毛細(xì)管電泳多重RT-PCR法在兒童呼吸道感染中的應(yīng)用分析

李云 沈國松 楊帆 閔晶 李剛

急性呼吸道感染是兒科常見的感染性疾病之一，在嬰幼兒及學(xué)齡期兒童中，呼吸道病毒感染率遠(yuǎn)比成人多，年齡越小發(fā)生感染的比例越高[1]。病毒的流行特點(diǎn)、臨床癥狀相似且感染力強(qiáng)、傳播快，嚴(yán)重威脅小兒的生命健康。因此了解本地區(qū)病原體的流行病學(xué)特征，對兒童呼吸道感染的診療具有重要的臨床意義[2]。本次研究分析毛細(xì)管電泳多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法在兒童呼吸道感染中的應(yīng)用效果?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2021 年12 月至2022 年3 月湖州市婦幼保健院呼吸道感染住院患兒的標(biāo)本共478 例，其中男性283 例、女性195 例；年齡13 d～16 歲，平均年齡（1.68±1.62）歲；呼吸道感染診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》第7 版[3]。本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過，所有采樣和資料收集均獲得患兒監(jiān)護(hù)人同意。

1.2 方法 采用睿司倍?13 種呼吸道病原體核酸檢測試劑盒（由寧波海爾施基因科技公司生產(chǎn)）檢測13 種呼吸道病毒，分別是甲型流感病毒（influen?za A virus，InfA）、甲型流感病毒H1N1（influenza A H1N1 virus，H1N1）、季節(jié)性H3N2 病毒（influenza A H3N2 virus，H3N2）、乙型流感病毒（influenza B vi?rus，InfB）、腺病毒（human adenovirus，HADV）、博卡病毒（human bocavirus，HBoV）、鼻病毒（human rhi?novirus，HRV）、副流感病毒（human parainfluenza vi?rus，HPIV）、冠狀病毒（human coronavirus，HCoV）、呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV）、偏肺病毒（human metapneumovirus，HMPV）、肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，Mp）和衣原體（chlamydia，Ch）。

1.2.1 標(biāo)本采集 入選患兒住院后立即采集標(biāo)本，采用絨毛拭子從患兒咽后壁涂抹咽部分泌物標(biāo)本，立即置于專用保存管中，-70 ℃低溫冰箱保存至檢測。

1.2.2 病毒核酸提取 采用全自動核酸提取儀Smart LabAssist-16（由臺灣圓點(diǎn)奈米技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)），按照核酸提取或純化試劑盒（由寧波海爾施基因科技有限公司生產(chǎn)）說明書提取標(biāo)本、陰陽性對照中的核酸。

1.2.3 多重RT-PCR 擴(kuò)增 使用13 種呼吸道病原體多重檢測試劑盒（由寧波海爾施基因科技有限公司生產(chǎn)），采用PCR 毛細(xì)電泳片段分析法。多重PCR產(chǎn)物置4 ℃保存至電泳檢測。

1.2.4 電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物 采用1T400 Sanger 測序儀（由寧波海爾施基因科技有限公司生產(chǎn)）對結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.00 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 呼吸道病原體的檢出情況 478 例患兒中共檢出呼吸道病原體感染者342 例，檢測陽性率為71.55%（342/478）。共檢出病毒381 份，病毒檢出率為79.71%（381/478）。13 種呼吸道病原體的檢出率見表1。

表1 13 種呼吸道病原體檢出結(jié)果

由表1 可見，HRSV 的檢出率最高，達(dá)26.78%（128/478），其次為HRV 和HPIV，檢出率分別為18.20%（87/478）和10.67%（51/478）。H1N1 和H3N2未檢出。

2.2 呼吸道病所原體混合感染的檢出情況 478 例呼吸道病原體感染陽性標(biāo)本中，1 種病原體單一感染305 例，占89.18%（305/342），感染率63.81%（305/478）；2 種及以上病原體混合感染37 例，占10.82%（37/342），感染率7.74%（37/478）?；旌细腥揪唧w感染類型及檢出率見表2。

由表2 可見，在混合感染中，以2 種病原體合并感染為主，占94.59%（35/37），HRV 合并感染最多，占75.68%（28/37），其中以HRV+HRSV 混合感染多見。有2 例是3 種病原體混合感染，分別是HRV+HRSV+HPIV和HRV+HPIV+HCoV 混合感染。2.3 呼吸道病原體在不同性別中的檢出情況 478 例呼吸道感染患兒中男性283 例、女性195 例。男性患兒中呼吸道病原體檢測陽性率為68.90%（195/283），女性患兒為75.38%（147/195），二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.38，P＞0.05）。在男、女性患兒中，檢出率最高的前3 種病原體均為HRSV、HRV 和HPIV。

表2 混合感染類型檢出情況

2.4 呼吸道病原體在不同年齡組中的檢出情況見表3

由表3 可見，5 個(gè)年齡組組間的13 種呼吸道病原體檢出率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=113.55，P＜0.05）。其中InfB、HADV、HRV、HRSV 和Ch 在不同年齡組患兒中的檢出率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別=16.78、12.24、14.21、65.80、15.24，P均＜0.05）。

表3 13 種呼吸道病原體在不同年齡組中的檢出率/例（%）

2.5 呼吸道病原體在不同月份中的檢出情況見表4

由表4 可見，各月份組間的檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.32，P＜0.05）。其中HMPV、HCoV和HRSV在各月份組間的檢出率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別=38.64、10.82、11.21，P均＜0.05）。

表4 13 種呼吸道病原體在不同月份的檢出率/例（%）

3 討論

急性呼吸道感染大多是由病毒引起的，病毒在不同地區(qū)、不同人群的病原學(xué)和流行病學(xué)表現(xiàn)均存在一定的差異，甚至在相同地區(qū)的不同年份也存在一定的差異。因此了解本地區(qū)的流行病學(xué)特征，對兒童呼吸道感染的診斷與治療具有重要的臨床意義。

本次研究采用基于毛細(xì)管電泳的多重RT-PCR方法對13 種呼吸道病原體進(jìn)行檢測，在本次研究中呼吸道病原體的總檢出率為71.55%，稍高于劉文淵等[4]報(bào)道的寧波市兒童呼吸道感染病原體的檢出率（66.16%），明顯高于姚娟等[5]報(bào)道的2011～2013 年住院兒童呼吸道感染病原體的檢出率（21.96%）。病原體的總檢出率不同，考慮可能與檢測方法、檢測病原種類以及地區(qū)、季節(jié)差異有關(guān)。本次研究和劉文淵等[4]采用的都是高靈敏度的分子檢測方法，檢出率結(jié)果更接近，差異可能是由于研究的地區(qū)和季節(jié)不同引起的，而姚娟等[5]采用的則是直接免疫熒光法檢測病毒抗原，該方法的缺點(diǎn)是敏感性低，且檢測結(jié)果易受采樣的質(zhì)量和操作過程影響，結(jié)果的判斷也與實(shí)驗(yàn)室檢測人員的技術(shù)水平有關(guān)。而基于毛細(xì)管電泳的多重RT-PCR 法靈敏度高、特異性強(qiáng)，且病原體檢測范圍廣，因此方法學(xué)的不一樣導(dǎo)致同一地區(qū)病原體檢出率差異明顯。

本次研究還發(fā)現(xiàn)，年齡段不同的兒童病毒檢出率存在差異。納入研究的住院病例中，1 歲以下患兒占絕大多數(shù)，因?yàn)槟挲g越大，免疫力也隨之提高，感染呼吸道病毒的幾率在下降，感染的嚴(yán)重程度也在減輕，因此呼吸道感染的住院病例就越少。1 歲以下嬰幼兒免疫系統(tǒng)還未成熟，3～6 個(gè)月嬰幼兒體內(nèi)尚存有來自母體的抗體，因而感染率相對較低，但隨著與外界環(huán)境接觸增加，來自母體的抗體逐漸消失而自身免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完全時(shí)，發(fā)生呼吸道感染的幾率就會相應(yīng)增加。1～3 歲幼兒群體間交叉感染機(jī)會增多，容易感染各類呼吸道病毒。其中RSV 是1 歲以內(nèi)，尤其是3 個(gè)月以下新生兒檢出的主要感染病毒，在本次研究中0～3 個(gè)月嬰兒中RSV檢出率53.78%，這與安徽地區(qū)感染特點(diǎn)一致[6]。

本次研究統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，呼吸道病原體在12月、1～3 月份間的檢出率雖然有所不同，但主要檢出的病原體均為HRSV 和HRV。這與劉文淵等[4]報(bào)道的Mp檢出率最高，其次為HRV和HADV有所不同，考慮可能與各自分析的季節(jié)不同有關(guān)，本次研究分析的是冬春季節(jié)，而劉文淵等[4]研究的是7～10 月份夏秋季節(jié)，由此也可推出不同病原體流行與地區(qū)及氣候有關(guān)。

綜上所述，兒童呼吸道病毒感染在不同地區(qū)、不同年齡、不同月份均有一定差異。毛細(xì)管電泳的多重RT-RCR 方法可高效快速準(zhǔn)確地檢測多種病原體，及早明確病原體，也能防止臨床上抗生素的濫用。同時(shí)本次研究也存在一些不足，由于基于毛細(xì)管電泳的多重RT-PCR 方法在本地區(qū)尚處于初步發(fā)展階段，開展時(shí)間短，納入病例少，數(shù)據(jù)的積累量還不夠多，一些病原體檢出率低，尚不能反映其感染的流行特點(diǎn)，同時(shí)缺乏本地區(qū)多個(gè)季節(jié)的數(shù)據(jù)比較，在后續(xù)研究中將逐步完善。