duì)，均顯示出雙抗原夾心法HCV抗體檢測(cè)試劑優(yōu)越的檢測(cè)性。選擇酶免雙抗原夾心法HCV抗體檢測(cè)試劑相較于第三代酶免間接法試劑，不僅靈敏度高，能有效降低傳播風(fēng)險(xiǎn)，而且假陽性少，可減少不必要的血液資源浪費(fèi)，避免給獻(xiàn)血者帶來無謂的心理負(fù)擔(dān)，在一定程度上減少獻(xiàn)血者的流失。此外，應(yīng)用雙抗原夾心法HCV抗體檢測(cè)試劑也能更好地整合并發(fā)揮血清學(xué)與核酸聯(lián)檢的效能，進(jìn)一步促進(jìn)無償獻(xiàn)血工作的開展、提高臨床用血安全的保障水平。