質(zhì)譜鑒定聯(lián)合直接快速藥敏試驗(yàn)在細(xì)菌血流感染中的應(yīng)用

張小云，劉 本，連建春，姜玉章，唐朝貴，王 霞

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安一院檢驗(yàn)科，江蘇 淮安 223300）

血流感染（blood stream infection，BSI）是臨床常見(jiàn)的嚴(yán)重感染性疾病，具有起病急、病死率高的特點(diǎn)[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2-5]，早期適當(dāng)?shù)目咕幬镏委熆梢愿纳蒲鞲腥净颊叩念A(yù)后，而每延遲1 h 治療，患者死亡率會(huì)增加9%，而血培養(yǎng)為診斷血流感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其血液培養(yǎng)陽(yáng)性的周轉(zhuǎn)時(shí)間（turn-around time，TAT），即抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)報(bào)告結(jié)果是72～96 h。因此，改進(jìn)方法縮短微生物鑒定和藥敏試驗(yàn)的報(bào)告時(shí)間是目前微生物學(xué)檢驗(yàn)面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。研究發(fā)現(xiàn)[6]，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)可對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行快速直接鑒定且具有較高的準(zhǔn)確性。歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)（EUCAST）已經(jīng)提出了抗微生物快速藥敏試驗(yàn)（rapid drug sensitivity test，RAST），該方法是從陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中取出標(biāo)本直接進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[7，8]。本研究應(yīng)用MALDI-TOF MS 對(duì)細(xì)菌進(jìn)行快速菌種鑒定，同時(shí)參考EUCAST 中血培養(yǎng)RAST 方法對(duì)腸桿菌目細(xì)菌和銅綠假單胞菌的血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并將結(jié)果與常規(guī)細(xì)菌鑒定和MIC 藥敏結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，為建立血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本快速鑒定及藥敏試驗(yàn)方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安一院檢驗(yàn)科微生物室2021 年8 月-2022 年3 月血培養(yǎng)報(bào)警陽(yáng)性標(biāo)本共133 份（報(bào)警時(shí)間＜48 h），將同一人的同一天報(bào)警的重復(fù)標(biāo)本及2 種以上菌混合感染的標(biāo)本剔除。

1.2 儀器試劑 Bactec FX 全自動(dòng)血培養(yǎng)儀和血培養(yǎng)瓶（美國(guó)BD 公司）、真空采血管（浙江龔東醫(yī)療器械有限公司）、基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀質(zhì)譜儀（法國(guó)生物梅里埃有限公司）、瓊脂培養(yǎng)基（鄭州安圖生物工程股份有限公司）、藥敏紙片（賽默飛世爾科技＜中國(guó)＞有限公司）、細(xì)菌培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技＜中國(guó)＞有限公司）；全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK2 Compact（法國(guó)梅里埃生物有限公司）、離心機(jī)（賽默飛世爾科技＜中國(guó)＞有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本快速鑒定及藥敏試驗(yàn)①Vitek MS快速鑒定細(xì)菌：血培養(yǎng)瓶陽(yáng)性報(bào)警后，取出血培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色，當(dāng)鏡下顯示單一革蘭陰性桿菌時(shí)取1 ml 陽(yáng)性血培養(yǎng)標(biāo)本置于1.5 ml EP管，離心管中加入200 μl 5% SDS 溶液充分混勻，13 000 r/min 離心2 min，棄去上清液，加入1000 μl無(wú)菌蒸餾水，充分混勻管內(nèi)懸液，13 000 r/min 離心2 min，棄去上清液，得到沉淀，取0.5 μl 沉淀點(diǎn)樣至金屬靶板，加1 μl 基質(zhì)液，待靶板干燥后進(jìn)行快速鑒定，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC8739 與產(chǎn)氣腸桿菌ATCC13048；②陽(yáng)性血培養(yǎng)液RAST 快速藥敏鑒定：以質(zhì)譜快速鑒定結(jié)果為革蘭陰性細(xì)菌的血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本作為RAST 的研究對(duì)象。參考2018 年EUCAST 公布的陽(yáng)性血培養(yǎng)液RAST 方法[9]，從血培養(yǎng)瓶中直接吸取100 μl 培養(yǎng)液至直徑90 mm 的M-H 平板上，均勻涂布平板后貼上抗菌藥物紙片。質(zhì)譜快速鑒定為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的藥敏紙片包括慶大霉素（CN，10 μg）、頭孢噻肟（CTX，5 μg）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP，36 μg/6 μg）、頭孢他啶（CAZ，10 μg）、美羅培南（MEN，10 μg）、阿米卡星（AK，30 μg）、環(huán)丙沙星（CIP，5 μg），妥布霉素（TOB，10 μg）；銅綠假單胞菌的藥敏紙片包括慶大霉素（CN，10 μg）、亞胺培南（IPM，10 μg）、頭孢噻肟（CTX，5 μg）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP，36 μg/6 μg）、美羅培南（MEN，10 μg）、阿米卡星（AK，30 μg）、環(huán)丙沙星（CIP，5 μg），妥布霉素（TOB，10 μg），35 ℃溫育4、6、8 h 后，分別量取抑菌圈直徑，根據(jù)指南中不同細(xì)菌在不同時(shí)間的快速藥敏折點(diǎn)判讀藥敏結(jié)果，質(zhì)控菌株為大腸埃希ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.3.2 血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本常規(guī)鑒定及藥敏試驗(yàn) 當(dāng)血培養(yǎng)儀提示陽(yáng)性報(bào)警時(shí)，取出陽(yáng)性瓶進(jìn)行革蘭染色并轉(zhuǎn)種至相應(yīng)的平板，分離出的單個(gè)菌落采用質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。同時(shí)選擇相應(yīng)的藥敏卡通過(guò)VITEK 2 Compact 進(jìn)行抗菌藥物敏感性分析。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.3.3 藥敏結(jié)果比較 比較RAST 藥敏結(jié)果與常規(guī)藥敏結(jié)果的一致性，判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：①結(jié)果符合（categorial agreement，CA）：常規(guī)藥敏結(jié)果顯示為敏感（或耐藥），RAST 結(jié)果也為敏感（或耐藥）；②錯(cuò)誤（error，Er）：包括以下3 種情況：非常重大錯(cuò)誤（very major errors，VME）：假敏感，即常規(guī)藥敏結(jié)果判定為耐藥，RAST 結(jié)果為敏感；重大錯(cuò)誤（major errors，ME）：假耐藥，即常規(guī)藥敏結(jié)果判定為敏感，RAST 結(jié)果為耐藥；微小錯(cuò)誤（minor errors，mE）：常規(guī)藥敏結(jié)果判定為中介，RAST 結(jié)果為敏感或耐藥。無(wú)ATU 結(jié)果的判讀及比較。

2 結(jié)果

2.1 Vitek MS 快速鑒定與常規(guī)鑒定結(jié)果比較 共分離出革蘭陰性菌133 株。直接鑒定與培養(yǎng)后菌落Vitek MS 鑒定結(jié)果符合率為91.73%（122/133），其中鮑曼不動(dòng)桿菌檢出率最高，為100.00%（12/12），陰溝腸桿菌最低，為66.67%（6/9），見(jiàn)表1。

表1 Vitek MS 快速鑒定與常規(guī)鑒定結(jié)果比較[n（%）]

2.2 RAST 藥敏結(jié)果判讀 共對(duì)94 株革蘭陰性細(xì)菌RAST 結(jié)果進(jìn)行研究，所有藥物CA 比例在4、6、8 h間呈現(xiàn)逐漸升高現(xiàn)象。在8 h 時(shí)除了TZP 和MEM，其他藥物CA 均高于可接受值（CA＞90%）；94 例革蘭陰性桿菌中僅有1 例銅綠假單胞菌對(duì)TZP 的藥敏結(jié)果在6、8 h 時(shí)為VME，1 例大腸埃希菌對(duì)TZP、AK 在4、6、8 h 時(shí)為ME，2 例肺炎克雷伯菌的TZP、CAZ 在4、6、8 h 時(shí)為ME，1 例銅綠假單胞菌的TOB 和CN 在6、8 h 時(shí)為mE，見(jiàn)表2～表4。

表2 大腸埃希菌RAST 藥敏結(jié)果與常規(guī)藥敏結(jié)果一致性比較[n（%）]

表3 肺炎克雷伯菌RAST 藥敏結(jié)果與常規(guī)藥敏結(jié)果一致性比較[n（%）]

表4 銅綠假單胞菌RAST 藥敏結(jié)果與常規(guī)藥敏結(jié)果一致性比較[n（%）]

3 討論

血流感染是引起患者死亡的主要因素之一，早期且準(zhǔn)確的病原學(xué)檢測(cè)和藥敏結(jié)果對(duì)患者的診治十分重要。MALDI-TOF-MS 是近些年發(fā)展起來(lái)的一種新型細(xì)菌鑒定技術(shù)，可以快速準(zhǔn)確地進(jìn)行細(xì)菌及真菌菌種鑒定，對(duì)培養(yǎng)后菌落的鑒定技術(shù)在臨床已應(yīng)用成熟。且菌落鑒定技術(shù)成本也遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)生化鑒定，極大縮短了菌株的鑒定時(shí)間[10]。現(xiàn)階段MALDITOF-MS 技術(shù)對(duì)于標(biāo)本的直接鑒定仍然為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的難點(diǎn)之一。采用不同方法處理血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本后質(zhì)譜直接鑒定的研究一直在不斷的改進(jìn)中，不同的前處理方法可直接影響細(xì)菌鑒定效果及結(jié)果的判定[11，12]。本研究中血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警標(biāo)本采用5% SDS（十二烷基硫酸鈉）法處理后進(jìn)行直接進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，鑒定符合率為91.73%，與王巖等[13]研究報(bào)道的結(jié)果接近，且鑒定結(jié)果報(bào)告在1 h 以內(nèi)，可為臨床早期經(jīng)驗(yàn)性用藥及后續(xù)快速藥敏結(jié)果判讀提供快速可靠的病原學(xué)依據(jù)。

陽(yáng)性血培養(yǎng)液快速藥敏試驗(yàn)近年來(lái)已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[14]。Sakarikou C 等[15]將陽(yáng)性血培養(yǎng)液預(yù)處理后制備成0.5 麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木鷳乙?，使用全自?dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK 2 Compact 進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，但此法耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，獲得最終藥敏結(jié)果需18～24 h。Weme ET[16]利用分子生物學(xué)方法快速檢測(cè)細(xì)菌的耐藥基因，但檢測(cè)成本較高，不適用于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開(kāi)展。Faria-Ramos I 等[17]利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)菌的代謝參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，可在3 h內(nèi)檢測(cè)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，但此法方法需要特殊儀器，一般實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)。2018 年4 月EUCAST 發(fā)布了陽(yáng)性血培養(yǎng)液RAST 及折點(diǎn)，該方法是從陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中取出標(biāo)本直接進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，操作簡(jiǎn)單、成本低、耗時(shí)短，易于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開(kāi)展，目前革蘭陰性桿菌中肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌以及銅綠假單胞菌可進(jìn)行RAST，藥敏結(jié)果最早可在4 h 內(nèi)解讀。

本研究結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌以及銅綠假單胞菌的RAST 中的所有藥物CA 比例在4、6、8 h 3 個(gè)點(diǎn)呈現(xiàn)逐漸升高現(xiàn)象。在8 h 除了TZP和MEM 兩種藥物，其他藥物CA 比例均高于可接受值（＞90%）。94 例革蘭陰性桿菌中僅有1 例銅綠假單胞菌對(duì)TZP 的藥敏結(jié)果在6、8 h 時(shí)判讀為VME，有1 例大腸埃希菌菌對(duì)TZP、AK 在4、6、8 h 時(shí)判讀為ME，1 例肺炎克雷伯菌對(duì)TZP、CAZ 在4、6、8 h時(shí)判讀為ME，1 例銅綠假單胞菌對(duì)TOB 和CN 在6、8 h 時(shí)判讀為mE。不同抗菌藥物在不同時(shí)間點(diǎn)判讀的藥敏CA 比例有所差別。陸燕飛等[18]研究報(bào)道，應(yīng)用RAST 在6 h 判讀腸桿菌目細(xì)菌藥敏結(jié)果時(shí)，TZP 和MEM 分別表現(xiàn)出最低和最高的CA（91.10%vs98.90%）。本研究發(fā)現(xiàn)，6、8 h 的TZP 藥敏判讀結(jié)果CA 最低，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。雖然本研究檢測(cè)到相比4 h，6 h 時(shí)大部分藥物的CA 升高，但在6 h時(shí)TZP、MEM 及TOB 的ATU 比例仍然較高，CA＜90%，所以建議藥敏結(jié)果報(bào)告必須在8 h 評(píng)估后提交。在本研究中，大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對(duì)TZP、銅綠假單胞菌對(duì)MEM 的CA＜90%，這兩種抗生素的CA 比例較低，與部分研究結(jié)果相似[19]。Soo YT 等[20]對(duì)148 例陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶RAST 和Vitek-2檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示在8 h 時(shí)無(wú)VME，ME 檢出率在3.3%～18.2%。與其報(bào)道的高M(jìn)E 率相反，在本研究?jī)H4 株菌株出現(xiàn)ME，1 株菌株出現(xiàn)mE。Martins A 等[21]檢測(cè)36 株大腸桿菌和25 株肺炎克雷伯菌4 h 和6 h 對(duì)8 種抗菌藥物的RAST 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CIP 和CTX 的ME 大于3%，在6 h 對(duì)AK和TZP 的mE 各為34.4%和21.6%，該研究建議RAST 可以代替除AK 以外的其他抗生素的傳統(tǒng)藥敏方法。本研究中，在8 h 時(shí)除TZP 和MEM 外，其他CA 均在可接受范圍內(nèi)，因此本研究建議對(duì)于革蘭陰性桿菌的RAST 應(yīng)謹(jǐn)慎使用TZP 和MEM 檢測(cè)結(jié)果。這可能與本次選取的菌株數(shù)量不同及本地區(qū)的細(xì)菌耐藥性分布不同所致，后續(xù)需要更多的血培養(yǎng)陽(yáng)性培養(yǎng)液RAST 的數(shù)據(jù)資料來(lái)驗(yàn)證。

本研究不足：本研究中血培養(yǎng)陽(yáng)性瓶培養(yǎng)液RAST 分析的數(shù)量不多，且未對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的RAST進(jìn)行評(píng)價(jià)。這些問(wèn)題都有待進(jìn)一步收集更多臨床血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本進(jìn)行RAST 研究來(lái)解決。且RAST 方法本身也存在局限性，該方法不能對(duì)革蘭氏染色后多種細(xì)菌混合感染標(biāo)本及生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)。在測(cè)量早期時(shí)間點(diǎn)的抑制區(qū)域，特別是4 h，由于在顯影邊緣細(xì)菌生長(zhǎng)容易造成人為檢測(cè)錯(cuò)誤?；赗AST 研究應(yīng)該增加多中心研究，這將有助于獲得更多可靠的結(jié)果。

綜上所述，革蘭陰性桿菌血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本采用5% SDS 沉淀法對(duì)樣本進(jìn)行前處理后采用MALDITOF MS 直接鑒定細(xì)菌準(zhǔn)確性較高。在重癥感染患者，尤其是敗血癥患者早期及時(shí)提供藥敏結(jié)果進(jìn)行治療是非常重要的。許多新的技術(shù)方法旨在實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，但在資源有限的實(shí)驗(yàn)室中不適用。使用RAST 方法是一個(gè)切實(shí)可行的方法，在日常工作流程中可以實(shí)現(xiàn)，使血培養(yǎng)陽(yáng)性的TAT 大大減少。根據(jù)RAST 結(jié)果可以指導(dǎo)臨床用藥，及時(shí)升級(jí)或降級(jí)抗生素治療，這將有助改善重癥患者的預(yù)后。然而該方法是勞動(dòng)密集型方法，要求每4、6、8 h 閱讀一次結(jié)果，因此，建議將8 h 作為單一的時(shí)間點(diǎn)閱讀并報(bào)告結(jié)果最為準(zhǔn)確。隨著研究的不斷深入，標(biāo)本前處理方法的不斷完善，MALDI-TOF-MS 細(xì)菌直接鑒定及RAST 的應(yīng)用將會(huì)為臨床重癥感染患者的診治提供更好的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)和幫助。