不同產(chǎn)區(qū)白芷遺傳多樣性和品質(zhì)特征

王麗赟，孫 健，陳夢瑩，姚 輝，周水燈，王海閣，王 盼，徐凱玠，王志安,

（1.浙江省中藥研究所有限公司，浙江 杭州 310023；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310053；3.浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省特色中藥資源保護(hù)與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；4.磐安縣中藥創(chuàng)新發(fā)展研究院，浙江 磐安 322399）

白芷藥材為傘形科Apiaceae植物白芷Angelica dahurica或杭白芷A.dahuricavar.formosana的干燥根，具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿的功效[1]。白芷含有香豆素類、揮發(fā)油類、苷類、生物堿類、多糖類、氨基酸類等多種化學(xué)成分[2]，香豆素是白芷中含量較多的一大類活性成分。已有研究表明[3?5]：水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素、花椒毒酚等主要標(biāo)志性成分可以反映白芷藥材的質(zhì)量差異。在遺傳方面，劉倩倩等[6]和侯凱等[7]分別應(yīng)用分子標(biāo)記對不同白芷資源遺傳組成開展研究，結(jié)果顯示SSR和ISSR標(biāo)記均可以應(yīng)用于白芷資源的遺傳組成研究。然而已有研究的取樣范圍較窄，大多未包括傳統(tǒng)的北方白芷產(chǎn)區(qū)。同時(shí)，白芷資源存在產(chǎn)地變遷和引種栽培行為，但近10 a對白芷的研究集中在品質(zhì)成分、栽培技術(shù)和藥理等方面，而有關(guān)白芷遺傳的研究卻較少。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)是基于PCR技術(shù)的經(jīng)典標(biāo)記系統(tǒng)[8]，多應(yīng)用于藥用植物群體遺傳組成分析[9?10]。

遺傳組成和產(chǎn)地環(huán)境的差異均有可能引起白芷藥材品質(zhì)和化學(xué)組成變異，已有研究多是通過采集不同產(chǎn)地材料分析不同產(chǎn)區(qū)的白芷藥材品質(zhì)差異[4, 11]，沒有系統(tǒng)地分析不同白芷主產(chǎn)區(qū)樣品的遺傳組成及其與品質(zhì)變異的相關(guān)性。本研究收集中國白芷主產(chǎn)區(qū)種源，栽培于同一個(gè)資源圃內(nèi)，應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記對收集的白芷樣品進(jìn)行遺傳組成分析，從遺傳背景上對不同種源進(jìn)行區(qū)分，同時(shí)，通過測定7種香豆素化學(xué)成分對白芷進(jìn)行品質(zhì)評價(jià)，探究不同產(chǎn)地間白芷遺傳組成與品質(zhì)差異的相關(guān)性，為白芷藥材開發(fā)及新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年10月，在四川、浙江、安徽、河北、河南等白芷主產(chǎn)區(qū)省份收集25份白芷資源(表1)，栽培于杭州市原種場。2020年9月，在葉片枯萎時(shí)對同圃種植的25份白芷資源進(jìn)行采收，取白芷根部，55 ℃烘干后打粉，編號后置于4 ℃冰箱密封保存。

表1 供試白芷種源信息Table 1 Information of tested materials of A.dahurica

1.2 儀器和試劑

實(shí)驗(yàn)儀器主要包括Agilent 1260高效液相色譜儀(Agilent公司，美國)、色譜柱(Agilent Eclipse XDBC18 4.6 mm×250 mm)、Veriti 96 Well Thermal Cycler型 PCR 儀 (Thermo Fisher Scientific 公司，美國)、Power PacTM-Basic/HV 型電泳儀、GelDocTM XR +型凝膠成像儀 (美國 Bio-Rad 公司)。歐前胡素 (批號：HS19326S1)、異歐前胡素(批號：HS9499S1)、白當(dāng)歸素(批號：HR19108W3)、氧化前胡素(批號：HR71244W5)、佛手柑內(nèi)酯(批號：HR1141W8)、水合氧化前胡素(批號：HS91011B1)對照品均購自于寶雞市辰光生物科技有限公司；花椒毒酚對照品(批號：nkl211109006)購自于成都鈉鈳鋰生物科技有限公司；甲醇(批號：20210322)、乙醇(批號：20200710)為分析純，購自于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；流動(dòng)相甲醇為色譜純(批號：U9OG1H)，水為重蒸餾去離子水。三羥基甲基氨基甲烷(批號：T57320)、核酸染料YeaRed、2×HieffTM PCR Master Mix等均購自于上海翊圣生物科技有限公司；SRAP引物委托上海生工生物公司合成，置4 ℃冰箱保存。所有試劑均為分析純。

1.3 醇溶性浸出物含量檢測

取供試樣品粉末2 g，置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL水，密塞，稱質(zhì)量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用干燥濾器濾過，量取濾液10 mL，置于已干燥至恒量的蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱質(zhì)量。以供試樣品的干燥品計(jì)算供試樣品中的醇溶性浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)，每個(gè)供試樣品重復(fù)3次。

1.4 香豆素類化合物檢測

1.4.1 色譜條件 色譜柱為 Agilent Eclipse XDB-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇 (B)-水(A)，梯度洗脫百分值為體積分?jǐn)?shù)，洗脫程序?yàn)椋?～25 min，40%～45%B；25～45 min，45%～60%B；45～50 min，60%～80%B；50～60 min，80%B；60～70 min，80%～90%B；70～75 min，90%～40%B；75～80 min，40%B；流速為 1.0 mL·min?1；柱溫為 25 ℃；進(jìn)樣量為 10 μL；檢測波長設(shè)定為 300 nm。

1.4.2 對照樣品溶液的制備 稱取水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素、花椒毒酚適量，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，將其配置成1 mL分別含有0.728、0.659、0.699、0.639、0.721、0.747、0.639 mg標(biāo)準(zhǔn)品的單一對照樣品溶液；吸取上述儲(chǔ)備液適量，混合后加甲醇稀釋，使最終制成質(zhì)量濃度分別為12.760、4.482、5.768、35.649、37.856、14.498、6.390mg·L?1的混合對照樣品溶液。

1.4.3 供試樣品溶液的制備 取供試樣品粉末 (過 3 號篩) 1.0 g，置于 50 mL 量瓶中，加 45 mL 甲醇，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz) 1 h，取出，放冷，加甲醇至50 mL量瓶刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μm的微孔濾膜，即得供試樣品溶液。

1.5 PCR 擴(kuò)增及電泳檢測

每份樣品隨機(jī)剪取新鮮幼嫩的葉片，采用CTAB法[12]提取白芷DNA，基因組DNA用1×TE緩沖液將樣品DNA濃度調(diào)至100 mg·L?1，并置于4 ℃冰箱保存。篩選出擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好的8對SRAP 引物。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為 10 μL：模板 DNA(100 mg·L?1)1 μL，5′端引物 (10 μmol·L?1) 0.8 μL，3′端引物 (10 μmol·L?1) 0.8 μL，Mix-Taq 6 μL，滴加 ddH2O 至 10 μL。參考岑曉霞等[13]的方法進(jìn)行擴(kuò)增后，置于4 ℃冰箱保存。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行凝膠電泳，獲取條帶信息。

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

利用NTSYSpc 2.10e軟件對樣本進(jìn)行聚類分析并繪制樹狀圖。通過SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)檢驗(yàn)差異顯著性；通過Origin軟件，采用主成分分析法(PCA)[14]以降維方式提取主成分；通過中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004軟件建立對照指紋圖譜，計(jì)算樣品的指紋圖譜相似度。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳組成分析

2.1.1 SRAP 擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析 篩選的 8 對 SRAP 引物共擴(kuò)增 82 條條帶，其中多態(tài)性條帶有41條，多態(tài)性百分率為27.27%～80.00%，平均為50.00%，多態(tài)性最好的引物組合為Me4+Em8 (表2)。

表2 不同 SRAP 引物擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Statistical amplification results of different SRAP primers

2.1.2 基于分子標(biāo)記的聚類分析 利用分子標(biāo)記擴(kuò)增的條帶信息，以非加權(quán)組平均法(UPGMA)對25份白芷種源進(jìn)行聚類。從圖1可見：所有樣本分為2個(gè)大類群，在遺傳相似系數(shù)為0.84處，5個(gè)河北產(chǎn)區(qū)樣本聚為一類。在遺傳相似系數(shù)為0.87處，湖南、江蘇、山東3個(gè)產(chǎn)區(qū)的樣本單獨(dú)聚為一類；四川、重慶、浙江和部分河北種源共同聚為一類。總體而言，浙江、四川和部分河北產(chǎn)區(qū)的樣本基本各自聚為一類。本研究在河北和安徽產(chǎn)區(qū)采集的樣本散布在浙江或四川產(chǎn)區(qū)的分類中，推測可能存在白芷種質(zhì)資源引種行為。

圖1 基于分子標(biāo)記信息的不同白芷資源UPGMA聚類圖Figure 1 UPGMA dendrogram of different A.dahurica resources based on molecular marker

2.2 品質(zhì)特征分析

2.2.1 高效液相色譜法 (HPLC)檢測體系構(gòu)建 取混合對照樣品溶液 2、4、6、8、10、12、14、16、20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量(x, μg)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素、花椒毒酚的線性回歸方程(表3)，判定系數(shù)R2均大于0.999，證明各化合物在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。對本研究建立的HPLC檢測體系進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果顯示該方法合理可行。

表3 白芷藥材 7 種香豆素類化合物成分的線性關(guān)系Table 3 Linear relationships of 7 coumarin compounds in A.dahurica

2.2.2 香豆素和浸出物成分定量分析 取25份同圃種植的白芷藥材，應(yīng)用HPLC法定量7種香豆素類成分。從表4可見：25份白芷種質(zhì)資源的7種香豆素成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)從高到低依次為歐前胡素、氧化前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、花椒毒酚，均值分別為2.428、1.404、0.806、0.317、0.181、0.057、0.007 mg·g?1。國家藥典委員會(huì)規(guī)定白芷藥材的歐前胡素質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于0.080%[15]，本研究中，資源圃25份白芷樣品歐前胡素質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅樣品HBD-1未達(dá)國家藥典委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)，而樣品AH-S、ZJ-F、ZJ-M歐前胡素質(zhì)量分?jǐn)?shù)表現(xiàn)突出，高于4 mg·g?1。對25份白芷藥材的7種香豆素類化合物成分進(jìn)行PCA分析(圖2A)，結(jié)果顯示：第1主成分(PC1)解釋了53.5%的方差，第2主成分(PC2)解釋了23.7%的方差，2個(gè)主成分可解釋原變量的77.2%的信息，可見，種源與成分組成沒有明確規(guī)律。應(yīng)用共有峰峰面積，對25份白芷樣品進(jìn)行PCA分析(圖2B)，結(jié)果顯示：浙江種源的白芷材料與其他種源出現(xiàn)了一定的分離。

圖2 基于 HPLC 的不同白芷藥材成分 PCA 分析Figure 2 PCA analysis of A.dahurica based on HPLC

表4 不同種源白芷的香豆素類成分和醇溶性浸出物特征Table 4 Contents of coumarin components and ethanol-soluble extractives in A.dahurica

2.2.3 基于 HPLC 特征峰值的品質(zhì)變異度分析 通過HPLC特征峰的指紋圖譜數(shù)據(jù)分析，25份樣品的色譜圖如圖3A所示，其中標(biāo)定共有峰17個(gè)，如圖3B所示。其中樣品ZJ-L在27 min時(shí)有較強(qiáng)的吸收峰，其余樣品在此處的吸收峰較小。另外，不同樣品共有峰峰面積差異較大。

圖3 不同白芷藥材的 HPLC 指紋圖譜Figure 3 HPLC fingerprints of A.dahurica

3 討論

SRAP分子標(biāo)記方便快速，不需要預(yù)先知道DNA順序信息，結(jié)果穩(wěn)定可靠，再現(xiàn)性高，重復(fù)性好，適合用于遺傳多樣性和親緣關(guān)系等方面的研究[16]。對比其他藥用植物群體的遺傳組成研究結(jié)果，本研究表明：栽培白芷具有較好的遺傳多樣性，這可能與其有性繁殖的形式有關(guān)[17]，不同產(chǎn)區(qū)白芷種源的遺傳組成相近，種源間遺傳分化較弱，這與侯凱等[7]的分析結(jié)果一致。與此同時(shí)，部分來自河北和安徽地區(qū)的白芷種源與南方杭白芷聚為一組，無明顯區(qū)分，卻與北方本地種源遺傳差異較大，該聚類結(jié)果可能與不同產(chǎn)區(qū)白芷資源的種差異有關(guān)，而同為杭白芷種的四川種源與浙江種源分別聚集，可能與引種后的地理隔離有關(guān)[18]。與白芷類似，同為傘型科植物的前胡Peucedanum praeruptorum，同樣因?yàn)槿藶橐N導(dǎo)致栽培種的遺傳分化變小[19]。李嘉惠等[20]基于SRAP分子標(biāo)記構(gòu)建何首烏Fallopia multiflora核心種質(zhì)庫，結(jié)果表明野生何首烏的遺傳多樣性比栽培居群的大，栽培居群間分化程度極高，但基因交流極小，說明栽培行為對遺傳分化影響較大。

已有研究僅應(yīng)用10份樣本檢測表明：不同產(chǎn)區(qū)間白芷藥材的品質(zhì)差異顯著[4]，也有研究對各產(chǎn)地白芷藥材香豆素類成分分析表明：河南、河北與四川、安徽的白芷藥材根據(jù)香豆素類成分差異被分為兩類[20]，而本研究增大了研究樣本后發(fā)現(xiàn)：不同種源同圃栽培后品質(zhì)沒有明顯的種源區(qū)別，這說明不同產(chǎn)區(qū)的環(huán)境因子可能是影響不同產(chǎn)區(qū)白芷品質(zhì)差異的主要因素。同時(shí)，浙江傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)的種源品質(zhì)特征與其他主產(chǎn)區(qū)呈現(xiàn)出一定的差異性，即遺傳分化體現(xiàn)在品質(zhì)特征分化上，該結(jié)果可能是浙江的老產(chǎn)區(qū)多為個(gè)別農(nóng)戶留種小面積栽培，不與其他產(chǎn)區(qū)進(jìn)行品種交流而導(dǎo)致的。