高溫脅迫下景寧木蘭淀粉與蔗糖代謝途徑轉(zhuǎn)錄分析

鄭晨璐，王倩穎，陸丹迎，申亞梅，馬晶晶，劉 璐，王 云

（1.上海交通大學(xué) 設(shè)計學(xué)院，上海 200240；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 杭州 311300）

高溫脅迫不僅導(dǎo)致植物表型的變化，而且會引起植物體內(nèi)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡，生長發(fā)育受到抑制，嚴(yán)重影響觀賞植物的品質(zhì)[1]。環(huán)境溫度的變化對植物光合作用的多種生理生化過程有直接的影響，包括光合碳固定和還原、蔗糖合成、光合產(chǎn)物的運輸與分配等[2]。碳同化是光合作用中植物在同化力形成之后的第3個階段，此階段中，植物葉綠體基質(zhì)中的Rubisco酶利用ATP和NADPH同化二氧化碳(CO2)生成淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖等物質(zhì)。在高等植物光合作用中，果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose-1, 6-diphosphate synthase, FBPase)在卡爾文循環(huán)和細(xì)胞質(zhì)中的蔗糖生物合成途徑中都起著關(guān)鍵作用，其中存在至少2種酶：葉綠體型FBPase和胞質(zhì)型FBPase。葉綠體型FBPase主要參與還原磷酸戊糖途徑，同時參與葉綠體中淀粉的合成；胞質(zhì)型FBPase主要參與糖異生途徑和蔗糖的合成，在蔗糖的合成中起著重要的調(diào)節(jié)作用[3?4]。有研究指出蔗糖磷酸合酶 (sucrose diphosphate synthase, SPS)與淀粉積累呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與蔗糖形成呈正比關(guān)系[5?6]，并與蔗糖合成酶(sucrose synthase, SS)一起成為蔗糖調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶[7]，為淀粉合成提供底物及能量。淀粉是植物體中碳水化合物的主要儲存形式，葉片中淀粉合成是一個動態(tài)的過程[8]。在淀粉合成通路中，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glocose pyrophosphorylase, AGP)作為限速酶，參與第一步反應(yīng)，顆粒結(jié)合淀粉合酶(granule-bound starch synthase, GBSS)參與直鏈淀粉合成，可溶性淀粉合成酶 (soluble starch synthase, SSS)和淀粉分支酶 (starch branching enzyme, SBE)協(xié)作合成支鏈淀粉[7]。這些碳同化產(chǎn)物既是光合作用的產(chǎn)物，同時還是植物呼吸作用的底物，為植物的生長發(fā)育提供碳骨架的同時，還可增強植物的抗逆性。為進一步了解植物對高溫的響應(yīng)，分子生物學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)等應(yīng)用與解析調(diào)控植物耐熱的分子基礎(chǔ)，培育了相關(guān)觀賞植物品種[1]。

景寧木蘭Magnolia sinostellata是木蘭科Magnoliaceae木蘭屬Magnolia灌木，早春開花，花色淺粉色到粉紅色，具有較高的觀賞價值，具有開發(fā)應(yīng)用價值[9]。全球變暖帶來的極端高溫可能對景寧木蘭的生長發(fā)育帶來潛在的威脅。目前已挖掘了景寧木蘭熱脅迫下實時熒光定量PCR 內(nèi)參基因，但還未深入研究。因此，本研究以景寧木蘭幼苗為對象，采取高溫脅迫處理，研究其糖代謝途徑變化機制，從而探究景寧木蘭對高溫的響應(yīng)情況，同時為木蘭屬植物的城市應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

景寧木蘭植株均來自浙江省景寧縣草魚塘林場苗圃(海拔1 100 m)。選擇1年生、生長一致的景寧幼苗栽植于裝有土壤與珍珠巖按質(zhì)量比為1∶1混合的容器中，常規(guī)管理。所有樣品均放置于光照培養(yǎng)箱中 [光照 20 μmol·m?2·s?1，溫度 (25±1) ℃，相對濕度 (70±10)%，光照黑暗各 12 h]。當(dāng)植株生長到 10 cm左右高度時，選取20株健康、長勢均勻的幼苗轉(zhuǎn)移到溫度設(shè)定為40 ℃(H)的光照培養(yǎng)箱中，以25 ℃為對照(ck)。處理0、3、6、9、12、24和48 h時采集景寧木蘭第2～3葉(成熟葉)為樣本，迅速保存在液氮中，用于后續(xù)的測定，其中選取ck-24、ck-48、H-24、H-48用于轉(zhuǎn)錄組測定，每個樣本3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 糖、淀粉及酶活性測定

蔗糖、淀粉、葡萄糖和果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用改進的苯酚-硫酸法[10]，果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)的測定方法采用CHEN等[11]的方法，蔗糖磷酸合酶(SPS)根據(jù)GROF等[12]方法測定。采用SPSS 19.0進行單因素方差分析，采用LSD法進行顯著性差異分析。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序與數(shù)據(jù)分析

使用Trizol試劑盒(天根，北京)提取景寧木蘭葉片總RNA。質(zhì)量檢測合格后，經(jīng)深圳華大基因科技服務(wù)有限公司使用DNaseI消化DNA、富集mRNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA和PCR擴增，制備cDNA文庫。用 Agilent 2 100 Bioanalyzer和 ABI StepOnePlusReal-Time PCR System 完成文庫質(zhì)量和產(chǎn)量檢測后進行轉(zhuǎn)錄組測序。對原始數(shù)據(jù)(raw reads)進行質(zhì)控(QC)獲得濾后的數(shù)據(jù)(clean reads)，再進行基因定量分析以及基于基因表達水平的各項分析(主成分、相關(guān)性、條件特異表達、差異基因篩選等)，并對篩選出的樣品間差異表達基因進行GO功能顯著性富集分析、pathway顯著性富集分析和聚類以及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄因子等深入挖掘分析。

1.4 基因表達量及差異基因分析

用RSEM工具[13?14]進行基因表達定量，運用FPKM法消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響，計算得到的基因表達量可直接用于比較不同樣品間的基因差異表達。將候選響應(yīng)基因利用RefSeq non-redundant proteins(NR)數(shù)據(jù)庫、Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫、Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫進行 Blast比對，獲得候選響應(yīng)基因的注釋信息。用WEGO軟件[15]對差異基因做GO功能分類統(tǒng)計，利用Omicshare在線工具庫中的動態(tài)KEGG富集分析程序進行候選響應(yīng)基因的注釋及功能預(yù)測。

1.5 實時熒光定量 PCR

將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA 稀釋 10 倍，使用 SYRB Premix Ex Tap Ⅱ (TAKARA：Code No.RR820A)實時定量PCR試劑盒，使用Light Cycler 480 Ⅱ(Roche)實時定量PCR儀進行定量分析。反應(yīng)體系為SYRB Premix Ex Tap Ⅱ10 μL，cDNA 模板 2 μL，上下游引物各 0.8 μL(10 μmol·L?1)，ddH2O 6.4 μL，共 20 μL 體系。每個樣品 3 次重復(fù)，擴增反應(yīng)程序為：95 ℃ 預(yù)變性 30 s，95 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 預(yù)變性 30 s，共40個循環(huán)。然后95 ℃持續(xù)5 s，60 ℃持續(xù)1 min，95 ℃持續(xù)15 s作為溶解曲線分析程序，進行溶解曲線分析。最后根 2-??Ct法計算目的基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對景寧木蘭碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶活性的影響

與對照相比，高溫脅迫下24和48 h時景寧木蘭的果糖、葡萄糖和蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加(圖1A～C)，除高溫脅迫24 h的葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對照無顯著差異外(圖1B)，其他均呈顯著差異(P＜0.05)。與對照相比，高溫脅迫24 h時的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低(P＜0.05)，而脅迫48 h時的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著升高(P＜0.05)(圖1D)。FBPase和SPS是蔗糖合成的關(guān)鍵酶，與對照相比，F(xiàn)BPase活性在脅迫24 h時先顯著升高(P＜0.05)，在48 h時下降，但差異不顯著(P＞0.05)(圖1E)。在高溫脅迫下，SPS活性相比對照在24 h下降，48 h時有所上升，但并無顯著差異(P＞0.05)(圖1F)。相關(guān)性分析結(jié)果表明(表1)：蔗糖與果糖變化成極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，淀粉、SPS活性與FBPase活性成負(fù)相關(guān)。

表1 高溫脅迫下景寧木蘭碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶活性的相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficient between carbohydrate contents and enzyme activities of M.sinostellata under high temperature stress

圖1 不同熱脅迫處理對景寧木蘭碳水化合物同化過程的影響Figure 1 Effects of different heat stress treatments on the carbohydrates assimilation process of M.sinostellata

2.2 高溫脅迫下景寧木蘭葉片的轉(zhuǎn)錄組測序

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(表2)顯示：測序堿基對總數(shù)為7 054 萬～ 7 313 萬條。每個原始讀取從一端測序，長度為50 bp。去除低質(zhì)量序列后(即含有＜1%的不確定堿基)，各測序樣本共獲得70 547 818(ck-24)、72 966 866(ck-48)、73 134 592(H-24)和73 140 464(H-48) 條。每個庫中clean reads的比例平均為99.53%。來自對照和高溫樣本的轉(zhuǎn)錄組都有至少7 000萬個clean reads，這表明景寧木蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，能夠開展后續(xù)的生物信息學(xué)分析。數(shù)據(jù)篩選后得到的17 884個不同長度的差異unigenes[錯誤發(fā)生率(FDR)≤0.001, log2R≥1]。H-24與ck-24相比，4 662個基因的表達下調(diào)，6 611個基因的表達上調(diào)；H-48與ck-48相比，4 658個基因的表達下調(diào)，5 131個基因的表達上調(diào)；H-48與H-24相比，4 548個基因的表達下調(diào)，4 056個基因的表達上調(diào)(表3)。

表2 高溫脅迫和非高溫脅迫下景寧木蘭的葉片測序結(jié)果與參考基因序列的對比率Table 2 Ratio of leaf sequencing results to reference gene sequences of M.sinotellata under heat stress and non-heat stress

表3 差異表達基因統(tǒng)計Table 3 Statistic of differentially expressed genes

2.3 GO 功能注釋分類

GO數(shù)據(jù)庫定義了3類系統(tǒng)來描述基因產(chǎn)物的具體功能：生物過程(biological process)、細(xì)胞組分(cellar component)和分子功能(molecular function)，這些基因又被具體分為56個小類，從而發(fā)揮生物功能。將組裝的景寧木蘭unigene與GO數(shù)據(jù)庫比對分析，圖2A～C顯示：景寧木蘭序列中有81 573條unigene可以進行功能分類。其中33.03%的基因顯著富集于生物過程、34.31%的富集于細(xì)胞組分，32.66%的分子功能。生物學(xué)過程中的主要途徑是細(xì)胞途徑和代謝過程相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，細(xì)胞組分中最多的是膜的構(gòu)成，分子功能中最多的是結(jié)合和催化活性。

2.4 KEGG 代謝通路分析

將組裝的景寧木蘭unigene與KEGG數(shù)據(jù)庫比對及KEGG富集分析(圖2D～E)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在景寧木蘭高溫脅迫的3個比較組中，ck-24與H-24、H-24與H-48代謝相關(guān)通路高度富集；ck-24與H-24、ck-48與H-48淀粉和蔗糖代謝通路富集排名第3位，H-24與H-48排名第4位。這些結(jié)果表明：淀粉和蔗糖代謝途徑在景寧木蘭高溫脅迫響應(yīng)機制中具有重要作用。

圖2 3個比較組差異基因的GO分類(A～C)和KEGG富集圖(D～F)Figure 2 GO classification (A?C) and KEGG enrichment map (D?F) of DEGs in 3 comparison groups

2.5 熱脅迫誘導(dǎo)的淀粉-糖代謝途徑差異基因表達分析

在淀粉代謝通路中共有105個差異基因。在該通路中，8個DEGs調(diào)控ADP-glucose以促進淀粉酶合成，5個DEGs調(diào)控淀粉酶以生產(chǎn)淀粉；淀粉也可以通過同樣的途徑調(diào)控ADP-glucose產(chǎn)生α-DGlucose-1P，然后再形成UDP-glucose，UDP-glucose再在蔗糖合成酶基因和蔗糖6磷酸合成酶基因的作用下形成蔗糖；蔗糖代謝通路中有17個差異基因，其中有6個屬于蔗糖合酶基因，5個屬于蔗糖磷酸合成酶(圖3A～D)。選取6個淀粉和蔗糖代謝途徑高表達基因，即GP(CL3087.contig2)、SS(Unigene40295)、Glc-1-pa(Unigene38453)、GBE(CL4668.contig3)、SUS(Unigene42760)、SPS(CL651.contig6)，通過 qPCR 定量分析，結(jié)果顯示(圖4)：與對照相比，高溫脅迫48 h處理下淀粉和糖代謝途徑上的GP(CL3087.contig2)、SS(Unigene40295)、Glc-1-pa(Unigene38453)、GBE(CL4668.contig3)基因表達顯著上調(diào) (P＜0.05)，SUS(Unigene42760)、SPS(CL651.contig6)基因表達顯著下降(P＜0.05)。由此說明，在高溫脅迫下，淀粉合成酶基因及蔗糖6磷酸合成酶基因表達均呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢，以促進蔗糖產(chǎn)生。

圖3 高溫脅迫下淀粉-糖代謝途徑及相關(guān)基因表達分析圖Figure 3 Analysis of starch and sugar metabolic pathway and related gene expression under high temperature stress metabolism

圖4 淀粉與蔗糖代謝途徑6個DEGs在不同時間點的相對表達Figure 4 Relative expression of 6 DEGs in starch and sucrose metabolism pathways at different time points

3 討論與結(jié)論

極端高溫天氣勢必影響植物的生長發(fā)育，最終導(dǎo)致部分植物處于瀕危狀態(tài)。本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示：極端高溫處理景寧木蘭之后，其大部分基因可注釋到生物進程，代謝功能途徑中基因分布最多，這與非洲菊Gerbera jamesonii[16]、牡丹Paeonia suffruticosa[1]等相似。景寧木蘭的KEGG數(shù)據(jù)庫顯示：在高溫處理后，大部分基因高度富集于代謝通路，同時淀粉與糖代謝通路中占據(jù)重要的比例。由此推斷，淀粉和蔗糖代謝對景寧木蘭響應(yīng)高溫脅迫機制具有重要的作用。

植物葉片光合作用同化吸收的碳用于葉綠體淀粉的形成，或者運輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中合成蔗糖，蔗糖隨后被運輸?shù)街参锏姆枪夂衔恢?。不同植物葉片淀粉和蔗糖積累水平差異很大，環(huán)境因子(如溫度、光照等)也影響著植物葉片所固定碳在蔗糖和淀粉之間的分配[17]。本研究中，隨著高溫脅迫的加深，24和48 h處理下景寧木蘭葉片蔗糖和淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著，但是均顯著高于對照。本研究中FBPase與淀粉顯著正相關(guān)，與蔗糖負(fù)相關(guān)。這與馬鈴薯Solanum tuberosum[18]、擬南芥Arabidopsis thaliana[19]的研究結(jié)果一致。FBPase在24 h達到最高值之后，說明景寧木蘭對高溫具有一定的適應(yīng)性，然而48 h時與對照相比差異不顯著，說明高溫對景寧木蘭FBPase影響不大。

植物的生長發(fā)育所需要的光合產(chǎn)物大部分以蔗糖的形式供應(yīng)和運輸，其中，SPS是蔗糖合成途徑的一個重要控制點，同時也是蔗糖進入各種代謝途徑所必需的關(guān)鍵酶之一，它的活性可反映蔗糖生物合成途徑的能力[20?21]。一些研究指出SPS與淀粉積累呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，而與蔗糖形成呈正相關(guān)[5?6]。本研究結(jié)果與之相似。在溫州蜜柑Citurs unshiu‘Miyagawawase’[22]、灌漿期水稻Oryza sativa‘Koshihikari’和O.sativa‘Sasanishiki’[23]的研究中也發(fā)現(xiàn)了同樣的問題，可能是因為光合細(xì)胞中同化的碳水化合物在蔗糖和淀粉之間的分配受SPS的調(diào)節(jié)，但SPS不起主要作用，蔗糖和淀粉的合成還受其他因子的影響[24?25]。

淀粉和蔗糖代謝途徑和多種酶密切相關(guān)，植物一般利用糖苷鍵將蔗糖[β-D-frucose-(2→1)-α-D-glucose]和海藻糖[α-D-glucose-(2→1)-α-D-glucose]中的己糖殘基連接在一起，蔗糖和海藻糖的形成掩蓋了葡萄糖和果糖的活性基團，兩者反應(yīng)活性低于葡萄糖[16]。本研究果糖、葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著脅迫的加深有所下降，從而促進了淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，雖然差異不顯著，但是調(diào)節(jié)淀粉合成的SS(Unigene40295)、Glc-1-pa(Unigene38453)、GBE(CL4668.contig3)基因的表達量增加，進一步證明了高溫可能促進胞質(zhì)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，通過ADP-glucose催化促進淀粉的合成[16]。雖然ADP-glucose是否是催化淀粉合成的關(guān)鍵酶還存在爭議[16]，但是本研究定量結(jié)果顯示：SPS(CL651.contig6)基因隨著高溫脅迫的加深，呈現(xiàn)下降趨勢，這進一步說明了淀粉積累與蔗糖積累之間存在相關(guān)性，但是具體機制還需要深入研究。

綜上所述，景寧木蘭在高溫脅迫下，積累糖和淀粉以提升抵抗脅迫能力，且淀粉與蔗糖途徑的關(guān)鍵基因表達也反映了景寧木蘭響應(yīng)高溫脅迫的機制。具體基因的功能驗證還需進一步研究。