基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討金銀花、連翹藥對(duì)治療病毒性心肌炎的作用機(jī)制

楊 闖，馬新宇，吳文勝

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由病毒感染導(dǎo)致的心肌局灶性或彌漫性病變，臨床上病人癥狀差異明顯，表現(xiàn)可從輕者的無癥狀到重者出現(xiàn)充血性心力衰竭甚至心源性猝死[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，病毒性心肌炎的發(fā)病率為10/10萬～22/10萬[2]。2013年全球報(bào)告的心肌炎病例為150萬例[3]。西醫(yī)根據(jù)病毒性心肌炎的病因、病理、臨床癥狀等，主要應(yīng)用抗病毒治療、免疫抑制治療和免疫調(diào)節(jié)治療3種治療方法[4]。近年來，中醫(yī)藥在病毒性心肌炎的治療上取得了一定進(jìn)展[5]。

中醫(yī)根據(jù)病毒性心肌炎的病因病機(jī)及臨床表現(xiàn)等，可將該病歸屬于“溫病”和由“溫病”引起的“心悸”“胸痹”等范疇[6]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》曾論述到：“復(fù)感于邪，內(nèi)舍于心”，指出外感邪氣可以引起心臟疾病。中醫(yī)認(rèn)為病毒性心肌炎多是由邪毒外侵，熱毒入里，內(nèi)侵于心而引起，臨床上對(duì)于此類熱毒侵心型病毒性心肌炎治療多選用中藥復(fù)方銀翹散進(jìn)行加減。李文等[7]臨床觀察證實(shí)銀翹散可以改善急性病毒性心肌炎病人的中醫(yī)證候、左心室收縮功能、室性期前收縮及調(diào)節(jié)心臟自主神經(jīng)功能。田明明等[8]臨床觀察證實(shí)銀翹散加減治療小兒風(fēng)熱犯心型病毒性心肌炎臨床療效及心肌酶譜改善效果均明顯高于對(duì)照組。銀翹散出自清代著名溫病醫(yī)家吳鞠通的《溫病條辨》一書，方中金銀花、連翹共為君藥，都具有辛涼解表、清熱解毒的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，金銀花具有抗炎、抗氧化、抗紫外線損傷、降血脂、降血糖、抗病毒等作用[9]。連翹具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用[10]。婁序笙等[11]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，金銀花可明顯抑制病毒性心肌炎小鼠核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3，CASP3)的表達(dá)。張益靈[12]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，貫葉連翹提取物可以緩解免疫性心肌炎小鼠心肌免疫損傷和減輕心肌炎癥程度。盡管中藥金銀花、連翹被廣泛應(yīng)用于病毒性心肌炎的治療中，但到目前為止，中藥金銀花、連翹治療病毒性心肌炎的作用機(jī)制并不明確。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來尋找金銀花、連翹藥對(duì)治療病毒性心肌炎的活性成分和作用靶點(diǎn)，并采用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，來探討金銀花、連翹藥對(duì)治療病毒性心肌炎的潛在機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 金銀花、連翹藥物成分和藥物靶點(diǎn)的獲取與篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫，查找金銀花、連翹的有效成分及靶點(diǎn)，按照化合物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18為中藥有效成分濾過條件[13]。利用perl軟件整合金銀花連翹有效成分及靶點(diǎn)。在UniProt數(shù)據(jù)庫的UniProtKB功能(https：//www.uniprot.org/uniprot/)中篩選“Human”“Reviewed”基因庫并下載，利用perl軟件來過濾金銀花、連翹潛在靶點(diǎn)。

1.2 藥物作用疾病靶點(diǎn)的獲取 以“viral myocarditis”為關(guān)鍵詞在GeneCards(https：//www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫、OMIM(https：//www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫、pharmGKB(https：//www.pharmgkb.org/)數(shù)據(jù)庫獲取病毒性心肌炎的疾病靶點(diǎn)，去重合并各數(shù)據(jù)庫疾病靶點(diǎn)，并應(yīng)用R軟件安裝Venn包來繪制Venn圖。之后利用R軟件篩選金銀花-連翹與病毒性心肌炎的共同靶點(diǎn)，并繪制Venn圖。

1.3 構(gòu)建“藥物成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖 將獲得的藥物活性成分和作用靶點(diǎn)導(dǎo)入到Cytoscape 3.9.0軟件中，使用Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建“藥物成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.4 繪制蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)并篩選PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn) 將藥物作用疾病的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(https：//cn.string-db.org/)網(wǎng)站中，限制物種為“Homo Sapiens”繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.9.0軟件中的CytoNCA插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯⒙?lián)合R軟件找出每個(gè)條件大于中位值的基因。重復(fù)篩選，最終獲得該網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)，即為藥物作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 基因本體(GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析 在R軟件中安裝BiocManager軟件包，然后安裝org.Hs.eg.db包，利用“org.Hs.eg.db”將藥物作用疾病的作用靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為entrezID。利用R軟件的BiocManager軟件包安裝colorspace包、stringi包、ggplot2包、DOSE包、clusterProfiler包、enrichplot包，通過轉(zhuǎn)換得到的entrezID，以Q<0.05、P<0.05進(jìn)行GO富集分析并繪制柱狀圖。利用R軟件安裝pathview包，通過轉(zhuǎn)換得到的entrezID，以Q<0.05，P<0.05進(jìn)行KEGG富集分析并繪制柱狀圖及獲取關(guān)鍵通路的通路圖。

1.6 分子對(duì)接 將金銀花、連翹治療病毒性心肌炎的5個(gè)關(guān)鍵活性成分槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、漢黃芩素(wogonin)、β-胡蘿卜素(beta-carotene)，通過PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫下載以上5個(gè)活性成分的分子結(jié)構(gòu)，并使用Chem3D軟件進(jìn)行能量最小化處理，保存為mol2格式。在14個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)中，根據(jù)度值(Degree)的高低取前5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。使用UniProt(https：//www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫對(duì)5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，篩選條件為“Human”“Reviewed”。并在PDB(https：//www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵靶蛋白的PDB格式文件，依次為過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG，PDB ID：1ZGY)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN，PDB ID：6Y3V)、CASP3(PDB ID：1NME)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(AKT1，PDB ID：1H10)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1，PDB ID：5MZA)。利用SYBYL-X 2.0軟件進(jìn)行分子對(duì)接并根據(jù)連接性能進(jìn)行評(píng)分，從而推測(cè)藥物活性成分與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合方式。

2 結(jié) 果

2.1 金銀花、連翹藥物成分和藥物靶點(diǎn)的獲取與篩選 藥物有效成分經(jīng)OB≥30%和DL≥0.18條件篩選后，從TCMSP數(shù)據(jù)庫中查找到金銀花靶點(diǎn)1 647個(gè)、有效成分23個(gè)，獲得連翹靶點(diǎn)1 425個(gè)、有效成分23個(gè)。利用perl軟件整合金銀花、連翹有效成分及靶點(diǎn)后，將金銀花、連翹活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與UniProt基因庫相匹配，共過濾出214個(gè)藥物靶點(diǎn)。

2.2 藥物作用疾病靶點(diǎn)的獲取 以“viral myocarditis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫、pharmGKB數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫進(jìn)行疾病靶點(diǎn)檢索。其中GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果以Relevance score>1進(jìn)行過濾。將3個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果整合去重后共獲得疾病靶點(diǎn)747個(gè)，各數(shù)據(jù)庫獲取疾病靶點(diǎn)情況繪制Venn圖(見圖1)。通過R軟件篩選到金銀花-連翹與病毒性心肌炎共同靶點(diǎn)77個(gè)，并繪制Venn圖(見圖2)。

圖1 數(shù)據(jù)庫疾病靶點(diǎn)獲取情況Venn圖

圖2 藥物-疾病共同靶點(diǎn)Venn圖

2.3 “藥物成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將金銀花-連翹的藥物活性成分和作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件中，繪制“藥物成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(見圖3)。該網(wǎng)絡(luò)中共有101個(gè)節(jié)點(diǎn)、201條邊、24個(gè)入血成分和77個(gè)靶點(diǎn)。根據(jù)入血成分的Degree值由高到低進(jìn)行排序，選取前5個(gè)，依次為槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、漢黃芩素(wogonin)、β-胡蘿卜素(beta-carotene)作為金銀花、連翹藥對(duì)治療病毒性心肌炎的關(guān)鍵入血成分。

圖3 “藥物成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.4 繪制PPI網(wǎng)絡(luò)并篩選PPI網(wǎng)絡(luò)核心 在STRING網(wǎng)站繪制PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(見圖4)。經(jīng)兩次Cytoscape 3.9.0軟件的CytoNCA插件拓?fù)浞治雎?lián)合R軟件的重復(fù)篩選后，最終獲得14個(gè)核心靶點(diǎn)(見圖5)，包括PPARG、JUN、CASP3、AKT1、ICAM1等， 即為金銀花、連翹藥對(duì)治療病毒性心肌炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

圖5 核心靶點(diǎn)篩選

2.5 GO富集分析 將77條信號(hào)通路經(jīng)R軟件運(yùn)行后進(jìn)行GO富集分析，選取生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)3部分，共確定與病毒性心肌炎發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)的條目2 355個(gè)。每個(gè)部分選取富集最顯著的10個(gè)繪制GO富集條形圖(見圖6)。分別得到BP 2 193條，主要條目包括對(duì)脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)(response to molecule of bacterial origin)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)(cellular response to chemical stress)、對(duì)金屬離子的反應(yīng)(response to metal ion)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)(response to oxidative stress)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)(cellular response to oxidative stress)等。得到CC 47條，主要條目包括薄膜閥(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)、小凹(caveola)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物(transcription regulator complex)等。得到MF 115條，主要條目包括DNA轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、磷酸酶結(jié)合(phosphatase binding)、蛋白磷酸酶結(jié)合(protein phosphatase binding)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)等。

圖6 GO富集分析結(jié)果

2.6 KEGG富集分析 將77條信號(hào)通路經(jīng)R語言運(yùn)行后共富集到151條KEGG通路，選取富集最顯著的前30個(gè)繪制條形圖(見圖7)。KEGG富集結(jié)果顯示，金銀花-連翹治療病毒性心肌炎可能的作用通路主要富集在脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路(lipid and atherosclerosis)、糖尿病并發(fā)癥中的衰老信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流體剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化通路(fluid shear stress and atherosclerosis)、白細(xì)胞介素-17(1L-17)信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)等信號(hào)通路。其中，脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路圖見圖8。

圖7 KEGG富集分析結(jié)果

圖8 脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路圖

2.7 分子對(duì)接結(jié)果 使用SYBYL-X 2.0軟件分別處理關(guān)鍵靶蛋白的PDB文件，刪除水分子、添加氫鍵、提取配體分子并創(chuàng)建活性口袋，從而獲得核心蛋白的可靠對(duì)接模型。將槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素、β-胡蘿卜素 5個(gè)關(guān)鍵入血活性成分分別和核心靶點(diǎn)PPARG、JUN、CASP3、AKT1、ICAM1進(jìn)行分子對(duì)接，并導(dǎo)出對(duì)活性成分-核心靶點(diǎn)連接性能進(jìn)行評(píng)分的Total_Score表(見表1)，來判斷活性成分-核心靶點(diǎn)的連接性能。選取與核心靶點(diǎn)連接性能Total_Score評(píng)分較高的活性成分，分別為PPARG-漢黃芩素、JUN-槲皮素、CASP3-槲皮素、AKT1-漢黃芩素、ICAM1-木犀草素構(gòu)成對(duì)接圖(見圖9)。對(duì)接結(jié)果顯示：關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)能夠通過氫鍵進(jìn)行結(jié)合，可以形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。

表1 活性成分-核心靶點(diǎn)連接性能Total_Score 單位：分

圖9 分子對(duì)接圖

3 討 論

金銀花、連翹是我國歷史悠久的中藥材，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載：“金銀花性寒味甘，具有清熱解毒、涼血化瘀之功效，主治外感風(fēng)熱、瘟病初起、瘡瘍疔毒、紅腫熱痛、便膿血”?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載連翹“主寒熱，鼠痿，瘰疬，癰腫惡瘡，癭瘤，結(jié)熱”?，F(xiàn)代研究表明，金銀花具有解熱、抗炎、抗病原微生物、增強(qiáng)免疫功能、抗機(jī)體毒素等藥理作用[14]，金銀花中的有效成分木犀草苷對(duì)心血管系統(tǒng)有著明顯的保護(hù)作用[15-18]。連翹具有抗菌抗炎、抗病毒、保肝等藥理作用[19]，連翹的有效成分異連翹酯苷、連翹酯苷都具有較強(qiáng)的抗氧化、抗菌能力[20]。因?yàn)榻疸y花、連翹主要功效在于辛涼解表、清熱解毒，所以常被用于溫病初期和中期的治療。病毒性心肌炎致病病毒多由腸道病毒(尤其是柯薩奇病毒)、腺病毒、細(xì)小病毒B19、人類皰疹病毒等導(dǎo)致[21]。病人發(fā)病之初多有體溫升高、咳嗽、咽喉部不適等癥狀，病因、病機(jī)及癥狀表現(xiàn)與溫病初期風(fēng)熱犯表證大致相同，因此，金銀花、連翹常被用于病毒性心肌炎的治療。盡管目前沒有關(guān)于病毒性心肌炎與溫病關(guān)系的系統(tǒng)論述，但許多醫(yī)生對(duì)于病毒性心肌炎的診療在溫病原則指導(dǎo)下，均取得了很好的臨床療效[22]。

本研究涉及了金銀花-連翹的24個(gè)活性成分，根據(jù)入血成分的Degree值得到槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素、β-胡蘿卜素等關(guān)鍵入血成分。其中，槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-胡蘿卜素為金銀花-連翹兩藥共有成分。槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素是黃酮類化合物，黃酮類化合物已被證明對(duì)高血壓、炎癥、糖尿病和心血管疾病有效[23]。槲皮素可通過H9c2細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子、轉(zhuǎn)錄激活因子1以及絲裂原活化蛋白激酶途徑來有效減輕腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激的損傷，發(fā)揮在心肌炎中的保護(hù)作用[24]。木犀草素可通過抑制炎癥來抑制柯薩奇病毒B3(CVB3)復(fù)制[25]。山奈酚可通過減輕血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)引起的炎癥和氧化應(yīng)激來防止AngⅡ引起的心臟重塑[26]。漢黃芩素可通過激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)來抑制心肌肥大[27]。低劑量的β-胡蘿卜素可調(diào)節(jié)炎癥，減少胱天蛋白酶信號(hào)，并與心肌細(xì)胞系中的自噬激活相關(guān)[28]。本研究涉及77個(gè)潛在藥物作用靶點(diǎn)，GO富集分析發(fā)現(xiàn)金銀花、連翹藥對(duì)通過77個(gè)作用靶點(diǎn)參與病毒性心肌炎的多種生物學(xué)過程，KEGG分析得到脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路、糖尿病并發(fā)癥中的衰老信號(hào)通路、流體剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化通路等151條通路。篩選出PPARG、JUN、CASP3、AKT1、ICAM1等14個(gè)核心靶點(diǎn)。分子對(duì)接表明關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)能夠形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。其中ICAM1結(jié)合能力最強(qiáng)。有研究顯示，ICAM1在CVB3引起的急性病毒性心肌炎小鼠的心肌細(xì)胞表達(dá)中起關(guān)鍵作用[29]。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)金銀花、連翹藥對(duì)治療病毒性心肌炎的有效成分、作用靶點(diǎn)及作用通路進(jìn)行了研究，證明了中藥金銀花、連翹藥對(duì)對(duì)病毒性心肌炎的治療具有多成分-多靶點(diǎn)-多途徑的特點(diǎn)，為今后深入探究金銀花、連翹藥對(duì)治療病毒性心肌炎的作用機(jī)制提供了依據(jù)和參考。但是，本次研究沒有考慮到中藥活性成分的含量問題，同時(shí)只是選取了部分成分及靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接來驗(yàn)證，具有一定的局限性。