杜仲WOX家族基因鑒定及在葉片發(fā)育中的表達(dá)

劉 俊，李 龍，陳玉龍，陳隨清

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥科學(xué)院 河南省中醫(yī)方證信號(hào)傳導(dǎo)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046；2.國際竹藤中心國家林業(yè)和草原局/北京市共建竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102；3.國際竹藤中心 安徽太平試驗(yàn)中心，安徽 黃山 245716；4.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100；5.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046）

Wuschel-related homeobox (WOX)是植物特有的新型轉(zhuǎn)錄因子，屬于Homepbox (HOX)超家族，包含由60～65個(gè)氨基酸組成的螺旋-環(huán)-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的保守結(jié)構(gòu)域。WOX家族基因分為3個(gè)獨(dú)立進(jìn)化支，即現(xiàn)代進(jìn)化支 (modern clade，WUS)，中間進(jìn)化支 (intermediate clade)和遠(yuǎn)古進(jìn)化支 (ancient clade)[1?3]，其中WUS是最早發(fā)現(xiàn)的WOX家族成員[4]。WOXs蛋白在植物胚胎形成[5]、干細(xì)胞維持[6]和花發(fā)育[7]等方面發(fā)揮重要作用。擬南芥Arabidopsis thaliana中WOX家族有15個(gè)成員，分別是AtWUS和AtWOX1～AtWOX14[4]，其中，AtWOX10、AtWOX13和AtWOX14蛋白屬于遠(yuǎn)古進(jìn)化分支，AtWUS和AtWOX1～7等8個(gè)蛋白質(zhì)屬于WUS分支，AtWOX8、AtWOX9、AtWOX11和AtWOX12蛋白屬于中間進(jìn)化分支。AtWUS在胚珠、花藥和莖尖分生組織中表達(dá)，是維持中央分生組織的關(guān)鍵基因，AtWOX11和AtWOX12參與新生根器官發(fā)生，在頂端分生組織發(fā)育階段，AtWUS參與干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持[8]。超表達(dá)AtWUS促進(jìn)棉花Gossypium hirsutum體細(xì)胞胚胎發(fā)育和器官發(fā)生[9]。水稻Oryza sativa中，OsWOX11激活冠根的萌發(fā)和生長，過表達(dá)OsWOX11可促進(jìn)雌蕊增加[10]；OsWOX3A參與水稻葉片、小穗、分蘗和側(cè)根的發(fā)育[11]；在莖頂端分生組織和腋分生組織中OsWOX4正調(diào)控干細(xì)胞[12]。超表達(dá)WOX11 (PeWOX11a和PeWOX11b)或WOX11/12a增加轉(zhuǎn)基因植株不定根數(shù)量[13?14]。在小麥Triticum aestivum中超表達(dá)TaWUS影響外花輪狀器官發(fā)育，TaWOX9促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥根的發(fā)育[15]。

WOXs轉(zhuǎn)錄因子不僅調(diào)控植物生長發(fā)育，而且參與脅迫響應(yīng)。在水稻中OsWOX12A和OsWOX12B等基因的表達(dá)受干旱、寒冷和鹽脅迫差異調(diào)控，超表達(dá)OsWOX11通過促進(jìn)根毛生長發(fā)育提高轉(zhuǎn)基因植株干旱脅迫耐受性[16?17]。84K楊樹Populus alba×P.glandulosa中，干旱脅迫誘導(dǎo)PagWOX11/12a基因強(qiáng)烈表達(dá)，促進(jìn)根系伸長和生物量生長，上游調(diào)控因子PagERF35激活PagWOX11/12a表達(dá)[18]，PagWOX11/12a通過調(diào)控PagCYP736A12 基因表達(dá)，調(diào)節(jié)活性氧 (reactive oxygen species，ROS )清除，提高楊樹耐鹽性[19]。

杜仲Ecommia ulmoides是杜仲科Eucommiaceae杜仲屬Eucommia的落葉喬木，為中國二級(jí)保護(hù)植物，葉片、樹皮和果皮中富含杜仲膠，是重要的膠用和藥用經(jīng)濟(jì)樹種，具有極高的開發(fā)利用價(jià)值[20]。杜仲葉片中含有綠原酸、黃酮類、木脂素類、環(huán)烯醚萜類、α-亞麻酸等藥用成分，具有抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等重要作用[21?22]。鑒于WOX基因在擬南芥、水稻、玉米Zea mays、楊樹、油菜Brassica napus、鐵皮石斛Dendrobium officinale等中的作用，推測(cè)WOX家族基因可能在杜仲葉芽的形成和激活過程中起關(guān)鍵作用。本研究以杜仲基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，對(duì)杜仲WOX家族基因進(jìn)行了全基因組鑒定和生物信息學(xué)分析，基于轉(zhuǎn)錄組分析WOX在杜仲葉片不同發(fā)育時(shí)期以及杜仲膠形成中的表達(dá)模式，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)杜仲WOX基因(EuWOXs)在‘紫葉’杜仲‘Ziye’葉片發(fā)育中的表達(dá)水平，以期為EuWOXs功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

自西北農(nóng)林科技大學(xué)苗圃(陜西楊凌)，取生長正常長勢(shì)一致的2年生‘紫葉’杜仲幼苗的葉芽(莖尖)、生長葉(3 cm長葉片)、幼葉(完全展開的新葉)，用液氮迅速處理，置于?80 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 杜仲WOX蛋白(EuWOXs)的鑒定及理化性質(zhì)分析 擬南芥WOX蛋白序列下載于TAIR數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)，根據(jù)Pfam號(hào)(PF00046)在杜仲基因組數(shù)據(jù)庫中篩選出WOX家族基因候選序列，利用美國國立生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI)的保守結(jié)構(gòu)域搜索服務(wù)(Conserved Domain Search Service，CD Search)檢測(cè)蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域，篩選出具有完整WOX結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)作為EuWOX家族成員，利用生物信息學(xué)方法[23]分析EuWOXs的理化性質(zhì)。

1.2.2 杜仲WOX家族基因染色體定位及系統(tǒng)進(jìn)化分析 通過杜仲基因組數(shù)據(jù)庫搜索WOX基因在染色體上的位置及每條染色體長度，利用MapGene2Chromosome v2 (http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)軟件繪制WOX家族基因染色體定位。利用DNAMAN進(jìn)行蛋白序列比對(duì)，通過Clustal X 1.83對(duì)杜仲、擬南芥、毛果楊、水稻和玉米WOXs蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA 6.0鄰接法(neighbor-joining)，重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1 000次[24]，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)擬南芥同源基因?qū)uWOXs蛋白命名。

1.2.3EuWOXs的結(jié)構(gòu)、基序及啟動(dòng)子分析利用GSDS(http://gsds.gao-lab.org/index.php)軟件分析EuWOXs的內(nèi)含子和外顯子分布。利用MEME (http://meme-suite.org/)軟件分析EuWOXs基序，參數(shù)設(shè)置為：any number of Repetitions，maximum number of Motifs=20，minimum width≥6，and maximum width≤50。分離EuWOXs啟動(dòng)子 (ATG)上游 2 000 bp 序列，利用 Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htmL/)分析EuWOXs啟動(dòng)子順式作用元件。

1.2.4EuWOXs的表達(dá)模式分析 從 NCBI的 Short Read Arshive (SRA)數(shù)據(jù)庫中下載‘秦仲 1 號(hào)’‘Qinzhong No.1’葉片不同發(fā)育時(shí)期(葉芽、初生葉、幼葉、老葉)(版本號(hào)：SRP218063)[25]及高產(chǎn)膠杜仲品種‘秦仲2號(hào)’‘Qinzhong No.2’、低產(chǎn)膠杜仲品種‘小葉’‘Xiaoye’(版本號(hào)：SRP158357)[26]的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用每1百萬個(gè)映射上的堿基中映射到外顯子的每1千個(gè)堿基上的堿基個(gè)數(shù)(fragments per kilobase million，F(xiàn)PKM)值表示EuWOXs相對(duì)表達(dá)豐度，取對(duì)數(shù) (log2)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用TBtools工具繪制基因表達(dá)圖譜[27]。

使用Trizol(天根DP424)提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)EuWOXs特異性引物 (引物序列見表 1)，通過 Quant Studio 6(新加坡 Life Technologies公司)，All-in-One SYBR Premix EX TaqTM kit(美國 Gene Copoeia公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(RT-qPCR)反應(yīng)，10 μL 反應(yīng)體系：2× mix 5.00 μL、正向引物/反向引物各 0.25 μL、cDNA 2.00 μL、ROX 0.20 μL、雙蒸水 2.30 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃ 變性 10 s，60 ℃ 退火 10 s，72 ℃ 延伸 20 s，45 個(gè)循環(huán)。以UBCE2 為內(nèi)參基因[26]，通過 2???Ct法對(duì)3次生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 EuWOXs蛋白互作關(guān)系分析 通過 STRING 軟件 (https://string-db.org/)上傳 EuWOXs蛋白質(zhì)序列，利用擬南芥數(shù)據(jù)庫，根據(jù)擬南芥WOXs蛋白已知互作關(guān)系，預(yù)測(cè)EuWOXs互作蛋白，通過Cytoscape 3.7.0軟件對(duì)EuWOXs蛋白質(zhì)互作信息進(jìn)行評(píng)估和預(yù)測(cè)[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲WOX家族基因鑒定及其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

由表2可知：從杜仲基因組中共鑒定到8個(gè)EuWOXs，分布在8條染色體上(圖1)；均含有HD保守結(jié)構(gòu)域，其中EuWOX1序列最長，編碼352個(gè)氨基酸，EuWOX13-2序列最短，編碼191個(gè)氨基酸。EuWOXs分子量為22.12～40.36 kDa，EuWOX11等電點(diǎn)最小，為5.62，EuWOX4-1等電點(diǎn)最大，為9.04；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：EuWOXs均定位在細(xì)胞核中，均為親水性蛋白。

圖1 EuWOXs 染色體位點(diǎn)Figure 1 Chromosome site of EuWOXs genes

表2 EuWOXs 蛋白質(zhì)序列特征及亞細(xì)胞定位Table 2 Sequence characteristics and subcellular location of E.ulmoides WOX proteins

2.2 EuWOXs的保守結(jié)構(gòu)域

利用DNAMAN軟件對(duì)8個(gè)EuWOXs及12個(gè)擬南芥WOXs蛋白(AtWOXs)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行序列分析。結(jié)果(圖2)顯示：WOXs蛋白質(zhì)HD結(jié)構(gòu)域氨基酸及其分布具有顯著的相似性，均包含由60個(gè)氨基酸組成的螺旋-環(huán)-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋，螺旋較環(huán)和轉(zhuǎn)角保守。谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)和脯氨酸(Pro)是螺旋Ⅰ (Helix Ⅰ)結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸，脯氨酸、異亮氨酸(Ile)和亮氨酸是螺旋Ⅱ (Helix Ⅱ)結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸，相比之下，螺旋Ⅲ (Helix Ⅲ)結(jié)構(gòu)域最為保守，其中保守氨基酸有天冬酰胺(N)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、谷氨酰胺、天冬酰胺和精氨酸(R)。EAR-like僅存在于EuWOX1、EuWOX2、EuWOX4-1、EuWOX4-2和EuWOX5中，屬于WUS，暗示EuWOXs在進(jìn)化過程中具有保守性。

圖2 擬南芥和杜仲 WOXs的蛋白質(zhì)同源結(jié)構(gòu)域序列分析Figure 2 Sequence analysis of WOX proteins homeo domain in A.thaliana and E.ulmoides

2.3 不同物種WOX家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

對(duì)8個(gè)杜仲EuWOXs、15個(gè)擬南芥AtWOXs、18個(gè)毛果楊Populus trichocarpaWOX蛋白(PotriWOXs)、13個(gè)水稻OsWOXs、20個(gè)玉米ZmWOXs的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重比對(duì)，構(gòu)建無根系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如 圖3所示：74個(gè)WOXs蛋白共分為3組[遠(yuǎn)古進(jìn)化支、中間進(jìn)化支和現(xiàn)代進(jìn)化支(WUS)]，其中遠(yuǎn)古進(jìn)化支含有12個(gè)WOXs蛋白，中間進(jìn)化支含22個(gè)WOXs蛋白，現(xiàn)代進(jìn)化支包含的蛋白數(shù)量最多，共有40個(gè)。8個(gè)EuWOXs中，EuWOX13-1和EuWOX13-2屬于遠(yuǎn)古進(jìn)化支，EuWOX11屬于中間進(jìn)化支，EuWOX1、EuWOX2、EuWOX5、EuWOX4-1和 EuWOX4-2等 5個(gè)蛋白質(zhì)屬于WUS。進(jìn)化結(jié)果顯示：杜仲與毛果楊親緣關(guān)系最近。

圖3 杜仲、擬南芥、毛果楊、水稻和玉米WOXs蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 WOX proteins phylogenetic trees of E.ulmoides, A.thaliana, P.trichocar, O.sativa and Z.mays

2.4 EuWOXs基因結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域

利用GSDS軟件構(gòu)建EuWOXs基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)圖，結(jié)果如圖4顯示：EuWOXs含有1～3個(gè)內(nèi)含子，EuWOX13-2、EuWOX2和EuWOX5基因含有2個(gè)外顯子，EuWOX11、EuWOX13-1、EuWOX4-1和EuWOX4-2含有3個(gè)外顯子，EuWOX1含有4個(gè)外顯子。不同進(jìn)化分支基因結(jié)構(gòu)差異顯著，同一分支基因結(jié)構(gòu)也存在差異。屬于中間進(jìn)化支的EuWOX11含有3個(gè)外顯子，同屬遠(yuǎn)古進(jìn)化支的EuWOX13-1和EuWOX13-2分別含有3個(gè)和2個(gè)外顯子，在WUS中，EuWOX2和EuWOX5含有2個(gè)外顯子，EuWOX4-1和EuWOX4-2含有3個(gè)外顯子，而EuWOX1含有4個(gè)外顯子。

圖4 杜仲 WOX 家族基因的結(jié)構(gòu)分析Figure 4 Structural analysis of WOX gene family in E.ulmoides

蛋白質(zhì)保守基序分析顯示：EuWOXs含有10個(gè)保守基序，分別命名為Motif 1～Motif 10 (圖5)，其中Motif 1和Motif 2最為保守，是WOX的核心基序，存在于所有EuWOXs中。Motif 6較為保守，存在于4個(gè)EuWOXs蛋白質(zhì)(EuWOX4-2、EuWOX2、EuWOX1和EuWOX5)中。相同分支EuWOXs含有相似的保守基序，不同分支EuWOXs基序之間存在顯著差異，Motif 4～Motif 10只存在于現(xiàn)代進(jìn)化分支，Motif 3只在EuWOX13-1和EuWOX13-2蛋白質(zhì)中存在。

圖5 杜仲 WOX 基因家族保守基序分析Figure 5 Conserved motifs analysis of E.ulmoides WOX gene family

2.5 杜仲 EuWOXs啟動(dòng)子順式作用元件分析

順式作用元件分析結(jié)果(圖6)顯示：EuWOXs啟動(dòng)子中主要包括脫落酸(ABRE)和水楊酸反應(yīng)元件(TCA-element)、厭氧響應(yīng)元件(ARE)、光響應(yīng)元件(Box 4)及玉米蛋白代謝調(diào)節(jié)元件(O2-site)。所有順式作用元件中光響應(yīng)元件最多，達(dá)77個(gè)，其中Box 4元件有26個(gè)，所占比例是34%；G-box和GT1-motif元件均有9個(gè)，占比為12%，表明EuWOXs基因表達(dá)可能與光合作用有關(guān)。EuWOXs共含有46個(gè)激素響應(yīng)元件，32個(gè)脅迫響應(yīng)元件，其中ABRE和ARE元件數(shù)量最多，均含有14個(gè)，所占比例分別為31%和44%，暗示EuWOXs參與杜仲激素及脅迫響應(yīng)。此外EuWOXs共含有12個(gè)生長發(fā)育調(diào)控相關(guān)元件，其中O2-site有6個(gè)，占50%。

圖6 EuWOXs 基因啟動(dòng)子順式作用元件分析Figure 6 Cis-element analysis of EuWOX genes promoter

2.6 EuWOXs基因表達(dá)模式分析

利用‘秦仲1號(hào)’葉片不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)EuWOXs基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果(圖7)可見：EuWOXs在葉片不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)豐度存在顯著差異，EuWOX11和EuWOX2在杜仲葉芽、初生葉、幼葉、老葉時(shí)期均不表達(dá)，EuWOX5僅在葉芽和老葉中低表達(dá)，EuWOX13-2在4個(gè)時(shí)期中的FPKM值均大于20，推測(cè)EuWOX13-2參與杜仲葉片的整個(gè)發(fā)育過程；EuWOX13-1和EuWOX4-1在葉芽中表達(dá)豐度最高，隨著葉片發(fā)育表達(dá)水平逐漸降低，表明EuWOX13-1和EuWOX4-1主要在葉芽中發(fā)揮作用；EuWOX1在生長葉中表達(dá)量相對(duì)較高，其余EuWOXs基因表達(dá)豐度較低，F(xiàn)PKM值小于5。

圖7 EuWOXs 在杜仲葉片不同發(fā)育階段的表達(dá)模式Figure 7 Expression patterns of EuWOXs at different developmental stages in E.ulmoides leaves

利用RT-qPCR檢測(cè)EuWOXs在‘紫葉’杜仲葉片不同發(fā)育階段(葉芽、生長葉、幼葉)的表達(dá)水平。結(jié)果(圖8)可見：EuWOX1、EuWOX2、EuWOX4-1、EuWOX5和EuWOX13-2在生長葉中表達(dá)量最高，隨著葉片發(fā)育表達(dá)水平呈先升高后降低趨勢(shì)，EuWOX4-2在幼葉中表達(dá)量最高，EuWOX13-1在葉芽中表達(dá)量最高，隨著葉片發(fā)育，表達(dá)量逐漸降低，暗示EuWOX13-1在葉片發(fā)育的起始階段發(fā)揮重要作用。EuWOX1、EuWOX13-1和EuWOX13-2在‘紫葉’杜仲葉片中的表達(dá)趨勢(shì)與‘秦仲1號(hào)’一致。

圖8 杜仲EuWOXs基因在杜仲葉片不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式Figure 8 Expression pattern of EuWOX genes in E.ulmoides leaves at different developmental stages

利用‘秦仲2號(hào)’和‘小葉’杜仲成熟葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)檢測(cè)EuWOXs的表達(dá)模式。由如圖9可見：大部分EuWOXs轉(zhuǎn)錄水平較低，其中有6個(gè)EuWOXs基因幾乎不表達(dá)，EuWOX13-2表達(dá)水平最高，F(xiàn)PKM值＞40，不同膠含量樣品之間無顯著差異，推測(cè)EuWOXs在杜仲膠形成過程中發(fā)揮作用較小。

圖9 EuWOXs 在杜仲膠形成中的表達(dá)模式Figure 9 Expression patterns of EuWOX genes in the form of Eu-rubber

2.7 EuWOXs蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)分析

植物WOXs蛋白由多基因家族編碼，蛋白質(zhì)之間可能存在相互作用。利用STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建EuWOXs蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。圖10顯示：該網(wǎng)絡(luò)包含21個(gè)節(jié)點(diǎn)(互作蛋白)和82條邊(相互作用組合)。EuWOX4-1可與20個(gè)蛋白質(zhì)互作，其中包含干細(xì)胞分化抑制因子(CLE41和CLE44)，細(xì)胞增殖和愈傷組織形成蛋白(CLV1、CLV3和ACT7)，胚胎發(fā)育相關(guān)蛋白(TPL、BBM和APM1)，維管組織發(fā)育蛋白(PXY、HB-8、ATHB-15、MOL和RUL1)，細(xì)胞程序化死亡調(diào)控因子(LOL1)，參與DNA的復(fù)制和延伸(MCM1、POLD2)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(F14K14)，花藥發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控因子(RPK2)，參與DNA的復(fù)制植物發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GRAS(HAM3和SCL27)等，推測(cè)EuWOXs全面參與了杜仲的生長發(fā)育。

圖10 EuWOXs 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)Figure 10 Prediction of interaction network between EuWOX proteins

3 討論

WOX蛋白是植物特有的高度保守的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物的生長發(fā)育、干細(xì)胞維持、組織器官發(fā)生和形成等多種生物學(xué)過程。到目前為止，WOX家族基因已在多個(gè)物種進(jìn)行了研究報(bào)道，如擬南芥中含有15個(gè)、毛果楊18個(gè)、水稻中有13個(gè)、玉米中有20個(gè)、毛竹Phyllostachys edulis中存在27個(gè)[29]，小麥中有 26個(gè)[30]、茶樹Camellia sinensis中包含 18個(gè)[31]，黃瓜Cucumissativus中有 11個(gè)[3]，陸地棉Gossypium hirsutum中含有 38 個(gè)[32]。小麥 (17 Gb)[33]、玉米 (2 300 Mb)[34]和毛竹 (2 021 Mb)[35]基因組大于杜仲 (1.2 Gb)[36]，擬南芥 (164 Mb)[37]、水稻 (441 Mb)[38]和毛果楊 (392.3 Mb)[39]基因組小于杜仲。杜仲WOX數(shù)量低于擬南芥、毛果楊、水稻、玉米、小麥和毛竹，表明WOXs基因的豐富程度與基因組大小無關(guān)，這可能與基因重復(fù)有關(guān)。

杜仲基因組中共鑒定出8個(gè)EuWOXs，分布在8條染色體上。EuWOXs均為核定位蛋白，在現(xiàn)代進(jìn)化支(WUS)、中間進(jìn)化支和遠(yuǎn)古進(jìn)化支分別含有5、1和2個(gè)成員，其系統(tǒng)發(fā)育模式與擬南芥、水稻、陸地棉等類似[29，31?32]。EuWOXs基因啟動(dòng)子中含有多種生長發(fā)育、激素響應(yīng)、非生物脅迫以及光周期響應(yīng)元件。在水稻中，WUS的OsWOX5和中間進(jìn)化支的OsWOX11、OsWOX12A和OsWOX12B基因表達(dá)受生長素、細(xì)胞分裂素和赤霉素調(diào)節(jié)，超表達(dá)OsWOX11可提高水稻抗旱性[16?17]。細(xì)胞分裂素強(qiáng)烈促進(jìn)蘋果Malus pumilaWOX1和WOX3基因表達(dá)，生長素誘導(dǎo)黃瓜CsWOX1b和CsWOX3基因表達(dá)[3]。在擬南芥中，生長素反應(yīng)因子 5 (AUXIN RESPONSE FACTOR，ARF5)上調(diào)AtWOX1 和PRS(AtWOX3)基因的表達(dá)，ARF2、ARF3和ARF4抑制AtWOX1和PRS的表達(dá)[40]。OsWOX3A參與水稻器官發(fā)育、葉片橫向軸伸長、穎花外稃形態(tài)發(fā)生以及分蘗和側(cè)根發(fā)育[10]，MtWOX1的同源基因STENOFOLIA是蒺藜苜蓿Medicago truncatula葉片生長和維管組織形成的必須基因[41]，PttWOX4在楊樹形成層中特異表達(dá)，PttWOX4a/b RNAi干擾后導(dǎo)致維管形成層寬度縮小，次生生長減弱[42]。推測(cè)EuWOXs可能在杜仲生長發(fā)育、激素和脅迫響應(yīng)等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。

WOX家族基因參與葉片發(fā)育。屬于中間支的AtWOX9/STIMPY過表達(dá)導(dǎo)致擬南芥葉緣波浪化[43]，SlLAM1主要在番茄Solanum lycopersicum葉片、花和果實(shí)中表達(dá)，SlLAM1缺失導(dǎo)致葉片變窄，次生小葉數(shù)量減少[44]，超表達(dá)黃瓜CsWOX9導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥角果變短，蓮座葉和分枝數(shù)目增加[3]。來源于WUS的AtWOX3是擬南芥?zhèn)韧腥~發(fā)育的必需基因，Atwox1和Atwox3缺失突變體導(dǎo)致葉片和花器官變窄，影響葉片橫向擴(kuò)張和花瓣融合[45?46]；GhWOX9_At，GhWUSa_At和GhWUSb_Dt主要在棉花幼葉中高量表達(dá)[47]。遠(yuǎn)古進(jìn)化分支中的OsWOX13在水稻葉、莖、根維管組織中表現(xiàn)為空間表達(dá)調(diào)控，在花和發(fā)育中的種子中是時(shí)間表達(dá)調(diào)控[48]。在杜仲中，EuWOX13-1在葉芽中表達(dá)量最高，隨著葉片發(fā)育，轉(zhuǎn)錄水平逐漸降低，暗示EuWOX13-1主要在杜仲葉片發(fā)育的早期階段發(fā)揮作用。EuWOX13-2在生長葉中表達(dá)量較高，在葉片發(fā)育過程中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。EuWOX13-1和EuWOX13-2是一對(duì)重復(fù)基因，其表達(dá)水平的差異可能與基因結(jié)構(gòu)不同有關(guān)，也可能是EuWOX13-1和EuWOX13-2在重復(fù)后發(fā)生了功能分化。在甘藍(lán)型油菜Brassica napus中，BnCWOX13a與BnCWOX13c互為同源基因，然而它們的表達(dá)趨勢(shì)完全不同[49]，在擬南芥中，AtWOX13在初生根、側(cè)根、雌蕊和胚發(fā)育中動(dòng)態(tài)表達(dá)，而AtWOX13的直系同源基因AtWOX14只在側(cè)根形成的早期階段和發(fā)育的花藥中特異表達(dá)[50]，由此推測(cè)EuWOX13-2可能只獲得了EuWOX13-1基因的部分功能，具體功能還需要進(jìn)一步研究。