急性腦梗死病人外周血單核細胞中Cx43、PPARγ表達與頸動脈粥樣硬化的關(guān)系

黃健康，文洪波，繆家立

急性腦梗死在臨床上也稱為急性缺血性腦卒中，是臨床上常見的腦血管疾病，目前大部分學(xué)者認(rèn)為粥樣斑塊破裂或動脈粥樣硬化是急性腦梗死主要病理基礎(chǔ)[1]。臨床上常用頸動脈內(nèi)膜中層厚度(carotid artery intima-media thickness，CIMT)區(qū)分動脈粥樣硬化的范圍及程度[2]。目前研究認(rèn)為動脈粥樣硬化與血管內(nèi)皮損傷、炎性反應(yīng)息息相關(guān)[3]。外周血單核細胞(peripheral blood monocytes，PBMCs)可黏附于血管壁，此過程伴隨著大量炎性介質(zhì)釋放，從而促進動脈粥樣硬化發(fā)生。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)縫隙連接蛋白43(connexin43，Cx43)可參與PBMCs黏附于血管內(nèi)皮細胞過程，從而參與動脈粥樣硬化的發(fā)生[4]。過氧化小體增殖劑激活型受體γ(peroxrisome prolifterator-activated receptor γ，PPARγ)可調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄與表達，從而參與多種病理過程。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PPARγ在動脈粥樣硬化中起著關(guān)鍵作用[5]。目前Cx43和PPARγ在急性腦梗死動脈粥樣硬化中的作用鮮有報道。基于此，本研究將分析急性腦梗死病人PBMCs中Cx43和PPARγ與CIMT的相關(guān)性，以期為急性腦梗死動脈粥樣硬化防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月—2020年9月我院收治的125例急性腦梗死病人為研究對象(研究組)，其中，男69例，女56例；年齡40～70(60.34±11.27)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合急性腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，且經(jīng)磁共振成像(MRI)檢測確實存在梗死病灶[7]；②首次腦卒中，且在發(fā)病3 d內(nèi)就診；③本人及家屬均知曉此研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①出血性腦卒中、短暫性腦缺血發(fā)作病人；②嚴(yán)重肝、腎功能障礙病人；③免疫功能異常病人；④近3個月發(fā)生心肌梗死；⑤合并阿爾茨海默病、癲癇等神經(jīng)性疾病病人。選擇同期在本院體檢健康者125名作為對照組，其中，男65名，女60名；年齡40～75(60.29±10.87)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 臨床資料收集 收集所有研究對象體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)及其他實驗室指標(biāo)：低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、三酰甘油(triacylglycerol，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)，均應(yīng)用日立7600-20型全自動化分析儀檢測。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 研究組在入院次日清晨空腹時，對照組在體檢當(dāng)天空腹時，用肝素抗凝管抽取靜脈血3～4 mL，直接置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 檢測單核細胞中Cx43、PPARγ水平 取出凍存的外周血，解凍，離心，分離出上層血漿成分，向離心管中加入等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)及淋巴細胞分離液，梯度離心，獲取PBMCs。采用Trizol法提取PBMCs總RNA，檢測RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用CFX96實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀對Cx43、PPARγ及內(nèi)參β-actin進行擴增反應(yīng)。引物由上海生工合成。Cx43正向引物5′-GGCGTGAGGAAAGTACCAAA-3′，反向引物5′-ACGCCAAGTGATTGAACTCC-3′；PPARγ正向引物5′-TCCCGCTGACCAAAGCAAAGGC-3′，反向引物5′-CCACGGAGCGAAACTGACACCC-3′；內(nèi)參β-actin正向引物5′-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3′，反向引物5′-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；61 ℃，30 s；72 ℃，40 s；40個循環(huán)。對Cx43、PPARγ相對表達量用2-△△CT法計算。

1.4 CIMT測量 所有病人入院第2天行頸動脈超聲檢查，用荷蘭飛利浦HD-15型彩色多普勒超聲診斷儀測定CIMT，由同一位有經(jīng)驗的B超醫(yī)師進行操作，病人去枕頸后仰，頭偏向一側(cè)。用9 MHz探頭分別檢測雙側(cè)頸總動脈、頸總動脈分叉部、頸內(nèi)動脈顱外段及頸外動脈的CIMT，超聲測量指標(biāo)包括：CIMT、斑塊硬化范圍、內(nèi)徑狹窄情況[7]。頸動脈粥樣硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：①CIMT<0.9 mm表示頸動脈超聲陰性；②CIMT≥0.9 mm表示頸動脈超聲陽性；CIMT>0.9 mm，且≤1.3 mm表示CIMT增厚；CIMT>1.3 mm表示頸動脈斑塊形成。根據(jù)CIMT和頸動脈內(nèi)斑塊回聲特性，將急性腦梗死病人分為無斑塊組(31例)、穩(wěn)定斑塊組(42例)和不穩(wěn)定斑塊組(52例)。依據(jù)半定量法估計斑塊嚴(yán)重程度：單側(cè)斑塊≤2.1 mm定義為Ⅰ級；單側(cè)斑塊>2.1 mm或雙側(cè)均有斑塊且至少一側(cè)斑塊≤2.1 mm定義為Ⅱ級；雙側(cè)斑塊>2.1 mm定義為Ⅲ級。其中，Ⅰ級20例，Ⅱ級41例，Ⅲ級33例。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 兩組性別、年齡、BMI、心率、收縮壓、舒張壓、吸煙史、合并高血壓、糖尿病、冠心病、血清HDL-C、TC、TG水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與對照組相比，研究組血清LDL-C水平較高(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 急性腦梗死病人PBMCs中Cx43 mRNA、PPARγ mRNA水平比較 與無斑塊組相比，不穩(wěn)定斑塊組、穩(wěn)定斑塊組PBMCs中Cx43 mRNA水平較高(P<0.05)，PPARγ mRNA水平較低(P<0.05)；與穩(wěn)定斑塊組相比，不穩(wěn)定斑塊組PBMCs中Cx43 mRNA水平較高(P<0.05)，PPARγ mRNA水平較低(P<0.05)。詳見表2。

表2 急性腦梗死病人PBMCs中Cx43 mRNA、PPARγ mRNA水平比較(±s)

2.3 不同等級粥樣硬化斑塊與PBMCs中Cx43 mRNA、PPARγ mRNA水平的關(guān)系 與Ⅰ級組相比，Ⅱ級組、Ⅲ級組PBMCs中Cx43 mRNA水平較高(P<0.05)，PPARγ mRNA水平較低(P<0.05)；與Ⅱ級組相比，Ⅲ級組PBMCs中Cx43 mRNA水平較高(P<0.05)，PPARγ mRNA水平較低(P<0.05)。詳見表3。

表3 不同等級粥樣硬化斑塊與PBMCs中Cx43 mRNA、PPARγ mRNA水平的關(guān)系(±s)

2.4 急性腦梗死病人PBMCs中Cx43 mRNA、PPARγ mRNA水平與CIMT的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，急性腦梗死病人PBMCs中Cx43 mRNA水平與CIMT呈正相關(guān)(r=0.543，P<0.05)；PBMCs中PPARγ mRNA水平與CIMT呈負相關(guān)(r=-0.509，P<0.05)。

2.5 影響急性腦梗死病人CIMT的多因素Logistic回歸分析 以急性腦梗死病人CIMT為因變量，Logistic回歸分析顯示，Cx43高表達、PPARγ低表達是影響急性腦梗死病人CIMT增厚的獨立危險因素(P<0.05)。詳見表4。

表4 影響急性腦梗死病人CIMT增厚的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

急性腦梗死大部分是由不穩(wěn)定斑塊破裂導(dǎo)致。動脈粥樣硬化斑塊破裂后局部形成血栓，阻塞血管，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧，從而發(fā)生急性腦梗死[9]。有文獻報道PBMCs可黏附血管內(nèi)皮細胞，被多種因素驅(qū)使進入血管內(nèi)膜，然后在血管內(nèi)膜處被激活，分化為巨噬細胞，吞噬脂質(zhì)，導(dǎo)致粥樣硬化斑塊形成；另外，隨著斑塊厚度增加，導(dǎo)致動脈血流減少，或者斑塊破裂，均可導(dǎo)致急性腦梗死發(fā)生[10]。故本研究探索PBMCs中因子水平變化。頸動脈是全身動脈粥樣硬化的窗口，頸動脈超聲是評價頸動脈粥樣硬化的常用方法，可檢測CIMT、頸動脈狹窄以及斑塊內(nèi)部成分。

Cx43屬于間隙連接蛋白家族，是重要的間隙連接蛋白，對調(diào)節(jié)干細胞的分化至關(guān)重要，其特異性表達與心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。國外研究發(fā)現(xiàn)，阻斷Cx43表達可抑制間隙連接蛋白介導(dǎo)的相鄰細胞之間的信號傳遞，從而降低血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和減少血管損傷后新內(nèi)膜的形成[11]。朱建等[12]研究顯示，不穩(wěn)定型心絞痛病人PBMCs中Cx43明顯高于健康對照者。本研究發(fā)現(xiàn)，無斑塊組、穩(wěn)定斑塊組、不穩(wěn)定斑塊組PBMCs中Cx43 mRNA水平依次明顯升高，提示Cx43可能與頸動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生有關(guān)。Cx43在PBMCs黏附血管內(nèi)皮細胞這一過程中起著關(guān)鍵作用。另外，有研究顯示Cx43高表達促進PBMCs進入血管內(nèi)膜，且在PBMCs分化為巨噬細胞進程中，Cx43高表達加快了脂質(zhì)被吞噬的速度，促進動脈粥樣硬化發(fā)生[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級粥樣斑塊病人PBMCs中Cx43 mRNA水平依次升高，提示Cx43可能與頸動脈斑塊的發(fā)展進程有關(guān)。推測Cx43可能通過影響PBMCs從而影響病人動脈粥樣硬化發(fā)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死病人PBMCs中Cx43 mRNA水平與CIMT呈正相關(guān)，經(jīng)Logistic回歸分析證實，Cx43高表達是急性腦梗死CIMT增厚的獨立危險因素，提示Cx43是頸動脈粥樣硬化發(fā)生的相關(guān)因素，Cx43濃度升高可能促使頸動脈粥樣硬化發(fā)生。

動脈粥樣硬化是動態(tài)發(fā)展過程，其發(fā)生原因與動脈內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)有關(guān)。PPARγ屬于核受體超家族成員，PPARγ基因有兩個PPARγ1和PPARγ2亞型，是配體激活轉(zhuǎn)錄因子，PPARγ在血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞中均有表達，可調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)的多種生物學(xué)功能。另外，有文獻報道內(nèi)皮細胞中PPARγ高表達可防止血栓形成，PPARγ激活可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的激活，下調(diào)促炎細胞黏附分子的表達，并增強內(nèi)皮一氧化氮的產(chǎn)生，防止血栓形成[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，無斑塊組、穩(wěn)定斑塊組、不穩(wěn)定斑塊組PBMCs中PPARγ mRNA水平依次降低，提示PPARγ可能與頸動脈粥樣硬化斑塊形成有關(guān)。Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ高表達可減輕血管內(nèi)皮損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級粥樣斑塊病人PBMCs中PPARγ mRNA水平依次降低，提示PPARγ可能影響頸動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展進程。推測PPARγ可能通過調(diào)控炎癥相關(guān)信號通路調(diào)控血管內(nèi)皮細胞，從而調(diào)控粥樣硬化斑塊，PPARγ在頸動脈粥樣硬化斑塊中可能為保護因素，但PPARγ不足以阻止粥樣硬化斑塊發(fā)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死病人PBMCs 中PPARγ水平與CIMT呈負相關(guān)，經(jīng)Logistic回歸分析證實，PPARγ低表達是急性腦梗死病人CIMT增厚的獨立危險因素，提示PPARγ是頸動脈粥樣硬化發(fā)生的相關(guān)因素，PPARγ濃度降低可能促使頸動脈粥樣硬化發(fā)生。

綜上所述，急性腦梗死病人PBMCs中Cx43水平與頸動脈粥樣硬化呈正相關(guān)，PPARγ水平與頸動脈粥樣硬化呈負相關(guān)性，Cx43、PPARγ是急性腦梗死病人頸動脈粥樣硬化的影響因素，本研究探索了Cx43、PPARγ與頸動脈粥樣硬化的關(guān)系，為臨床上闡明急性腦梗死病人頸動脈粥樣硬化發(fā)生機制奠定了基礎(chǔ)，但PBMCs中Cx43、PPARγ與頸動脈粥樣硬化發(fā)生的作用機制尚未明確，仍需進一步深入研究。