別緊張，放松肌肉測(cè)定動(dòng)物尿液中天然類(lèi)固醇和合成類(lèi)固醇

文/Sebastian Wiererm amp; Hans Rainer Wollseifen

別緊張，放松肌肉測(cè)定動(dòng)物尿液中天然類(lèi)固醇和合成類(lèi)固醇

文/Sebastian Wiererm amp; Hans Rainer Wollseifen

圖1：在家畜育肥過(guò)程中，除常規(guī)飼料外經(jīng)常有人使用違禁飼料，例如，類(lèi)固醇類(lèi)藥物。

德國(guó)動(dòng)物及動(dòng)物源食品中的殘留物監(jiān)控計(jì)劃NRKP是國(guó)家保護(hù)消費(fèi)者健康計(jì)劃，并由歐盟于1989年作為統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)在歐盟內(nèi)部頒布實(shí)施。該計(jì)劃需要對(duì)肉用家畜體內(nèi)的有害物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。在該背景條件下，德國(guó)化學(xué)獸醫(yī)檢驗(yàn)局CVUA-MEL承擔(dān)定期抽取動(dòng)物尿液檢測(cè)類(lèi)固醇任務(wù)。

德國(guó)化學(xué)獸醫(yī)檢驗(yàn)局CVUA-MEL專(zhuān)業(yè)領(lǐng)導(dǎo)人Thorsten Bernsmann博士表示：“歐洲禁止將類(lèi)固醇作為動(dòng)物飼料添加劑。即便合成類(lèi)固醇在尿檢中只有很低濃度。該類(lèi)物質(zhì)中的每種類(lèi)固醇最低檢測(cè)限，也就是‘推薦濃度’值只有每升尿液1 μg，實(shí)現(xiàn)如此低的檢測(cè)限必須在檢測(cè)分析前進(jìn)行樣本制備?！?/p>

人工手動(dòng)提純費(fèi)時(shí)費(fèi)力

檢測(cè)動(dòng)物尿液中類(lèi)固醇樣本制備工作繁瑣，因?yàn)?，需要完成兩道固相萃取操作：首先是尿液樣本離心濃縮，以便分離出固體雜質(zhì)。

圖2：將尿液樣本、SPE固相萃取柱與兩個(gè)洗脫皿放入Freestyles自動(dòng)化樣本制備系統(tǒng)中并開(kāi)始制備樣本。第一次水解樣本萃取物提純作為磁性固相提純，要求在C18 SPE固相萃取柱中完成，然后，用濃度為5%的甲醇清洗、純甲醇洗脫；其中，洗脫出的第一毫升洗脫液不必丟棄并不能用于檢測(cè)分析。第二次提純是非磁性固相萃取，利用NH2 SPE固相萃取柱。萃取提純自動(dòng)完成，最后，只需對(duì)樣本進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，在檢測(cè)分析前再用溶劑溶解開(kāi)來(lái)。

然后，需要用酸堿度pH值緩沖劑調(diào)節(jié)樣本，使尿液樣本在葡萄糖醛酸酶及芳基硫酸酯酶的酶化作用下水解。通過(guò)水解，附著在糖分子上的類(lèi)固醇就會(huì)脫離出來(lái)形成游離狀類(lèi)固醇，這樣就可以在后續(xù)檢測(cè)過(guò)程中被檢出。

Bernsmann博士解釋?zhuān)骸暗谝淮嗡鈽颖据腿∥锾峒兪谴判怨滔嗵峒?，要求在C18 SPE固相萃取柱中完成，然后，用濃度5%甲醇清洗，純甲醇洗脫；其中，洗脫出的第一毫升洗脫液必須丟棄、不能用于檢測(cè)分析。第二次提純是非磁性固相萃取，使用的是NH2SPE固相萃取柱。將洗脫液收集起來(lái)，在蒸發(fā)器中蒸發(fā)，再用稀釋劑溶解，最后，才可用于檢測(cè)分析?！?/p>

Bernsmann博士表示：“自2015年起我們就在CVUA-MEL德國(guó)化學(xué)獸醫(yī)檢驗(yàn)局中按照上述方式人工手動(dòng)進(jìn)行肉用家畜尿液類(lèi)固醇檢測(cè)。這是一項(xiàng)非常耗費(fèi)時(shí)間的檢驗(yàn)分析工作：大約24份樣本就需要一名實(shí)驗(yàn)員忙活一整天。樣本注入固相萃取柱后狀態(tài)不同，因?yàn)椋鼈儩舛炔煌?。在人工手?dòng)準(zhǔn)備樣本時(shí)實(shí)驗(yàn)員可以調(diào)節(jié)真空度；但他需要照顧到每一個(gè)樣本，因?yàn)橐淮我幚矶鄠€(gè)樣本。當(dāng)一份樣本緩慢的流過(guò)SPE萃取柱、需要加大真空時(shí)，另一份樣本則順利的流過(guò)了萃取柱。而實(shí)驗(yàn)員要避免固相萃取柱中沒(méi)有液體的空流動(dòng)?！?/p>

圖3：為減輕實(shí)驗(yàn)室工作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度，減少兩次固相萃取工作量，德國(guó)化學(xué)獸醫(yī)檢驗(yàn)局CVUA-MEL不久前引進(jìn)自動(dòng)化樣本制備設(shè)備——模塊化機(jī)器人系統(tǒng)：Freestyle，用來(lái)測(cè)定動(dòng)物尿液中的類(lèi)固醇。

本刊提示：壓力較高的好處

固相萃取技術(shù)能夠完成從難以提取檢測(cè)物質(zhì)樣本中提取檢測(cè)樣本，使實(shí)驗(yàn)室人員能夠處理含有懸浮物或長(zhǎng)絲基質(zhì)材料，例如，含有沉積物的河水。

軟件輕松制定出檢測(cè)分析方法

從2015年2月份開(kāi)始，CVUAMEL德國(guó)化學(xué)獸醫(yī)檢驗(yàn)局開(kāi)始用自動(dòng)化樣本制備方式代替費(fèi)時(shí)費(fèi)力的人工手動(dòng)操作；所使用的樣本制備儀器設(shè)備是LC-Tech公司的Freestyle系統(tǒng)。該模塊化機(jī)器人檢測(cè)分析儀所使用的軟件專(zhuān)門(mén)針對(duì)樣本制備而設(shè)計(jì)，LC-Tech公司的工藝技術(shù)開(kāi)發(fā)工程師Sebastian Wierer先生表示：“它的最大特點(diǎn)是：兩個(gè)固相萃取交替工作，將其不同的工作方法整合到一起（稱(chēng)之為SPE雙柱萃取法）。為實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，我們對(duì)該系統(tǒng)控制軟件進(jìn)行了具有針對(duì)性的設(shè)計(jì)改進(jìn)，將其控制在兩個(gè)不同萃取柱中進(jìn)行固相萃取。”

借助于該軟件技術(shù)改進(jìn)，促使軟件技術(shù)控制的雙柱萃取控制、調(diào)整變得異常簡(jiǎn)單：“在軟件界面窗口中，萃取過(guò)程所用的必要參數(shù)均顯示于此。只需點(diǎn)擊鼠標(biāo)就可以選擇操作步驟并設(shè)置例如流量及壓力參數(shù)，從而定義下一個(gè)操作模式。一旦將該模式保存下來(lái)，您便可以隨時(shí)在實(shí)驗(yàn)室中調(diào)取出并使用?！?為高效而快捷的完成樣本提純，CVUA-MEL德國(guó)化學(xué)獸醫(yī)檢驗(yàn)局為制備該類(lèi)樣本使用的是Macherey Nagel公司研發(fā)生產(chǎn)的Chromabond固相萃取柱。

Macherey Nagel公司的應(yīng)用技術(shù)專(zhuān)家Hans Reiner Wollseifen博士介紹：“該種固相萃取柱不僅可以在系統(tǒng)方法研究樣本制備中使用，也可以在標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)檢驗(yàn)過(guò)程樣本制備中使用?！痹摲N固相萃取柱的基本材料保證其能夠高效濃縮與提純，并具有理想的流動(dòng)性、最佳的微孔結(jié)構(gòu)和很高的比表面積，適用于低試劑消耗量檢測(cè)分析使用。

Wierer先生表示：“為提高流量及減小萃取柱的無(wú)效空間，我們?cè)O(shè)計(jì)出了Chromabond固相萃取柱專(zhuān)用柱塞桿。沒(méi)有這一專(zhuān)用柱塞桿，萃取柱中的高流量常常需要等待，直至柱床上清液排空為止。目前，則可以對(duì)柱中萃取液、清洗液及洗脫液施加恒定壓力。”

圖4：德國(guó)化學(xué)獸醫(yī)檢驗(yàn)局CVUA-MEL利用Machery Nagel公司研發(fā)生產(chǎn)的Chromabond固相萃取柱進(jìn)行樣本提純。這一萃取柱非常適合于在機(jī)器人系統(tǒng)中高效的、快捷的完成樣本提純。為了減少萃取柱中的死角，提高流量，LC-Tech公司專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)了覆蓋在固相萃取柱上的專(zhuān)用柱塞桿。

較小的工作量就便可獲得更準(zhǔn)確的檢測(cè)信號(hào)

在自動(dòng)化樣本制備過(guò)程中，已水解的樣本、帶有專(zhuān)用柱塞桿的SPE萃取柱及兩個(gè)洗脫皿都要放入自動(dòng)化設(shè)備中。第一個(gè)洗脫皿用于首次固相萃取后短時(shí)間接納一部分樣本。在選擇接納第二次固相萃取樣本洗脫皿時(shí)應(yīng)注意：該洗脫皿應(yīng)能在Turbovap濃縮儀中蒸發(fā)濃縮。

Bernsmann博士解釋?zhuān)骸霸O(shè)備啟動(dòng)后，儀器設(shè)備能夠自動(dòng)完成上述介紹的兩個(gè)提純步驟；只剩樣本的蒸發(fā)濃縮和用另一種溶劑重新溶解。向Freestyles設(shè)備中放置器皿和樣本的工作，啟動(dòng)一系列樣本制備的流程所需的時(shí)間僅僅是人工手動(dòng)操作很小的一部分時(shí)間。而這種方法的制備出來(lái)的樣本就是手工制備的感覺(jué)一樣好。留給實(shí)驗(yàn)員從事其他工作的時(shí)間，通過(guò)自動(dòng)化樣本制備明顯節(jié)約實(shí)驗(yàn)分析的時(shí)間”在同一過(guò)程中能夠完成處理18個(gè)樣本。

測(cè)量信號(hào)的穩(wěn)定性明顯有所提高，所有試劑均在恒定壓力下流經(jīng)萃取柱與人工手動(dòng)操作檢測(cè)結(jié)果相比，檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差明顯降低；自動(dòng)化系統(tǒng)具有比人工手動(dòng)更高的可重復(fù)再現(xiàn)性及穩(wěn)定性。樣本在不同濃度、粘度幾乎不成問(wèn)題。

Bernsmann先生表示：“除恒定壓力與檢查結(jié)果的可重復(fù)再現(xiàn)性能外，改用自動(dòng)化樣本制備系統(tǒng)同樣帶來(lái)其他優(yōu)點(diǎn)及好處。就像人工手動(dòng)操作，使用LCTech公司的自動(dòng)化設(shè)備一周僅制備50個(gè)樣本，但采用Freestyles系統(tǒng)后明顯減少人力資源占用。原來(lái)人工手動(dòng)執(zhí)行的、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的SPE固相萃取與技術(shù)開(kāi)發(fā)工作也可以在夜間自動(dòng)進(jìn)行。無(wú)人值守的樣本制備可以在周末進(jìn)行。另外，檢測(cè)分析結(jié)果同樣證明該系統(tǒng)工作絕無(wú)交叉污染。使用自動(dòng)化樣本制備系統(tǒng)意味贏得效率；CVUA-MEL德國(guó)化學(xué)獸醫(yī)檢驗(yàn)局職工可以在Freestyles系統(tǒng)自動(dòng)工作期間從事其他沒(méi)能實(shí)現(xiàn)的自動(dòng)化工作。

在動(dòng)物飼料中添加違禁成分，例如，類(lèi)固醇類(lèi)成分，從而實(shí)現(xiàn)催肥增膘快速出欄的事件并不少見(jiàn)。閱讀本文，您會(huì)更詳盡了解到利用自動(dòng)化固相萃取技術(shù)明顯提高類(lèi)固醇檢測(cè)效率的有效方法。

本文作者Sebastian Wiererm先生系Obertaufkirchen市，LC-Tech有限責(zé)任公司職工。Hans Rainer Wollseifen博士系Dueren市，Machery Nagel有限兩合公司職工。