桂花OfPSY、OfPDS和OfHYB基因啟動子克隆及表達特性分析

周俊杰，王藝光，董 彬，趙宏波

（1.浙江農林大學 浙江省園林植物種質創(chuàng)新與利用重點實驗室，浙江 杭州 311300；2.浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 杭州 311300）

類胡蘿卜素是一種親脂類異戊二烯，是一種自然界中廣泛存在的生物色素，主要反射黃色、橙色和紅色的光[1]。在植物器官中，類胡蘿卜素在質體中的積累對吸收過量光能、清除活性氧、合成植物激素提供前體物質都起重要的作用[2]。八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase, PSY)是類胡蘿卜素合成途徑中的第1個限速酶，它的作用是將2分子的香葉酰香葉酰二磷酸(geranylgeranyl diphosphate，GGPP)合成無色的八氫番茄紅素[3]。隨后，八氫番茄紅素經過包括八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase，PDS)在內的4次去飽和反應和2次異構化反應的多順式轉化，最終生成紅色的全反式番茄紅素[4]。而β-羥化酶(β-carotene hydroxylase，HYB)既可以單獨作用使β-胡蘿卜素經羥化作用轉化為紫黃質，也可與ε-羥化酶(ε-carotene hydroxylase，HYE)協(xié)同作用使α-胡蘿卜素經羥化作用形成葉黃素[5]。桂花Osmanthus fragrans是重要的觀賞植物，花色和花香是其主要觀賞性狀。已有研究發(fā)現：類胡蘿卜素既是桂花花瓣中主要色素成分[6]，也是桂花香氣物質的前體物質[7]。目前已在多種植物中發(fā)現，植物器官中的類胡蘿卜素含量及相關基因的表達水平受到多種因素的影響，如溫度[8]、光照[9]、干旱脅迫[10]、乙烯[11]等。前期研究[12]發(fā)現：在200 mg·L?1脫落酸處理下，桂花花色明顯加深，花瓣類胡蘿卜素含量上升，類胡蘿卜素合成關鍵基因OfPSY、OfPDS和OfHYB表達水平顯著上調。相關基因在前人的研究中均已克隆到[13?15]，但對其調控的作用機制仍知之甚少。基因的啟動子作為上游調控因子識別并結合的部位，是基因表達調控的重要作用位點。為進一步揭示桂花花色形成及其調控的分子機制，本研究克隆了OfPSY、OfPDS和OfHYB基因的啟動子，通過作用元件分析、表達載體構建和瞬時表達分析，初步明確其作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料

8～10年生丹桂品種‘堰虹桂’Osmanthus fragrans‘Yanhong Gui’栽植于浙江農林大學桂花資源圃；煙草Nicotiana benthamiana栽培于浙江農林大學園林植物實驗室。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒、Premix Taq聚合酶、質粒載體PMD18-T、大腸埃希菌Escherichia coliDH5α、切膠回收試劑盒、DNA片段純化試劑盒、限制性內切酶EcoR Ⅰ、NcoⅠ、DNA連接酶等購自Takara公司 (大連)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 參照DNA提取試劑盒所用方法提取桂花‘堰虹桂’基因組DNA。

1.3.2 引物設計與合成 根據桂花基因組數據[16]中的OfPSY、OfPDS、OfHYB基因啟動子序列，用Primer Premier 5.0分別設計上下游引物。引物由有康生物公司(杭州)合成(表1)。

表1 啟動子克隆所用引物Table 1 Primers used for promoter cloning

1.3.3 桂花OfPSY、OfPDS、OfHYB基因啟動子克隆及序列分析 以桂花‘堰虹桂’基因組 DNA 為模板，分別用引物OfPSYP-F和OfPSYP-R、OfPDSP-F和OfPDSP-R、OfHYBP-F和OfHYBP-R對其啟動子進行擴增。將擴增產物連接至質粒載體PMD18-T并轉化大腸埃希菌DH5α，隨后鑒定陽性克隆并送至有康公司(杭州)測序。啟動子作用元件分析通過在線網站Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行。

1.3.4 桂花PSY、PDS、HYB啟動子驅動 LUC 基因表達載體構建 設計包含酶切位點的引物 (表 2)，用于構建啟動子表達載體。使用限制性內切酶EcoRⅠ和NcoⅠ分別對PCAMBIA3301-LUC載體和添加了酶切位點的啟動子進行雙酶切。用T4連接酶連接回收的啟動子和載體片段。再經轉化大腸埃希菌DH5α鑒定，得到重組的PSYP::LUC、PDSP::LUC、HYBP::LUC載體。再將重組質粒轉化農桿菌Agrobacterium tumefaciensGV3101。

表2 構建 PCAMBIA3301-LUC 載體所用引物Table 2 Primers used to construct PCAMBIA3301-LUC vector

1.3.5 桂花OfPSY、OfPDS、OfHYB啟動子煙草中瞬時表達 將含有重組質粒的農桿菌菌液在含有利福平和卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至D(600)達 0.8～1.0，在 4 ℃ 下以 4 000 r·min?1離心 10 min，收集菌體，隨后以 2 mL 含 10 mmol·L?1MES、10 mmol·L?1MgCl2和 150 μmol·L?1的乙酰丁香酮的懸浮液重懸菌體2次。選取長勢較好的煙草，將懸浮液用1 mL注射器從葉片下表皮注射到煙草葉片中直至整個葉片呈現水漬狀。將煙草置于暗處培養(yǎng)1 d后轉移至人工氣候室繼續(xù)培養(yǎng)1～2 d，隨后將植株分別進行 37 ℃ 處理和 200 mg·L?1脫落酸噴施處理，12 h 后將注射后的葉片取下，噴灑 1 mmol·L?1的熒光素鈉鹽溶液，暗處放置5 min后在CCD冷凍發(fā)光儀下觀察LUC熒光信號。參考Luciferase (Promega)熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒對酶活性進行檢測，以對照組的比值為單位1，得到不同處理組的相對Luciferase活性，每組實驗均包括3次技術重復和生物學重復。利用SPSS 19.0軟件進行數據差異分析。

2 結果與分析

2.1 啟動子克隆及序列分析

以桂花‘堰虹桂’基因組DNA為模板，用引物OfPSYP-F和OfPSYP-R、OfPDSP-F和OfPDSP-R、OfHYBP-F和OfHYBP-R對其啟動子進行擴增，分別得到OfPSY啟動子長度為1 908 bp (圖1)，OfPDS啟動子長度為 1 521 bp (圖 2)，OfHYB啟動子長度為 1 830 bp (圖 3)的序列。利用 Plant CARE 在線軟件對啟動子序列的結合位點進行分析。在OfPSYP中，存在TATA-box、CAAT-box等啟動子基本元件，和光響應元件、脫落酸(ABA)響應元件、赤霉素響應元件等響應元件，以及MYB、MYC結合位點(表3)；在OfPDSP中，存在TATA-box、CAAT-box等啟動子基本元件，和脫落酸響應元件、茉莉酸甲酯響應元件、赤霉素響應元件、光響應元件、厭氧誘導型元件、防御和脅迫響應元件等響應元件，以及MYB、MYC結合位點(表4)；在OfHYBP中，存在TATA-box、CAAT-box等啟動子基本元件，和脫落酸響應元件、生長素響應元件、低溫響應元件、乙烯響應元件、茉莉酸甲酯響應元件、光響應元件、厭氧誘導型元件等響應元件，以及MYB、MYC結合位點(表5)。

表3 OfPSY啟動子中的順式作用元件Table 3 Cis-acting elements in OfPSY promoters

表4 OfPDS啟動子中的順式作用元件Table 4 Cis-acting elements in OfPDS promoters

表5 OfHYB啟動子中的順式作用元件Table 5 Cis-acting elements in OfHYB promoters

圖1 OfPSY 基因的啟動子序列Figure 1 Promoter sequence of OfPSY gene

圖2 OfPDS 基因的啟動子序列Figure 2 Promoter sequence of OfPDS gene

圖3 OfHYB 基因的啟動子序列Figure 3 Promoter sequence of OfHYB gene

2.2 啟動子瞬時表達分析

重組載體瞬時表達的熒光成像結果顯示：注射了含重組載體農桿菌的煙草葉片均顯現出熒光(圖4)，表明OfPSYP、OfPDSP、OfHYBP均能夠驅動LUC報告基因的表達，具有啟動子活性。相對于25 ℃處理的煙草葉片，在37 ℃處理下，注射了OfPSYP::LUC、OfPDSP::LUC和OfHYBP::LUC的煙草葉片呈現出更強的熒光信號；在200 mg·L?1脫落酸處理下，注射了OfPDSP::LUC和OfHYBP::LUC的煙草葉片呈現出更強的熒光信號。結果表明：相對高溫脅迫上調了OfPSY、OfPDS和OfHYB的啟動子活性，脫落酸上調了OfPDS和OfHYB的啟動子活性。

圖4 瞬時表達分析 OfPSY、OfPDS 和 OfHYB 啟動子表達特性Figure 4 Transient expression analysis of OfPSY, OfPDS and OfHYB promoter expression characteristics

3 討論

植物中類胡蘿卜素的成分和含量是由一系列酶促反應完成的。研究發(fā)現類胡蘿卜素代謝關鍵基因的表達受到各種環(huán)境因素和激素的調控。在香蕉Musa nana中，高溫可以上調α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素生物合成途徑相關基因的轉錄水平[17]；在藍莓Vacciniumspp.中，紅光和遠紅光對果實中類胡蘿卜素合成和降解基因的表達均起到上調作用[18]；在大豆Glycine max中，氯化鈉(NaCl)、聚乙二醇(PEG)、高溫、低溫等脅迫和ABA處理對類胡蘿卜素降解基因起明顯的上調作用[19]。此外，轉錄因子對類胡蘿卜素代謝關鍵基因的啟動子存在直接調控作用。在柑橘Citrus reticulata中，CsMADS6基因可以結合CsPSY和CsPDS基因的啟動子[20]，從而促進其基因的表達；在番木瓜Carica papaya中，CpEIN3a既可以直接識

別并結合CpPDS和CpCHYB基因的啟動子，也可與CpNAC1/2基因共同促進CpPDS的表達[21]，而CpSBP1則對CpPDS基因存在負調控作用[22]；在胡蘿卜Daucus carota中，DcAREB3可響應鹽脅迫和ABA處理，識別并結合DcPSY2啟動子的ABRE作用元件，從而促進其表達[23]。

前期通過對桂花進行ABA處理發(fā)現，相對于未處理的桂花，經200 mg·L?1ABA處理的桂花花瓣中的類胡蘿卜素含量上升；對花瓣中類胡蘿卜素代謝關鍵基因實時熒光定量表達顯示：經ABA處理后OfPSY、OfPDS、OfHYB等基因的表達量顯著上調，推測ABA通過調控這幾個基因的表達，從而影響了桂花花色[12]。本研究在OfHYB啟動子中發(fā)現了4個ABRE作用元件，該作用元件被認為是AREB轉錄因子的結合位點[24]。研究發(fā)現AREB轉錄因子能夠識別并結合2個相距較近的ABRE作用元件[25]。在OfHYB啟動子的4個ABRE作用元件中，有3個元件之間相距19和12 bp，表明OfHYB基因極有可能受到ABA調控，與此同時，OfHYB啟動子上發(fā)現了最多的激素響應元件，除ABA響應元件外，還存在生長素、茉莉酸甲酯和乙烯響應元件，表明OfHYB基因的表達可能受到多種激素的調控。本研究通過高溫和外源施加ABA，研究了幾個啟動子表達特性，進一步驗證了相對高溫對OfPSY和OfHYB基因啟動子以及ABA對OfPDS和OfHYB啟動子表達的調控作用。此外，在3個基因啟動子中均存在數個光響應元件，在桂花中已經發(fā)現OfCCD1的表達可能受光照影響[26?28]，說明桂花花色物質的合成與降解均可能與光信號傳導有關，但其具體作用機制仍有待進一步研究。本研究克隆得到的啟動子經瞬時表達驗證均具有啟動子活性，下一步可將其構建酵母單雜載體，通過尋找上游的調控因子，明確桂花花瓣類胡蘿卜素合成基因轉錄調控的分子機制。