水蛭聯(lián)合淮山藥對(duì)靜脈血栓栓塞癥大鼠的保護(hù)作用

王大芬 江楚峰 祝晨 蔡丹莉 石瑩 王靈聰

靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism，VTE）是一種由于靜脈內(nèi)血栓形成而引起靜脈阻塞性回流障礙及其一系列相關(guān)病理生理改變的潛在致死性疾病，包括深靜脈血栓栓塞癥（deep venous thrombosis，DVT）和肺血栓栓塞癥（pulmonary thromboembolism，PTE）[1,2]。近年來(lái)，全球每年有約1 000 萬(wàn)VTE 病例[3]。我國(guó)VTE 發(fā)病率也呈上升的趨勢(shì)[4]。有研究顯示，在血管疾病中VTE 的發(fā)生率僅次于急性冠脈綜合征和腦卒中，40%～60%的住院患者存在VTE 風(fēng)險(xiǎn)。而DVT 和PTE 發(fā)生后，1 個(gè)月內(nèi)病死率分別達(dá)到6%和10%[5]。VTE 嚴(yán)重危害人們健康，因此，探索對(duì)VTE 保護(hù)作用的藥物意義重大。本實(shí)驗(yàn)采用我院國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方—水蛭聯(lián)合淮山藥，通過復(fù)制VTE 大鼠模型，探討該方對(duì)VTE的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[（許可證號(hào)SCXK（鄂）2015-0018）]提供的雄性健康SD 大鼠40 只，體重200～250 g。飼養(yǎng)環(huán)境：22 ℃恒溫，空氣濕度為50%，用標(biāo)準(zhǔn)的奶頭喂養(yǎng)。所有的程序都遵守了機(jī)構(gòu)動(dòng)物保健和使用委員會(huì)的指導(dǎo)原則。

1.2 主要試劑和儀器 水蛭及淮山藥（由杭州華東中藥飲片有限公司生產(chǎn)），低分子肝素鈣針（由葛蘭素史克中國(guó)投資有限公司生產(chǎn)）。廣譜二抗（由上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)），酶標(biāo)儀（由Thermo Scientific 生產(chǎn)），冷凍離心機(jī)（由上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)），全自動(dòng)血凝分析儀（由日本希森美康公司生產(chǎn)），Quantum FX μCT Instrument（由Perkin Elmer生產(chǎn)）。

1.3 動(dòng)物模型的建立 采用Reyers 法[6]，用3%的戊巴比妥鈉按50 mg/kg 體重腹腔麻醉后，腹中部皮膚去毛，消毒，打開后腹膜，游離左腎靜脈與下腔靜脈匯合處，用0 號(hào)絲線于左腎靜脈下方結(jié)扎下腔靜脈（活結(jié)），同樣于髂總靜脈上方置一結(jié)扎線（無(wú)需活結(jié)），將外置腸管回納腹腔，縫合腹壁和皮膚，給予腹腔注射0.9%氯化鈉注射液2.0 ml，6 h 后抽出近心端活結(jié)，解除左腎靜脈匯入下腔靜脈處結(jié)扎，成功建立VTE 大鼠模型。假手術(shù)組：不進(jìn)行血管兩處結(jié)扎處理，其它處理與模型組操作相同。

1.4 動(dòng)物分組與給藥 40 只SD 雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成空白組、假手術(shù)組、模型組、低分子肝素組、水蛭淮山藥組共5 組，每組8只。

水蛭淮山藥組從造模前4 天至造模后2 天按擬定劑量3.35 g·kg-1·d-1灌胃[以人的每日劑量（水蛭3 g，淮山藥30 g）折算成大鼠的劑量，換算公式：大鼠劑量（mg/kg）=6.09×成人每日劑量（mg）/成人體重（60 kg）計(jì)算得出]，每次1.675 g/kg，每日2 次。其余組在同一時(shí)間給予等量的生理鹽水灌胃。低分子肝素組于造模當(dāng)天起皮下注射低分子肝素鈣注射液0.01 ml/kg，每天2 次。實(shí)驗(yàn)期間每組大鼠自由活動(dòng)和飲食、飲水。

1.5 觀察指標(biāo) 造模2 d后，隨即處死動(dòng)物，取血及栓塞血管段進(jìn)行檢測(cè)。①采用全自動(dòng)血凝儀檢測(cè)血漿凝血酶原時(shí)間（plasma prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（activation of partial throm?boplastin time，APTT）。②采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血漿D 二聚體（D-Dimer）及栓塞血管內(nèi)皮素（endothelin，ET）、一氧化氮（nitric oxide，NO）。③采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)栓塞血管組織纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA）、纖溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多個(gè)樣本比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法或Tamhane，s T2 法檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血漿PT、APTT、D-Dimer 水平和血管t-PA、PAI-1、VWF陽(yáng)性細(xì)胞比率比較見表1

表1 各組大鼠血漿的PT、APTT、D-Dimer水平和血管t-PA、PAI-1、VWF陽(yáng)性細(xì)胞比率比較

由表1 可見，五組PT、APTT、D-Dimer 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=142.63、106.644、182.52，P均＜0.05）。與空白組比較，假手術(shù)組大鼠血漿PT、APTT、D-Dimer 無(wú)明顯改變（t分別=0.62、0.11、2.00，P均＞0.05）。與空白組、假手術(shù)組比較，模型組大鼠血漿PT、APTT、D-Dimer 顯著增加（t分別=20.71、20.09、17.71、17.82、24.30、22.31，P均＜0.05）。與模型組比較，低分子肝素組、水蛭淮山藥組的大鼠血漿PT、APTT、D-Dimer 明顯減少（t分別=-11.84、-10.58；-10.37、-10.19；-16.45、-16.39，P均＜0.05）。低分子肝素組、水蛭淮山藥組血漿PT、APTT、D-Dimer 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=-1.26、-0.18、-0.06，P均＞0.05）。

五組t-PA、PAI-1、vWF 陽(yáng)性細(xì)胞比率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=684.67、193.96、2118.08，P均＜0.05）。兩兩比較，模型組血管栓塞嚴(yán)重，t-PA、PAI-1、vWF 陽(yáng)性細(xì)胞比率較空白組升高（t分別=13.15、25.40、72.60，P均＜0.05）。與模型組比較，低分子肝素組和水蛭淮山藥組的血管t-PA陽(yáng)性細(xì)胞比率明顯升高（t分別=22.83、24.74，P均＜0.05），PAI-1、vWF 陽(yáng)性細(xì)胞比率明顯降低（t分別=-12.50、-11.51；-57.63、-55.86，P均＜0.05）。

2.2 各組大鼠栓塞血管NO、ET水平見表2

表2 各組大鼠栓塞血管NO、ET表達(dá)

由表2 可見，五組NO、ET 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=71.68、48.40，P均＜0.05）。

與空白組比較，假手術(shù)組大鼠栓塞血管組織NO、ET 無(wú)明顯改變（t分別=1.40、-0.09，P均＞0.05）。與空白組、假手術(shù)組比較，模型組大鼠栓塞血管組織ET 明顯增加，NO 明顯減少（t分別=11.66、11.75；-13.12、-14.52，P均＜0.05）。與模型組比較，低分子肝素組、水蛭淮山藥組的大鼠栓塞血管組織ET 明顯降低、NO 明顯增加（t分別=-5.50、-5.89；5.61、5.73，P均＜0.05）。低分子肝素組、水蛭淮山藥組大鼠栓塞血管組織NO、ET 比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=-0.12、0.38，P均＞0.05）。

3 討論

VTE 的形成與多方面因素有關(guān)，Virchow 三角學(xué)說是血栓形成的重要理論基礎(chǔ)，該學(xué)說認(rèn)為血栓形成是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血流動(dòng)力學(xué)改變和血液粘滯度增加相互作用的最終結(jié)果[7]。

內(nèi)皮細(xì)胞能夠合成和分泌多種血管活性物質(zhì)，影響凝血、纖溶功能，維持血管內(nèi)皮促血栓形成和抗血栓形成之間的平衡[8]。NO具有舒張血管、抗血小板聚集、抗血栓形成、抑制平滑肌細(xì)胞過度增殖作用，若NO釋放減少，則促進(jìn)血栓形成；ET引起血管收縮，激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移。若NO、ET失衡，血栓聚集。t-PA、PAI-1是纖溶系統(tǒng)的兩個(gè)重要組成部分，t-PA是纖溶系統(tǒng)主要啟動(dòng)物質(zhì)，能特異性結(jié)合纖維蛋白原，促進(jìn)血栓溶解；PAI-1 可抑制纖溶酶原激活物活性[9]。病理狀態(tài)下，兩者平衡狀態(tài)將被打破，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PAI-1增加，致血小板聚集，血流速度下降，從而促進(jìn)靜脈血栓形成與發(fā)展[10]。vWF是一種大分子多聚糖蛋白，儲(chǔ)存于Weibel-Palade 小體內(nèi)。它參與激活血小板及凝血過程，被認(rèn)為是反映血管內(nèi)皮損傷的特異性標(biāo)志物。血管內(nèi)皮損傷后，內(nèi)皮下膠原纖維與vWF 結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)血小板聚集和黏附，啟動(dòng)病理性靜脈血栓[11]。本次研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺栓塞、血管栓塞嚴(yán)重，血漿PT、APTT、D-Dimer 顯著增加，栓塞血管組織NO 顯著減少、ET顯著增加以及t-PA、PAI-1、vWF陽(yáng)性細(xì)胞比率升高。進(jìn)一步驗(yàn)證了以往的有關(guān)研究。

VTE 在中醫(yī)歸屬于“血瘀”“股脹”“股腫”等范疇，瘀血阻滯是該病的主要病機(jī)，治療以活血祛瘀為主。水蛭，俗稱螞蝗，屬環(huán)節(jié)動(dòng)物蛭綱顎蛭目，光滑，咸，苦，微毒。有破血，活血化瘀，疏通效果。主治癩瘕積聚、血瘀經(jīng)閉、跌打損傷、胸痹心痛、癲癇等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明，水蛭具有抗凝、促纖溶、抑制血栓形成、抗血小板聚集、降低血液黏度、促進(jìn)血液循環(huán)和降血脂、抗炎、腦保護(hù)作用、抗細(xì)胞凋亡、抗腫瘤、抗纖維化等作用[12～15]。山藥又稱薯蕷、淮山等，藥用來(lái)源為薯蕷科植物山藥干燥根莖。其味甘、平，歸脾、肺、腎經(jīng)，具有健脾、補(bǔ)肺、固腎、益精的功效。本次研究以水蛭及淮山藥聯(lián)用，山藥能養(yǎng)正補(bǔ)氣，用以成水蛭嚙血逐瘀之功，使補(bǔ)而不滯，攻而無(wú)傷，攻補(bǔ)兼施法。本次研究顯示，水蛭淮山藥組大鼠肺栓塞較模型組減輕，血管栓塞也明顯好轉(zhuǎn)，提示水蛭聯(lián)合淮山藥對(duì)治療VTE 有效。同時(shí)，水蛭聯(lián)合淮山藥顯著降低VTE 大鼠血漿PT、APTT及D-Dimer，顯著下調(diào)栓塞血管段組織中ET、PAI-1、vWF的表達(dá)量，顯著上調(diào)NO及t-PA的表達(dá)量，提示其作用機(jī)制可能與改善內(nèi)皮功能、提高凝血與纖溶調(diào)節(jié)能力有關(guān)。

綜上所述，水蛭聯(lián)合淮山藥對(duì)VTE 大鼠具有一定的保護(hù)作用，值得臨床進(jìn)一步借鑒、應(yīng)用。但是否存在其他更深層次的作用機(jī)制，還有待于進(jìn)一步研究。