電針內(nèi)關穴預處理對經(jīng)皮冠狀動脈介入治療病人心肌保護作用的臨床研究

朱 怡，李 毅，東貴榮

心肌梗死是最嚴重的心血管疾病之一，是我國乃至全球重要的公共衛(wèi)生問題，也是我國居民死亡的第二大病因[1]。隨著經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)的普及，心肌梗死病人的死亡率逐漸下降。PCI術能夠有效恢復梗死心肌的血液供應，減少心肌梗死面積，改善心臟功能，但同時缺血部位的心肌重新獲得血流供應后，常會產(chǎn)生不可逆的二次損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)，這些損傷可以引起嚴重的并發(fā)癥，如梗死面積增大、心室收縮功能降低、心律失常等，從而降低病人生存率[2]。因此，MIRI具有一定的危險性，如何預防或減少這種損傷，提高病人的生存質量，改善預后，是目前面臨的巨大考驗。現(xiàn)代醫(yī)學對MIRI的防治多采取缺血預處理及藥物干預等，但目前尚無定論。本研究通過探究電針內(nèi)關穴預處理對冠心病PCI術病人心臟相關指標的影響，從臨床上證實電針預處理對防治MIRI的作用，以及探討可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年12月—2018年12月在上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院心內(nèi)科確診為冠心病并擇期行PCI術的病人為候選受試對象，所有入選者均辦理常規(guī)入院，完成心內(nèi)科常規(guī)入院檢查，按照排除標準排除部分病人，在入組試驗前告知病人本課題具體研究內(nèi)容及相關可能的受益和風險，在取得病人、家屬的同意后，簽署知情同意書，最后納入病人60例，按照隨機數(shù)字表法分為電針預處理組和對照組(control group，CG)。本研究符合《涉及人的生物醫(yī)學研究倫理審查辦法》《赫爾辛基宣言》和《人體生物醫(yī)學研究國際道德指南》的倫理原則，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院倫理委員會審查并批準，批號為2017-029。受試者了解本臨床試驗并自愿簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①確診為冠心病，年齡18～74歲；②紐約心臟病協(xié)會(NYHA)心功能分級Ⅰ～Ⅲ級；③擬行PCI術；④有能力履行知情同意手續(xù)，并簽署知情同意書。排除標準：①急診PCI病人；②非首次PCI術病人；③伴有嚴重的其他相關疾病(預期生存時間<12個月)；④精神障礙、意識障礙、行為障礙等不能合作者；⑤所需電針區(qū)域有皮膚過敏、破損等功能障礙者；⑥拒絕加入本研究者。中止或撤出標準：①未植入支架病人；②試驗中電針后出現(xiàn)暈針等相關針刺不良反應；③試驗中發(fā)生嚴重安全性問題；④試驗中發(fā)現(xiàn)臨床試驗方案操作失誤，難以評價針刺效果；⑤試驗管理原因。如符合下列任意1項即應剔除，不計入各觀察指標的評價：①未執(zhí)行本試驗方案規(guī)定的受試者；②觀察項目不全且不能評價試驗效果及副反應的受試者。

1.3 治療方法 兩組病人均接受常規(guī)心內(nèi)科藥物治療，本次試驗除電針預處理組行電針預處理外，不進行其他任何干預。

1.3.1 電針預處理組 術前1 h，囑病人取臥位或坐位，手臂內(nèi)側面朝上，對電針預處理組病人的雙側內(nèi)關穴和大陵穴進行電針預刺激。定位：大陵穴在腕橫紋中央，內(nèi)關在腕橫紋上2寸，掌長肌腱與橈側腕屈肌腱之間。操作：將病人電針預處理處的皮膚用乙醇棉球擦拭，待殘留乙醇干燥后，針刺病人雙側內(nèi)關穴、大陵穴，根據(jù)病人體型，針刺深度為0.5～1.0寸，采用平補平瀉法，連接低頻脈沖治療儀進行電針刺激30 min，內(nèi)關穴接負極，大陵穴接正極，采用疏密波(疏波2 Hz，密波30 Hz)，電流強度以病人能耐受最大電流為適宜。電針治療結束后于我院數(shù)字減影血管造影(DSA)室行PCI治療。

1.3.2 對照組 不進行電針預處理。

1.4 相關檢測試劑及儀器

1.4.1 主要化學試劑 Trizol(invitrogen 1596-026)、DEPC處理水[基爾頓生物科技(上海)有限公司，R1600]、Ficoll液[基爾頓生物科技(上海)有限公司，R1603]、人淋巴細胞分離液(Solarbio P8610)、SYBR Green PCR 試劑盒(Thermo #K0223)、逆轉錄試劑盒(Fermentas #K1622)等。

1.4.2 主要實驗儀器 低頻脈沖治療儀(上海醫(yī)療器械技術公司，G6805-2型)、電動勻漿機(FLUKO PRO200)、低溫冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司，TG-16M)、旋渦振蕩器(青浦滬西儀器廠，K30)、Real-time檢測儀(ABI公司，ABI-7500)等。

1.5 觀察指標

1.5.1 心肌損傷相關指標 取電針預處理組病人和對照組病人術前和術后24 h靜脈血5 mL，常溫保存，離心后冷凍保存。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測兩組治療前后血清肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)濃度變化，所有試劑盒均購自美國R&D公司，檢測由上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院檢驗科醫(yī)師嚴格按試劑說明書執(zhí)行。

1.5.2 炎癥相關指標 取電針預處理組病人和對照組病人術前和術后24 h靜脈血5 mL，離心管中加入單核細胞分離液Ficoll液，離心后收集淋巴細胞并置于1.5 mL離心管中，冷凍保存，實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測病人治療前后外周血單核細胞Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子88(MyD88)及核轉錄因子-κB(NF-κB)mRNA的表達。①外周血單核細胞分離。取抗凝血，用等體積磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋全血；在 15 mL離心管中加入5 mL單核細胞分離液Ficoll液，用巴氏吸管吸取等體積的稀釋后全血，小心加在分離液上，平鋪于分離液上層；2 000 r/min室溫離心20 min；觀察出現(xiàn)明顯分層，最上層為稀釋的血漿層，中間為透明的分離液層，血漿與分離液間的白膜層即為單核細胞層，下層為紅細胞和粒細胞，小心吸取白膜層細胞至15 mL離心管中，加入10 mL PBS液，用細胞凍存液重懸細胞，1 500 r/min離心10 min，棄上清，重復上述操作2次；收集淋巴細胞置于1.5 mL離心管中，用于總RNA提取。②cDNA 第一條鏈的合成?？俁NA中DNA的消除：按以下體系加入，DNaseI 1 μL；10×DNaseI Buffer 1 μL；總RNA≤1 ng；DEPC-H2O 4 μL；總體積10 μL。反應條件為37 ℃、30 min；加1 μL乙二胺四乙酸(EDTA)；65 ℃、10 min。RNA逆轉錄：將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，反應條件為37 ℃、60 min，85 ℃、5 min，4 ℃、5 min，體系為RNA-Primer Mix 12 μL、5×RT Reaction Buffer 5 μL、25 mmol/L dNTPs 1 μL、25 U/μL RNase Inhibitor 1 μL、200 U/μL M-MLV Rtase 1 μL和ddH2O(DNase-free)4 μL。③RT-PCR擴增：按照聚合酶鏈式反應(PCR)擴增試劑盒說明書擴增靶基因和內(nèi)參基因，反應條件為95 ℃、10 min(95 ℃、15 s，60 ℃、45 s)×40；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s；反應體系為SYBRGreen Mix 12.5 μL，正向引物0.5 μL，反向引物 0.5 μL，ddH2O 9.5 μL和cDNA模板2 μL。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件ABI Prism 7500 SDS Software進行分析。引物序列見表 1。④基因相對表達量的計算。通過目的基因與內(nèi)參基因的擴增動力學曲線確定擴增效率，采用比較Ct值法對樣品的擴增Ct值進行計算，帶入計算公式求出基因相對表達量。

表1 引物序列

2 結 果

2.1 一般情況 入組病人共60例，因特殊原因脫落3例(2例因手術取消，1例簽署知情同意書后拒絕參加試驗)，故最終納入試驗57例。電針預處理組28例，男17例，女11例，年齡(64.61±6.30)歲；對照組29例，男17例，女12例，年齡(61.38±7.70)歲。兩組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 兩組血清cTnI、CK、CK-MB濃度比較 電針預處理組術前和術后血清cTnI比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對照組PCI術后cTnI有升高趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。電針預處理組術前和術后血清CK濃度比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，電針預處理能降低PCI術后病人血清CK濃度；對照組術前與術后CK濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；雖然兩組PCI術前后CK濃度差值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但電針預處理能抑制PCI術后病人CK濃度升高。電針預處理組與對照組術后血清CK-MB表達均有一定程度降低，術前與術后比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩組PCI術前后CK-MB濃度差值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表2、表3。

表2 兩組cTnI、CK、CK-MB濃度比較[M(Q1，Q3)] 單位：ng/mL

表3 兩組cTnI、CK、CK-MB術前與術后差值比較[M(Q1，Q3)] 單位：ng/mL

2.3 兩組外周血單核細胞中TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA表達比較 兩組治療前外周血單核細胞TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA的表達比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，電針預處理組和對照組術后外周血單核細胞TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA均上升，PCI術前后對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；但電針預處理組TLR4 mRNA術前與術后差值與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；電針預處理能有效降低PCI病人外周血單核細胞MyD88 mRNA、NF-κB mRNA的表達，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表4、表5。

表4 兩組外周血單核細胞TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA表達比較(±s)

表5 兩組外周血單核細胞TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA術前與術后差值比較(±s)

3 討 論

隨著社會現(xiàn)代化進程的加快、生活方式的改變、人口老齡化趨勢等諸多因素，心血管疾病的發(fā)生率逐年升高，我國心血管疾病患病率處于持續(xù)上升階段，根據(jù)2019年出版的《中國心血管健康與疾病報告》推算，我國心血管病現(xiàn)患病人數(shù)達3.3億例，2017年心血管病死亡率仍居首位，高于腫瘤及其他疾病，而心肌梗死是最嚴重的心血管疾病之一，隨著醫(yī)學的不斷發(fā)展，PCI術被廣泛應用于心肌梗死的臨床治療，但近年來的實驗室與臨床研究不斷證明，PCI術作為一種針對心肌梗死的有效治療措施也會導致MIRI[3-4]。MIRI是心肌組織在缺血恢復血流供應后，在各種原因和機制共同作用下，心肌組織發(fā)生結構損傷、代謝異常及功能障礙等，引起梗死面積增大、心律失常、心室重構及心力衰竭等嚴重并發(fā)癥，直接影響病人預后，降低病人生存率[5]，因此，如何減少或者避免MIRI是目前亟須解決的熱點問題。

MIRI發(fā)生機制較為復雜，細胞內(nèi)鈣超載[6-7]、氧自由基暴發(fā)[8]、細胞凋亡[9-10]、細胞自噬[11-14]和細胞壞死[15-16]、炎癥[17-19]等因素是MIRI發(fā)生和發(fā)展的重要原因，各損傷因素之間相互作用，共同導致了心肌細胞結構和功能的損傷。其中，與先天免疫及炎癥反應密切相關的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路被證實影響著心室重構和心臟功能，在MIRI中起重要作用[20-22]，研究顯示，MIRI大鼠心肌細胞中TLR4、MyD88及NF-κB表達增高，TLR4/MyD88/NF-κB信號通路能提高炎癥反應，影響缺血心肌功能的恢復，削弱或抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路能減輕MIRI程度[23-24]。cTnI是判定MIRI的一個敏感且高度特異性的指標，當心肌細胞受損傷時，游離的cTnI釋放入血液，隨著損傷的加重，結合部分的cTnI也釋放入血液，因此，病人cTnI會持續(xù)增高[25-26]；CK較多存在于骨骼肌、平滑肌和心肌細胞的細胞質和線粒體中，與細胞內(nèi)能量轉運、三磷酸腺苷(ATP)再生和肌肉收縮密切相關，急性心肌梗死病人血清中CK含量增高；CK-MB也會釋放入血，CK-MB僅存在于心肌細胞中，因此，檢測血清中CK和CK-MB的含量可作為判斷心肌細胞損傷的重要輔助手段[27-28]。

既往研究證實，電針內(nèi)關穴可以通過降低鈣離子超載、減少心肌細胞凋亡、抗氧化應激反應、抗炎等多種機制，有效保護心肌，改善心臟功能。本研究結果顯示，PCI術后病人血清cTnI、CK及外周血單核細胞TLR4、MyD88 和 NF-κB mRNA表達均有一定程度的升高，說明 PCI術后病人在一定程度上發(fā)生了MIRI；電針內(nèi)關穴預處理能有效抑制PCI術后病人血清 cTnI和CK濃度。說明電針內(nèi)關穴能保護MIRI心??；并且電針預處理能有效降低外周血單核細胞MyD88、NF-κB mRNA表達，以及對TLR4 mRNA表達也有一定的抑制作用，以上均說明電針內(nèi)關穴預處理能有效抑制PCI術后病人發(fā)生MIRI的程度，預防MIRI，其作用機制可能與TLR4/MyD88/NF-κB信號通路有關。

在以往關于內(nèi)關穴改善MIRI的研究中，多以實驗研究為主，通過本次臨床觀察研究，從臨床上進一步證實了電針預處理內(nèi)關穴對冠心病行PCI術病人心肌有保護作用，這為今后在臨床上如何有效地預防MIRI，提高冠心病行PCI術病人的臨床預后，提供了新思路。本試驗缺少術后長期隨訪，尚未跟蹤記錄病人心臟超聲、心力衰竭發(fā)生率、生存率等指標，將在今后進行進一步深入研究。