陜西省銅川市HIV-1亞型和分子傳播網(wǎng)絡(luò)分析

任強(qiáng)，張夢(mèng)妍，賈華，鄒揚(yáng)帆，付鈺淋，李華，常文輝

截至2019年10月31日，陜西省累計(jì)報(bào)告現(xiàn)存活HIV/AIDS感染者共15 574例，性傳播為主要感染途徑。2019年新報(bào)告病例中性接觸感染比例達(dá)98.8%，男男性行為傳播占41.5%，其中西安市、寶雞市和銅川市的同性性傳播比例高于異性性傳播比例[1]。艾滋病疫情在局部地區(qū)存在差異，流行模式復(fù)雜，對(duì)不同社會(huì)學(xué)特征和行為學(xué)特征的高危人群，應(yīng)分類指導(dǎo)、精準(zhǔn)防控。本研究分析截至2019年8月陜西省銅川市HIV-1亞型分布特征和傳播網(wǎng)絡(luò)情況，為精準(zhǔn)實(shí)施當(dāng)?shù)匕滩‰S訪干預(yù)措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 全國艾滋病綜合防治基本信息系統(tǒng)中截至2019年8月現(xiàn)住址為陜西省銅川市的現(xiàn)存活HIV/AIDS感染者。收集到2019年1-8月銅川市常規(guī)隨訪CD4+T淋巴細(xì)胞(CD4)檢測(cè)(每年每人檢測(cè)一次)的全血樣本193例及其社會(huì)人口學(xué)、感染途徑和隨訪CD4檢測(cè)結(jié)果等基本信息，193例HIV/AIDS感染者占同期銅川市全部現(xiàn)存活感染者的比例為71.96%。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1HIV-1前病毒DNA提取和擴(kuò)增 使用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)試劑盒提取病毒前體DNA。巢式PCR擴(kuò)增pol基因區(qū)，使用TaKaRa Ex Taq Kit和TIANGEN(KT201)試劑盒，pol基因擴(kuò)增引物和擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[2]。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果，陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送擎科(西安)公司純化和測(cè)序。

1.2.2HIV-1亞型分析 采用Sequencher 4.9軟件對(duì)序列編輯和拼接，HIV Database Tools(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/HIVTools.html)Gene Cutter和Bioedit 7.1.3軟件進(jìn)行序列比對(duì)和整理，采用Mega7.0軟件Neighor-joining(Kimura2-jarameter模型，Bootstrap=1000)方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過國際參考株(HIV基因數(shù)據(jù)庫，LANL，www.hiv.lanl.gov)判斷樣本亞型。在線HIV亞型分析工具COMET(https://comet.lih.lu/)核對(duì)。使用SimPlot v3.5.1軟件分析判定獨(dú)特重組型(Unique recombinant forms，URF)。

1.2.3構(gòu)建HIV分子傳播網(wǎng)絡(luò) Mega7.0軟件Tamura-Nei模型(TN93模型)計(jì)算序列兩兩間基因距離，選擇基因距離閾值為1.5%即基因距離≤0.015，分子傳播網(wǎng)絡(luò)內(nèi)傳播簇總數(shù)達(dá)最大值。故選擇此基因距離構(gòu)建分子傳播網(wǎng)絡(luò)，使用R語言ggnet2包實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的可視化。在分子傳播網(wǎng)絡(luò)中，每個(gè)節(jié)點(diǎn)與其有相連的邊的數(shù)目為“度”值。

1.2.4貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化推斷 通過BLAST在線工具選取LANL上10條相似性最高的毒株，以及我國報(bào)道的包含患者性別和感染途徑的CRF55_01B毒株作為參考序列，組成245條CRF55_01B亞型pol區(qū)序列集。jModelTest軟件選擇核酸替代模型，BEAST v1.8軟件進(jìn)行貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化推斷，分子鐘模型為Lognormal Relaxed Clock(uncorrelated)，推斷方法為Constant Size。蒙特卡洛模擬(Markov Chain Monte Carlo Algorithms，MCMC)分析鏈長為200 000 000，迭代頻次為2 000。Tracer軟件查看有效樣本數(shù)(Effective sampling size，ESS)，ESS值>200認(rèn)為可信。Tree Annotator軟件去除10%的初始合意樹生成Maximum clade credibility(MCC)樹。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel 2010軟件構(gòu)建數(shù)據(jù)庫，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和構(gòu)成比描述，組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。分子傳播網(wǎng)絡(luò)特征分析中將年齡、性別、受教育程度和分子亞型等變量納入Logistic 回歸模型進(jìn)行多因素分析，探究各因素與成簇的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1基本特征和亞型分布 銅川市2019年隨訪193例HIV/AIDS感染者中，有100例(100/193，51.81%)成功擴(kuò)增獲得pol基因序列，以男性(85.00%)、>35歲(58.00%)、已婚/在婚(38.00%)和初中及以下文化程度(52.00%)為主。感染途徑主要為性傳播(98.00%)，其中同性性傳播占51.00%，異性性傳播占47.00%。見表1。

表1 2019年陜西省銅川市100例現(xiàn)存活HIV/AIDS感染者基本特征及HIV-1亞型 例(%)Tab.1 The essential features and HIV-1 subtypes of 100 living with HIV/AIDS in Tongchuan in 2019 Case(%)

分子亞型包括CRF01_AE(36.00%)、CRF07_BC(29.00%)、CRF55_01B(16.00%)、B亞型(9.00%)、CRF08_BC(7.00%)、CRF68_01B(1.00%)和URF01_AE/07_BC(2.00%)。2例URF01_AE/07_BC均來源于同性性傳播HIV/AIDS感染者。不同傳播途徑在HIV-1亞型分布間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他特征差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。同性性傳播病例中，CRF01_AE和CRF07_BC亞型占比較高；異性性傳播的HIV/AIDS感染者中，CRF01_AE、CRF07_BC和CRF55_01B亞型占比相似。

2.2HIV分子傳播網(wǎng)絡(luò)特征及成簇影響因素 100例樣品形成7個(gè)傳播簇，總體成簇率為34.00%(34/100)。CRF01_AE、CRF07_BC、CRF55_01B和其他亞型的成簇構(gòu)成比分別是25.00%(9/36)、24.14%(7/29)、87.50%(14/16)和21.05%(4/19)。在傳播網(wǎng)絡(luò)中，47.06%(16/34)的序列度值≥2。見表2。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，初中及以下文化程度(與高中及以上相比，OR=4.02，95%CI：1.30～12.46)和感染毒株亞型為CRF55_01B(與其他亞型相比，OR=32.78，95%CI：4.25～252.77)是促進(jìn)傳播網(wǎng)絡(luò)形成的因素。CRF55_01B型構(gòu)成一個(gè)傳播簇，傳播簇內(nèi)病例以男性(78.57%, 11/14)、異性性傳播(71.43%, 10/14)、已婚/在婚(57.14%, 8/14)、初中及以下文化程度(57.14%, 8/14)和農(nóng)民(57.14%, 8/14)為主，傳播簇中存在一對(duì)夫妻關(guān)系傳播鏈。見圖1。

表2 2019年陜西省銅川市100例現(xiàn)存活HIV/AIDS感染者分子傳播網(wǎng)絡(luò)特征Tab.2 The Molecular Transmission Network Features of 100 Living with HIV/AIDS in Tongchuan in 2019

圖1 2019年陜西省銅川市100例現(xiàn)存活HIV/AIDS感染者 HIV-1亞型分子傳播網(wǎng)絡(luò)Fig.1 HIV-1 subtype molecular transmission network of 100 living with HIV/AIDS in Tongchuan in 2019

2.3CRF55_01B系統(tǒng)進(jìn)化分析 基于245條pol區(qū)序列貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化推斷，CRF55_01B毒株的進(jìn)化率為2.01×10-3[95%Highest Posterior Density (HPD): 1.50-2.55]nt Substitutions/Site/Year。銅川市CRF55_01B毒株序列在一個(gè)分支樹上，后驗(yàn)概率(Posterior Probability)為0.99(圖2)，祖先毒株傳入銅川市的最近共同時(shí)間(The Time to the Most Recent Common Ancestor, tMRCA)約為2009年3月(95%HPD：2007年10月-2010年6月)。見圖2。

Note: Gray area indicates CRF55_01B圖2 HIV CRF55_01B亞型pol基因區(qū)構(gòu)建的MCC樹Fig.2 MCC tree constructed by pol gene region of HIV CRF55_01B subtype

3 討論

本研究中，陜西省銅川市100例HIV/AIDS感染者亞型分布較復(fù)雜，存在多種亞型、流行重組型和獨(dú)特重組型?；趦蓛杀葘?duì)基因距離法構(gòu)建HIV-1分子傳播網(wǎng)絡(luò)，多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)文化程度和HIV-1毒株亞型與分子傳播簇形成相關(guān)。CRF55_01B成簇率較高且毒株pol基因序列高度同源，系統(tǒng)進(jìn)化分析推測(cè)該亞型于2009年傳入當(dāng)?shù)亻_始傳播流行。

CRF01_AE和CRF07_BC是銅川市HIV-1優(yōu)勢(shì)流行毒株，與國家級(jí)和省級(jí)分子亞型調(diào)查結(jié)果一致[2-7]。CRF55_01B和CRF68_01B最早報(bào)道發(fā)現(xiàn)于深圳市和安徽省的MSM人群[8-9]，在全國多個(gè)省份性傳播人群中出現(xiàn)不同程度的流行，局部地區(qū)開始廣泛流行[10-12]。兩個(gè)亞型在銅川市的同性性傳播和異性性傳播人群中都有發(fā)現(xiàn)，此后感染者可能會(huì)增加。高危人群尤其是MSM人群，存在多性伴、安全套使用率低等行為特征[13]，如果感染兩種以上不同亞型優(yōu)勢(shì)流行株，病毒基因可能重組形成新的重組型。已在西安市MSM人群中發(fā)現(xiàn)新的二代重組型CRF104_0107和多例URF01_AE/07_BC毒株[14]，以及本研究中銅川市MSM中發(fā)現(xiàn)的URF01_AE/07_BC毒株，都提示陜西省MSM人群中HIV-1毒株復(fù)雜多樣，今后應(yīng)加強(qiáng)分子亞型監(jiān)測(cè)，盡早發(fā)現(xiàn)重組病毒的形成和傳播。

HIV-1分子網(wǎng)絡(luò)中的傳播鏈不代表直接或間接的傳播關(guān)系，但是傳播網(wǎng)絡(luò)的形成與傳播簇內(nèi)感染者的社會(huì)學(xué)和行為學(xué)特征相關(guān)聯(lián)，識(shí)別當(dāng)?shù)豀IV-1傳播成簇特征可為精準(zhǔn)干預(yù)提供科學(xué)依據(jù)。本研究中，初中及以下文化程度是銅川市HIV-1分子傳播網(wǎng)絡(luò)形成的影響因素，可能由于文化程度較低的患者對(duì)預(yù)防傳播艾滋病的信息理解能力有限，確診后不能改變高危性行為特征，增加了二代傳播的風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)了傳播簇的形成，提示該類人群需要針對(duì)性的干預(yù)。感染毒株為CRF55_01B型是當(dāng)?shù)胤肿觽鞑ゾW(wǎng)絡(luò)形成的另一促進(jìn)因素。銅川市CRF55_01B毒株高度同源，通過獨(dú)立的傳播事件傳入當(dāng)?shù)豀IV/AIDS感染者人群，獨(dú)立成簇于HIV基因數(shù)據(jù)庫中其他省份的CRF55_01B毒株。貝葉斯時(shí)間進(jìn)化推斷，CRF55_01B在2009年已開始在銅川市HIV/AIDS感染者中傳播。CRF55_01B分子簇在當(dāng)?shù)貍鞑サ娘L(fēng)險(xiǎn)較高，提示應(yīng)開展個(gè)案流調(diào)和同伴調(diào)查，發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)網(wǎng)絡(luò)中的高危人群及陰性性伴進(jìn)行精準(zhǔn)干預(yù)[15]。

本研究存在不足，橫斷面研究納入研究對(duì)象的全血樣品，pol基因區(qū)的擴(kuò)增率低于新發(fā)感染者血漿樣品的擴(kuò)增率，可能導(dǎo)致不同社會(huì)學(xué)特征的患者基因數(shù)據(jù)分布存在差異，結(jié)果存在偏移。但是，在基因數(shù)據(jù)較少的情況下發(fā)現(xiàn)了銅川市HIV-1 CRF55_01B毒株傳播簇，說明分子傳播網(wǎng)絡(luò)在發(fā)現(xiàn)潛在的風(fēng)險(xiǎn)網(wǎng)絡(luò)、指導(dǎo)干預(yù)措施方面的可行性[16]。

綜上所述，陜西省銅川市HIV/AIDS感染者中存在多種亞型和重組型毒株，文化程度低和感染CRF55_01B毒株的HIV/AIDS感染者傳播風(fēng)險(xiǎn)較高，今后可在全省范圍內(nèi)將HIV/AIDS感染者社會(huì)人口學(xué)特征和基因數(shù)據(jù)有機(jī)結(jié)合，及時(shí)掌握各地區(qū)的分子傳播網(wǎng)絡(luò)特征，干預(yù)傳播網(wǎng)絡(luò)的擴(kuò)張。