全反式維A酸通過AKT和ERK1/2通路影響IL-22誘導HaCaT細胞中的Cx43和GJIC功能

梁曉冬，談桂其，李春紅，鄧新華 ，梁景耀，張錫寶

細胞間隙連接通訊(gap junctional intercellular communication，GJIC)是多細胞生物中常見的通訊方式。GJIC通過連接蛋白 (connexins，Cx) 組成的間隙連接 (gap junction，GJ) 通道，以實現連接相鄰細胞作用[1]。最近的研究表明，Cx43 參與了生物體內由細胞外囊泡、納米管或 GJ 介導的細胞交流過程[2]。

全反式維A酸(all-trans retinoic acid，RA)的作用包括調節(jié)細胞分化和免疫系統(tǒng)、抗皮脂分泌、抗炎等，對銀屑病患者具有重要作用[3]。有學者[4]發(fā)現維A酸類藥物作為抗腫瘤藥物起抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡的能力，可以增強GJIC的功能， 但RA 作為GJIC 的一種典型增強劑對銀屑病的作用和機制并未引起太多關注。本課題組最近的研究表明，IL-22 通過激活 JNK 信號通路，顯著下調 Cx43 表達并降低 HaCaT 細胞的 GJIC 功能[5]。本研究旨在通過探討 RA 是否影響 HaCaT 細胞中 IL-22 誘導的 Cx43 表達下調和 GJIC 降低過程，以及是否通過絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 信號通路介導，從而更好地了解 RA 對銀屑病的分子機制過程。

1 材料與方法

1.1HaCaT 細胞培養(yǎng)和處理 HaCaT 細胞(Sigma,Shanghai,China)用 Dulbecco′s 改良 Eagle′s 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為 37°C 和 5% CO2的加濕培養(yǎng)箱。第一部分：對于每個實驗條件HaCaT 細胞，用 50 μg/L IL-22 (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ, USA) 誘導處理，再用 10 μmol/L RA(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA)處理 24 h[5]。第二部分： 分別通過用 5 μmol/L MK-2206(Selleckchem, Houston, TX, USA)和10 μmol/L RA，或 1 μmol/L SCH772984(MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA)和10 μmol/L RA處理細胞24 h，來抑制 AKT 或 ERK1/2 信號通路 。

1.3蛋白印跡法(Western blot) 經各組處理后，從 HaCaT 細胞中提取總蛋白后裂解，并測量每個裂解物樣品中總蛋白的濃度。將等量的蛋白質加載到 10% SDS-PAGE 凝膠中，并在電泳后轉移到聚偏二氟乙烯膜 (Invitrogen, CA, USA)，室溫封閉 2 h，然后與以下一抗， Cx43、JNK、p-JNK、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2(Cell Signaling Technology，MA，USA)、p38(Boster Biological Technology，武漢，中國)、p-p38(Santa Cruz，CA，USA)、 GAPDH(Transgene，Paris，France)孵育過夜。GAPDH 作為對照控制。將膜與 HRP 偶聯(lián)的二抗(Santa Cruz，CA，USA)孵育。使用 ECL 化學發(fā)光系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech，NJ，USA)開發(fā)免疫反應性印跡。所有結果代表3個獨立實驗。最后通過 ImageJ 軟件 (NIH, MD, USA) 進行定量分析。

2 結果

2.1RA 可抑制IL-22 誘導的 HaCaT 細胞GJIC功能降低過程 在用不同濃度的 RA(0、1、5、10、20 μmol/L)處理 24 h后， SLDT測定顯示 RA 以濃度依賴的方式逐漸增強 HaCaT 細胞中的 GJIC功能(圖1)。用 10 μmol/L RA 預處理 24 h，有效地抑制了 IL-22 誘導的 HaCaT 細胞中 Cx43 表達降低過程，這表明 GJIC 可能受到相同趨勢的影響(圖1)。

Nore:**P <0.01, ***P <0.001, compared with untreated HaCaT cells, Scale bar= 31.25 mm.Images show GJIC by the scrape-loading dye-transfer method in HaCaT cells treated with various concentrations of RA (0, 1, 5, 10, or 20 μmol/L) for 24 h; The histograms show a quantitative analysis of the distance in Fig.1a圖1 RA 對 HaCaT 細胞中 GJIC 的影響Fig.1 The effect of RA on GJIC in HaCaT cells

2.2RA可恢復 IL-22 誘導的 HaCaT 細胞中 Cx43 表達的降低，如圖2所示，Western blot顯示RA有效地恢復了HaCaT中IL-22誘導的Cx43弱表達水平。然而，RA 并未降低 由IL-22 誘導的 p-JNK 表達增加。這些結果表明，RA 可減少IL-22 誘導的 HaCaT 細胞中 Cx43 表達的降低，但與抑制 IL-22 激活的 JNK 信號通路無關。

Note:**P <0.01. Western blot shows the protein expression levels of Cx43 and p-JNK in HaCaT cells pretreated with 10 μmol/L RA 24 h before stimulation with 50 μg/L IL-22; The histograms show a quantitative analysis of protein expression levels in Fig.2a圖2 RA 對IL-22 誘導的HaCaT 細胞中Cx43 和 p-JNK 表達的影響Fig.2 Effects of RA on expression of Cx43 and p-JNK in IL-22-induced HaCaT cells

如圖3所示，在用 IL-22 處理后，Cx43、p-AKT 和 p-ERK1/2的表達顯著降低， p-p38的表達無顯著改變。RA 預處理部分恢復了 IL-22 誘導的 Cx43、p-AKT 和 p-ERK1/2 表達的降低，表明 RA 可能通過激活 AKT 和 ERK1/2 信號傳導途徑來恢復 IL-22 誘導的 Cx43 表達下調。

Note:**P<0.01, ***P<0.001.Western blot shows the protein expression levels of Cx43, p-AKT, p-ERK1/2 and p-p38 are shown in HaCaT cells treated with 10 μmol/L RA 24 h and/or before stimulation with 50 μg/L IL-22;The histograms show a quantitative analysis of protein expression levels in Fig.3a圖3 RA對IL-22誘導的HaCaT細胞AKT、ERK1/2和p38信號通路的影響Fig.3 Effects of RA on the IL-22-induced AKT, ERK1/2 and p38 signaling pathways in HaCaT cells

2.3RA 通過激活 AKT 和 ERK1/2 信號通路恢復 IL-22 誘導的 Cx43 表達下調和 GJIC 功能降低 用AKT 特異性抑制劑MK-2206預處理細胞后，顯著阻斷了RA恢復IL-22誘導的HaCaT細胞中p-AKT和Cx43表達上調的影響。類似地，用ERK1/2 特異性抑制劑SCH772984預處理細胞后，顯著阻斷了RA抑制IL-22誘導的HaCaT細胞中p-ERK1/2和Cx43表達上調的影響。此外，用 MK-2206 和 SCH772984 預處理分別有效地降低了 RA 恢復 IL-22 誘導的 HaCaT 細胞中 GJIC 增加的影響。這些結果表明RA可以通過激活AKT和ERK1 / 2信號通路，以抑制IL-22誘導引起的Cx43表達下調和GJIC功能降低過程,見圖4～5。

Note:**P<0.01, ***P<0.001， Scale bar=31.25 mm.Western blot shows the protein expression levels of Cx43 and p-AKT in HaCaT cells treated with 10 μmol/L RA, or RA and 5 μmol/L MK-2206 before stimulation with 50 μg/L IL-22;～ The histograms show a quantitative analysis of protein expression levels in Fig.4a; Images show GJIC in HaCaT cells treated with 10 μmol/L RA, or RA and 5 μmol/L MK-2206 before stimulation with 50 μg/L IL-22;The histograms show a quantitative analysis of the distance in Fig.4d圖4 RA 對IL-22 誘導的HaCaT 細胞中Cx43、p-AKT 表達和 GJIC 的影響Fig.4 Effects of RA on IL-22-induced Cx43, p-AKT expression and GJIC in HaCaT cells

Note:*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001， Scale bar= 31.25 mm. Western blot shows the protein expression levels of Cx43 and p-ERK1/2 in HaCaT cells treated with 10 μmol/L RA, or RA and 1 μmol/L SCH772984 before stimulation with 50 μg/L IL-22;～ The histograms show a quantitative analysis of protein expression levels in 5a; Images show GJIC in HaCaT cells treated with 10 μmol/L RA, or RA and 1 μmol/L SCH772984 before stimulation with 50 μg/L IL-22; The histograms show a quantitative analysis of the distance in Fig.5d圖5 RA 對 IL-22 誘導的HaCaT 細胞中Cx43、p-ERK1/2 表達和 GJIC 的影響Fig.5 Effects of RA on IL-22-induced Cx43, p-ERK1/2 expression and GJIC in HaCaT cells

3 討論

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病[6]。角化細胞的分化和免疫系統(tǒng)的激活是銀屑病的特征[7]。IL-22可被先天或后天免疫系統(tǒng)激活，IL-22通常在T淋巴細胞介導的疾病中表達升高，如銀屑病、類風濕性關節(jié)炎和間質性肺病等[8]。IL-22參與多種信號通路，在銀屑病的發(fā)病、發(fā)展和轉歸中發(fā)揮重要作用[9-10]。

IL-22 傳統(tǒng)上被認為是 Th17 的細胞因子。然而，淋巴細胞能夠分泌 IL-22，例如 Th22、Th1、γδ T和自然殺傷細胞[11]。IL-22是一種重要的細胞因子，介導白細胞和上皮細胞之間的聯(lián)系，并參與多種免疫介導的炎癥性疾病的病理生理過程，如銀屑病、腸道炎癥和癌癥[8]。有研究[12]表明，銀屑病患者皮損中IL-22的表達水平明顯高于健康個體。在同一銀屑病患者中，從病變皮損中分離的 T 細胞產生的 IL-22 水平高于從外周血中分離T 細胞產生的水平[13]。血漿中 IL-22 濃度與斑塊型銀屑病的疾病活動度呈顯著正相關。 IL-22 主要作用于角質形成細胞，以介導角質形成細胞的增殖并抑制其終末分化，導致棘層肥厚、顆粒不足和角化過度特征的銀屑病樣外觀[14]。筆者先前的研究表明[5]，IL-22 在 HaCaT 細胞中下調 Cx43表達并降低 GJIC功能，并通過激活 JNK 信號通路在小鼠模型中誘導銀屑病樣變化。本研究中進一步發(fā)現RA 通過激活 AKT 和 ERK1/2 信號通路來恢復 IL-22 誘導的 HaCaT 細胞中 Cx43 表達下調和 GJIC降低，而與 JNK 和 p38 信號通路無關。

RA 已被證明可以上調多種不同細胞類型[15-16]中的 Cx43 表達和 GJIC功能，與筆者在 HaCaT 細胞中的研究一致，盡管在 NTera2/克隆 D1 細胞[17]和 p19 胚胎癌細胞中存在一些矛盾的結果[18]。除了增加 Cx43 表達水平外，RA 通過增強蛋白磷酸酶 2A 和 Cx43 之間的相互作用促進 Cx43 的去磷酸化，從而導致原代人子宮內膜基質細胞中 GJIC 功能的增加[4]。特定位點的磷酸化[16]以及 Cx43 的泛素化[19]已被發(fā)現可降低 GJIC功能。盡管RA 對 Cx43 泛素化的直接影響尚未被報道，但在原發(fā)性急性早幼粒細胞白血病中，RA 治療會增加泛素樣修飾激活酶 3 的降解，該酶控制著細胞周期進程中許多重要蛋白質的降解[20]。目前RA已被充分證明不僅能抑制細胞增殖和遷移，而且在通過 Cx43 介導的 GJIC 增強細胞對抗癌治療的敏感性方面發(fā)揮重要作用[21-22]。

眾所周知，IL-22 通過磷酸化 AKT、p38、JNK、ERK1/2、STAT1、STAT 3 和 STAT 5 中的絲氨酸和酪氨酸殘基并與 IL-22 受體 (IL-22R，由 IL-10Rβ1 和 IL-22R1 鏈組成) 結合來觸發(fā)多個細胞內途徑[23]。RA 強烈誘導樹突狀細胞亞群中IL -22 結合蛋白 (IL-22BP) 的表達，其可在體外和體內特異性抑制和結合 IL-22[8]。之前與 IL-22 的類似研究表明，RA 的治療可激活多種信號通路，包括 AKT 和 MAPK[24]。RA通過RARα介導的PI3K/AKT和ERK信號通路，顯著降低血管平滑肌細胞的增殖和遷移[25]。在本研究中，IL-22 通過激活HaCaT 細胞中的JNK 和抑制AKT 和 ERK 信號傳導來下調 Cx43 的表達并降低 GJIC功能。相反，RA 通過激活 AKT 和 ERK 信號通路而不抑制 JNK 信號通路來逆轉這種調節(jié)。Tacheau等[26]發(fā)現 p38 和 PI3K/AKT 通路的激活協(xié)同介導 TGF-β1，可誘導的正常鼠乳腺上皮細胞中 Cx43 表達和 GJIC 的增加。激活的 PI3K/AKT信號通路增加了 β-連環(huán)蛋白的核積累和 β-連環(huán)蛋白與 Cx43 啟動子的結合活性，進而上調了骨細胞中 Cx43 的表達和 GJIC功能[27]。PI3K 催化亞基的組成型活性形式的表達，增加了大鼠肝上皮 T51B 細胞中的 GJIC功能，而成骨細胞系中PI3K 信號傳導的藥理學抑制，不僅消除了細胞通訊[28]并顯著降低了 Cx43 mRNA 和蛋白質的穩(wěn)態(tài)表達[29]。此外，振蕩引起的 GJIC 增加取決于骨細胞中AKT 信號的激活，但與 Cx43 mRNA 或蛋白質水平的改變無關[30]。然而Zhou等[31]的一項研究表明，激活 PI3K/AKT 信號可顯著降低大鼠海馬腦缺血再灌注損傷后的 Cx43蛋白表達和 GJIC功能。AKT信號 激活對于破壞 TNF-α 刺激細胞中的 GJIC 至關重要[32]。同樣一些研究表明，ERK 信號通路是否參與 GJIC 的調節(jié)是有爭議的。先前的結果表明，通過用沒食子兒茶素沒食子酸酯治療可以防止人內皮細胞中血清剝奪導致的Cx43間隙連接和GJIC的下調，它激活ERK MAP激酶，但與PI3K/AKT、p38和JNK信號傳導的激活無關[33]。在血管平滑肌細胞中，ERK介導血管緊張素Ⅱ誘導的Cx43表達增加和Ser262和GJIC磷酸化，而ERK-siRNA消除了血管緊張素Ⅱ的作用[34]。相反地， ERK信號通路的激活與大鼠肝上皮細胞中過氧化氫引起的Cx43過度磷酸化和GJIC抑制有關[35-36]?？傊?，以上這些結果表明 PI3k/AKT 和 ERK 信號通路可能對不同細胞和疾病模型中的 Cx43 蛋白表達和 GJIC 功能產生不同的影響。

總之，這項研究有力表明了 RA 通過激活 AKT 和 ERK1/2 信號通路來抑制 IL-22 處理的 HaCaT 細胞中 Cx43 表達和 GJIC 的下調。 這些發(fā)現增強了對維A酸在 GJIC 中作用的理解，并可能為銀屑病的治療提供新的靶點。