紙上微型實(shí)驗(yàn)室在食品檢測(cè)領(lǐng)域的研究進(jìn)展

陳 洋，楊湛森，王 鑫，宋光春，黃薈嫻，徐瑗聰，羅云波，黃昆侖，程 楠,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京 100024）

消費(fèi)者對(duì)食品安全、健康、營(yíng)養(yǎng)更高標(biāo)準(zhǔn)的要求為食品檢測(cè)帶來新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。食源性致病微生物、農(nóng)獸藥殘留、重金屬、食品添加劑、非法添加物、毒素和外源性污染物等食品安全風(fēng)險(xiǎn)因子不僅極大地危害人類健康，而且對(duì)生態(tài)環(huán)境、社會(huì)穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅[1]。加強(qiáng)對(duì)上述風(fēng)險(xiǎn)因子的快速檢測(cè)顯得尤為重要。然而，常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[2]、熒光光譜分析技術(shù)[3]、分光光度法[4]、高效液相色譜[5]等雖然精密度很高，但存在時(shí)滯性、操作復(fù)雜性、要求專業(yè)性等眾多制約，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)需求[6]。

紙作為傳感器常用的基材之一，已廣泛應(yīng)用于快速檢測(cè)領(lǐng)域，這得益于紙的眾多優(yōu)點(diǎn)：1）由多層纖維素組成，內(nèi)部形成的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可為大顆粒物質(zhì)和液體提供儲(chǔ)存空間，并能避免氣溶膠的產(chǎn)生；2）內(nèi)含大量羥基，依靠毛細(xì)管力使液體流動(dòng)，無需外源泵閥；3）含有多種官能團(tuán)，能夠提供較好的反應(yīng)活性和生物兼容性；4）作為一種質(zhì)量輕的柔性材料，可折疊、易切割，為簡(jiǎn)便化檢測(cè)提供可能；5）紙一般呈白色，添加試劑后顏色均勻，具有良好的比色分析背景；6）價(jià)格低廉，加工處理簡(jiǎn)單，可大規(guī)模生產(chǎn)；7）使用后可降解、可回收，環(huán)境友好[7-8]。隨著新型生物、化學(xué)制劑和高新材料的引入，“紙”已不僅僅局限于傳統(tǒng)意義上的纖維素紙（濾紙、色譜紙、打印紙等），多種表面改性方法賦予紙新的性能，各種具有柔性和多孔結(jié)構(gòu)的由纖維素和聚合物組成的離子交換膜或復(fù)合膜為紙基分析裝置添加了分離、過濾、擴(kuò)增等功能[8-9]。

“紙上微型實(shí)驗(yàn)室”是以紙為基底建立的微分析系統(tǒng)，利用固定在紙基表面的識(shí)別元件與靶標(biāo)分子識(shí)別反應(yīng)，將分析物的濃度轉(zhuǎn)化為光學(xué)、電化學(xué)或其他信號(hào)進(jìn)行定性、半定量或定量檢測(cè)[10-11]，其原理如圖1所示。近年來，“紙上微型實(shí)驗(yàn)室”因兼具快速、便攜、靈敏、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)，已成為食品快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

圖1 “紙上微型實(shí)驗(yàn)室”的原理Fig.1 Principle of “l(fā)ab on paper”

本文綜述了紙層析法、化學(xué)試紙、側(cè)流層析試紙條、紙基微流控分析裝置（microfluidic paper-based analytical devices，μPADs）和合成生物學(xué)紙的原理、分類、優(yōu)缺點(diǎn)及研究進(jìn)展，并總結(jié)了以上5 種紙基分析方法在食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用情況，最后展望了“紙上微型實(shí)驗(yàn)室”面臨的挑戰(zhàn)和未來的發(fā)展趨勢(shì)，以期拓寬紙基分析方法在食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

1 紙基分析技術(shù)

1.1 紙層析法

紙層析法又稱紙色譜法，是基于相似相溶原理利用紙纖維（固定相）和溶劑（流動(dòng)相）分離有色組分的分析方法，屬于以紙為支撐物的薄層層析技術(shù)。分離時(shí)將混合樣品點(diǎn)在色譜紙的下端，并放置在裝有展開劑的密閉展開缸中，由于樣品中各組分在同一介質(zhì)中分配系數(shù)不同，因此會(huì)形成相互分離的斑塊，從而實(shí)現(xiàn)各組分的高效分離和快速鑒定[12]。

紙層析法適用于氨基酸[13]、色素[14]、有機(jī)酸[15]等食品中小分子化合物的檢測(cè)，能滿足組分?jǐn)?shù)較少樣品初步分離、鑒定的需求。為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)微量、定量測(cè)定，紙上涂覆納米材料和聯(lián)用高精度檢測(cè)儀器是提高靈敏度常用的策略，如Zhang Min[16]和張建云[17]等分別聯(lián)用酶標(biāo)儀法和分光光度法檢測(cè)微生物發(fā)酵液中的γ-氨基丁酸和L-絲氨酸；Weatherston等[18]將表面增強(qiáng)拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）與紙層析法聯(lián)用，通過在超細(xì)玻璃纖維濾紙上鍍納米銀增強(qiáng)SERS信號(hào)，用來分離和鑒定食品中的番茄紅素和β-胡蘿卜素。

1.2 化學(xué)試紙法

化學(xué)試紙法通常將顯色試劑固定在試紙條上，與靶標(biāo)接觸時(shí)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，再與標(biāo)準(zhǔn)比色卡進(jìn)行比較，從而完成樣品的目視定性或半定量分析[19]。

化學(xué)試紙是包容性很強(qiáng)的微型檢測(cè)平臺(tái)，如常用的pH試紙[20]、亞硝酸鹽試紙[21]、過氧化物試紙[22-24]等，適合反應(yīng)步驟少、顏色變化明顯的物質(zhì)檢測(cè)。然而，簡(jiǎn)單的化學(xué)試紙只能粗略地指示待測(cè)物濃度，且指示劑容易老化、穩(wěn)定性較差[25]。由此衍生出許多提升化學(xué)試紙法性能的方法，如熊慧娟等[26]將化學(xué)試紙法與樹脂吸附富集法聯(lián)用，使亞硝酸根離子檢測(cè)精度大幅提高；也可以配合圖像分析裝置進(jìn)行比色，Iacono等[20]針對(duì)啤酒生產(chǎn)過程中的昏暗環(huán)境設(shè)計(jì)了pH值測(cè)試儀，避免陰影和光照對(duì)比色結(jié)果的影響，擴(kuò)大了酸堿度檢測(cè)范圍。

1.3 側(cè)流層析試紙條

側(cè)流層析即側(cè)向流動(dòng)分析（lateral flow assays，LFAs），LFAs試紙條一般由5 個(gè)部分組成，依次為樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜、吸收墊和聚氯乙烯背板，相鄰的墊彼此重疊一部分以保證液體連續(xù)流動(dòng)，背板在最下面提供機(jī)械支撐[27]。待測(cè)樣品被滴加在樣品墊上，在毛細(xì)管力作用下輸送至結(jié)合墊，與其上所儲(chǔ)存識(shí)別靶標(biāo)的有色納米材料標(biāo)記的抗體（如金標(biāo)抗體）相互作用，形成肉眼可見的免疫復(fù)合物[28]。NC膜負(fù)責(zé)捕獲分析物，抗體通過靜電作用、氫鍵和/或疏水力沉積在NC膜上，構(gòu)成一條或多條測(cè)試（test，T）線和一條控制（control，C）線。樣品流過膜的過程中，免疫復(fù)合物和多余的標(biāo)記試劑分別被T線和C線捕獲，由于標(biāo)記材料（如納米金）的光學(xué)性質(zhì)，T線和C線上形成并保留可視線，并以T線區(qū)域信號(hào)的強(qiáng)弱判定檢測(cè)結(jié)果。最后，多余的液體由吸收墊截留，吸收墊具有強(qiáng)大的持液能力，并為整個(gè)流動(dòng)分析過程提供芯吸力[29]。

LFAs分為夾心型和競(jìng)爭(zhēng)型兩種反應(yīng)模式。夾心型反應(yīng)模式如圖2A所示，在T線上捕獲復(fù)合物，形成有色納米材料-分析物-識(shí)別元件的“三明治”結(jié)構(gòu)，T線上分析物濃度與信號(hào)強(qiáng)度呈正相關(guān)。不含分析物的粒子通過T線，但被另一種捕獲分子捕獲，形成C線。夾心型多用于檢測(cè)蛋白質(zhì)和核酸等具有多個(gè)抗原表位的大分子物質(zhì)[30]。競(jìng)爭(zhēng)型反應(yīng)模式如圖2B所示，分析物在T線上與捕獲分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致免疫復(fù)合物在測(cè)試線上不聚集，即分析物濃度和T線上的信號(hào)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)。樣品中不存在分析物時(shí)，可以在T線和C線處捕獲有色納米材料-識(shí)別元件復(fù)合物。競(jìng)爭(zhēng)型反應(yīng)模式適用于檢測(cè)類固醇類的小分子抗原、農(nóng)藥和獸藥等具有單個(gè)抗原表位的小分子分析物[27,31]。

圖2 LFAs夾心型（A）和競(jìng)爭(zhēng)型（B）反應(yīng)模式示意圖[28]Fig.2 Schematic diagram of LFAs sandwich (A) and competitive (B)response formats[28]

如何提高LFAs靈敏度是研究人員長(zhǎng)久以來面臨的挑戰(zhàn)，而識(shí)別元件和標(biāo)記材料的創(chuàng)新和發(fā)掘?yàn)榇穗y題帶來新的機(jī)遇。抗體作為識(shí)別元件存在穩(wěn)定性差、批次差異大、生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)和時(shí)間成本高等不足[32]。為了突破上述局限性，許多抗體替代品應(yīng)運(yùn)而生，如功能核酸[33]、多糖[34]、噬菌體[35]、抗生素[36]等，它們具有較高的特異性和親和力、高重現(xiàn)性、低成本的優(yōu)點(diǎn)。LFAs通常使用20～80 nm的納米顆粒進(jìn)行偶聯(lián)，其中金納米粒子（Au nanoparticles，AuNPs）因其完美的球形結(jié)構(gòu)和惰性成為L(zhǎng)FAs法中應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記材料[31]。不同形狀的AuNPs具有可控的形貌特征和優(yōu)異的化學(xué)、電學(xué)性質(zhì)，如金納米棒[37]、金納米花[38]、金納米簇[39]以及有機(jī)物和貴金屬包被的納米金等[32]，不僅具有膠體金的優(yōu)點(diǎn)，而且相比球狀A(yù)uNPs比表面積更大，能彌補(bǔ)其發(fā)光強(qiáng)度較弱的不足，從而提高檢測(cè)靈敏度。此外，各種金屬氧化物納米顆粒[40]、氧化石墨烯[41]、碳納米顆粒[42]、量子點(diǎn)[43]、熒光納米顆粒[44]等新型敏感材料因具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在LFAs應(yīng)用中表現(xiàn)出巨大的潛力。

1.4 紙基微流控分析裝置

μPADs是利用微加工技術(shù)在紙上設(shè)計(jì)并組裝各種結(jié)構(gòu)，如通道、反應(yīng)池、微泵、微閥等功能單元，引導(dǎo)液體沿指定通路流動(dòng)并完成反應(yīng)的技術(shù)[11]。自2007年Whitesides團(tuán)隊(duì)首次提出μPADs的概念[45]，隨后μPADs引起學(xué)界廣泛關(guān)注并持續(xù)至今。μPADs的基本原理是將紙芯片直接切割或采用化學(xué)改性[46]、物理沉積[47]堵塞纖維素紙內(nèi)的孔隙來改變紙的親/疏水性，以紙為基底構(gòu)建圖案化親水區(qū)域和疏水通道[48]，如圖3A所示。在毛細(xì)作用力的驅(qū)動(dòng)下，液體按圖案定向流動(dòng)并反應(yīng)，后經(jīng)分析器件轉(zhuǎn)化為其他信號(hào)進(jìn)行比較分析。

圖3 通過折疊紙掩模制作μPADs的接觸印刷示意圖（A）[48]和基于角度（B）[53]、直徑（C）[54]、長(zhǎng)度（D）[55]的無需儀器讀出裝置的μPADs[48]Fig.3 Schematic representation of contact printing for fabrication of μPADs by a folded paper mask (A) and μPADs without instrument readout device[48]based on angle (B)[53],diameter (C)[54],and length (D)[55] signals

根據(jù)不同的折疊方式，μPADs有二維和三維兩種形式。二維μPADs對(duì)平面上簡(jiǎn)單的反應(yīng)有較良好的性能，但當(dāng)需要過濾或儲(chǔ)存、有多種試劑加入或發(fā)生多步反應(yīng)時(shí)，二維μPADs便無法充分滿足檢測(cè)需求。此時(shí)，三維μPADs成為實(shí)現(xiàn)多功能、高通量檢測(cè)更好的選擇。紙的柔性為三維μPADs的結(jié)構(gòu)和功能提供了更多的可能性，如折紙、堆疊、3D打印[49]和制成可穿戴式[50]裝置等形式。為了消除復(fù)雜分析中多步驟試劑操作的不必要程序，Yakoh等[51]開發(fā)了按順序輸送流體的μPADs，其由折紙和可移動(dòng)試劑儲(chǔ)存墊兩個(gè)部件構(gòu)成；Shen Yu等[52]通過堆疊和折紙建立了蠟屏障和“紙橋”，實(shí)現(xiàn)紙基傳感器陣列均勻分割和個(gè)體功能化。

根據(jù)μPADs分析準(zhǔn)確度的不同，可分為定性、半定量和定量檢測(cè)。對(duì)于有沉淀、氣體生成或明顯顏色變化的反應(yīng)，通過肉眼即可初步定性；對(duì)于反應(yīng)生成變色不溶性物質(zhì)的待測(cè)物，可配合小型讀出裝置，如圖3B～D所示，分別依靠目視顯色范圍的角度[53]、半徑[54]或長(zhǎng)度[55]，配合量角器和直尺實(shí)現(xiàn)半定量檢測(cè)。為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，μPADs常聯(lián)用光學(xué)和電化學(xué)檢測(cè)儀器對(duì)轉(zhuǎn)化信號(hào)進(jìn)行分析。光學(xué)檢測(cè)法是根據(jù)反應(yīng)的光學(xué)特征變化對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行分析，包括比色法[56]、熒光法[57]、化學(xué)發(fā)光[58]和電化學(xué)發(fā)光法[59]以及拉曼光譜分析[60]等。光學(xué)檢測(cè)法較為直觀且靈敏度較高，但對(duì)反應(yīng)區(qū)污染情況、生成的顯色化合物以及紙基的穩(wěn)定性有嚴(yán)格要求。電化學(xué)檢測(cè)法是建立在待測(cè)物的電化學(xué)性質(zhì)基礎(chǔ)上的分析方法。在電化學(xué)紙基傳感器中，反應(yīng)產(chǎn)生可測(cè)定的電流[61]、電位[62]、電導(dǎo)[63]、電阻和電抗[64]，從而將直接或間接的氧化還原反應(yīng)結(jié)果轉(zhuǎn)化成電信號(hào)。與光學(xué)檢測(cè)法相比，電化學(xué)傳感器的優(yōu)勢(shì)在于響應(yīng)速度快、抗干擾性強(qiáng)，但高背景電流一直是電化學(xué)檢測(cè)面臨的難題[65]。為了提升μPADs的靈敏度，常采用導(dǎo)電油墨或絲網(wǎng)制備電極、納米材料修飾電極，或采用抗污染材料改性等措施[66]。隨著食品成分復(fù)雜化和檢測(cè)分析技術(shù)的快速發(fā)展，衍生出許多檢測(cè)儀器與μPADs聯(lián)用的檢測(cè)新方法，如X射線衍射[67]、質(zhì)譜[68]等。

1.5 合成生物學(xué)紙

合成生物學(xué)是生命科學(xué)與工程學(xué)科交叉的新興領(lǐng)域，根據(jù)承載各種生物功能的基礎(chǔ)單元——“基因元件”，在工程學(xué)及計(jì)算機(jī)指導(dǎo)下設(shè)計(jì)基因序列，利用DNA合成與組裝技術(shù)編程遺傳信息，然后移入底盤細(xì)胞或無細(xì)胞反應(yīng)體系中發(fā)揮功能[69]。合成生物學(xué)紙是在紙基上構(gòu)建的可編程的體外診斷平臺(tái)，如圖4所示，以紙為基底嵌入生物系統(tǒng)并建立成套的“紙基傳感器＋開關(guān)/邏輯門”基因回路，通過感應(yīng)由靶標(biāo)引起的特定變化，反應(yīng)體系將開啟、關(guān)閉或切換特殊功能，完成分子識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)化與傳感過程，從而達(dá)到檢測(cè)的目的[70-72]。近些年，合成生物學(xué)模型、工具包和基因回路的多樣化和模塊化極大推進(jìn)了紙基傳感器的可持續(xù)發(fā)展，基于合成生物學(xué)的“紙上微型實(shí)驗(yàn)室”日益成熟，并在食品檢測(cè)領(lǐng)域嶄露頭角[73]。

圖4 合成生物學(xué)紙的檢測(cè)原理[74]Fig.4 Principle of food safety detection by paper-based synthetic biology[74]

根據(jù)人工設(shè)計(jì)的生物系統(tǒng)對(duì)活細(xì)胞的依賴性可分為全細(xì)胞體系和無細(xì)胞體系，在大多數(shù)情況下，合成生物學(xué)與活細(xì)胞緊密相連[75]。在胞內(nèi)合成生物學(xué)傳感器中，活細(xì)胞可以感應(yīng)到特定的生化分子或物理刺激，結(jié)合開關(guān)、邏輯門、負(fù)反饋回路、轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)或環(huán)形振蕩器等組件，整合一個(gè)或多個(gè)基因邏輯電路[76]。例如，Wan Xinyi等[77]基于細(xì)胞的生物傳感器進(jìn)行模塊化信號(hào)放大處理，包括識(shí)別外部信號(hào)并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)為細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄信號(hào)的傳感模塊、調(diào)制轉(zhuǎn)導(dǎo)傳感器信號(hào)的計(jì)算模塊以及執(zhí)行生理反應(yīng)的輸出驅(qū)動(dòng)模塊，并結(jié)合水凝膠和微流控技術(shù)設(shè)計(jì)了可生成梯度體積模式響應(yīng)砷離子污染水平的微生物傳感陣列。這種超靈敏細(xì)菌傳感器首次證明了胞內(nèi)串聯(lián)放大轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的可行性，為工程微生物傳感器陣列的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

全細(xì)胞體系的優(yōu)勢(shì)在于活細(xì)胞的自我復(fù)制，然而復(fù)雜的胞內(nèi)體系和細(xì)胞膜的阻礙不可避免地加大了工程難度[75]。降低對(duì)細(xì)胞的依賴性能夠提高細(xì)胞工程的靈活性，因此，無細(xì)胞系統(tǒng)成為合成生物學(xué)應(yīng)用的關(guān)鍵平臺(tái)，與體內(nèi)蛋白質(zhì)合成相比，無細(xì)胞體系安全且易于調(diào)節(jié)[78]。目前，無細(xì)胞系統(tǒng)已發(fā)展形成提取、純化和合成酶途徑3 種類型[75]，功能化組件、工具包以及能量系統(tǒng)日益成熟并形成體系。Takahashi等[79]將兩種合成生物學(xué)技術(shù)——基于RNA Toehold開關(guān)的分子傳感器和無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)集成于紙片上，從10 種腸道微生物中檢測(cè)其特異性mRNA，經(jīng)核酸序列擴(kuò)增后，檢測(cè)限低至3 fmol/L，另外，該平臺(tái)能以凍干的形態(tài)在室溫下穩(wěn)定保存，這是無細(xì)胞合成生物學(xué)紙常用的保存方式，方便儲(chǔ)存和運(yùn)輸；檢測(cè)時(shí)復(fù)水即可激活反應(yīng)體系，使用場(chǎng)景不再受限于實(shí)驗(yàn)室。

與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)相比，“紙上微型實(shí)驗(yàn)室”輕巧便攜、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)領(lǐng)域有巨大優(yōu)勢(shì)，與此同時(shí)，日益普遍的新業(yè)態(tài)、新資源食品以及消費(fèi)者對(duì)食品的更高標(biāo)準(zhǔn)也為“紙上微型實(shí)驗(yàn)室”帶來了新挑戰(zhàn)（表1）。

表1 “紙上微型實(shí)驗(yàn)室”的優(yōu)勢(shì)與挑戰(zhàn)Table 1 Advantages and disadvantages of “l(fā)ab on paper”

2 “紙上微型實(shí)驗(yàn)室”在食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

近些年，由于“紙上微型實(shí)驗(yàn)室”耗時(shí)短、成本低、體積小等諸多優(yōu)勢(shì)，能夠突破傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜、成本高的局限性，并滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)對(duì)靈敏度和選擇性的需求。“紙上微型實(shí)驗(yàn)室”為食源性致病微生物、重金屬、農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、食品添加劑、非法添加物以及毒素等食品安全風(fēng)險(xiǎn)因子的檢測(cè)提供快速、便捷、可靠的平臺(tái)，從而拓寬了其在食品檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用前景。目前“紙上微型實(shí)驗(yàn)室”在食品檢測(cè)中的應(yīng)用匯總?cè)绫?所示。

表2 “紙上微型實(shí)驗(yàn)室”在食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用Table 2 Applications of “l(fā)ab on paper” in food detection

續(xù)表2

2.1 食源性致病微生物

通過攝取食物而使病原體進(jìn)入人體，以致人體患感染性或中毒性疾病的致病菌和病毒，統(tǒng)稱為食源性致病微生物，其侵入和感染對(duì)食品安全和人體健康造成巨大威脅。經(jīng)典的微生物快速測(cè)試紙片通過檢測(cè)致病菌代謝產(chǎn)物、觀察菌落特征檢測(cè)少量樣品，其檢測(cè)范圍窄、耗時(shí)較長(zhǎng)、精度較低甚至只能定性分析[113]。無論是致病菌還是病毒，其免疫機(jī)制和遺傳物質(zhì)分別提供了兩種高特異性檢測(cè)手段，因此LFAs、μPADs和合成生物學(xué)紙成為檢測(cè)食源性致病微生物的有力平臺(tái)。Ilhan等[35]以噬菌體為識(shí)別元件建立了腸炎沙門氏菌LFAs試紙條，檢出限和檢測(cè)時(shí)間分別低至7 CFU/mL和0.5 h，良好的靈敏度、特異性和檢測(cè)速度證明噬菌體可以作為細(xì)菌LFAs中抗體的替代分析物特異性試劑。Trinh等[82]發(fā)明了基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的μPADs，將注入擴(kuò)增試劑和特異性引物的紙芯片包埋在微裝置的反應(yīng)室中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)3 種致病菌（大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌）的純化、擴(kuò)增和熒光快速檢測(cè)。Ma Duo等[114]基于Toehold開關(guān)的RNA傳感建立了紙基無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)檢測(cè)GII.4型諾如病毒，如圖5所示，首先用磁珠富集諾如病毒，然后用核酸序列擴(kuò)增或逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增病毒RNA，擴(kuò)增的核酸被添加到基于紙張的無細(xì)胞體系中，觸發(fā)序列特異性的Toehold開關(guān)產(chǎn)生β-半乳糖苷酶α肽和ω肽，互補(bǔ)后形成活性β-半乳糖苷酶，通過對(duì)氯酚紅-β-D-半乳吡喃糖苷的切割，紙片顏色由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)樽仙?。該檢測(cè)方法經(jīng)磁珠富集后可將檢測(cè)限降低至270 zmol/L；相比使用完整β-半乳糖苷酶作為輸出產(chǎn)物，可將紙基分析時(shí)間縮短41%（23 min）。合成生物學(xué)紙相比LFAs和μPADs，對(duì)于能被活細(xì)胞識(shí)別或以核酸為遺傳信息的靶標(biāo)，能深入分子層面進(jìn)行檢測(cè)，選擇性和靈敏度更高。為了降低檢出限，往往先對(duì)微生物進(jìn)行分離、富集和擴(kuò)增，擴(kuò)大檢測(cè)范圍的同時(shí)降低試劑和樣品損耗，但時(shí)間成本和價(jià)格成本隨之增加。

圖5 基于Toehold開關(guān)的無細(xì)胞合成生物學(xué)紙檢測(cè)諾如病毒的示意圖[114]Fig.5 Schematic diagram of cell-free synthetic biology paper detection of norovirus based on toehold switch[114]

2.2 重金屬

重金屬是指密度大于5.0 g/cm3的金屬元素，包括鎘、鉛、銅、汞等約45 種，不僅會(huì)導(dǎo)致人體慢性中毒，而且具有富集效應(yīng)、難分解，已成為食品安全領(lǐng)域的突出問題。Song Yuqi等[86]利用4-MBA@AuNPs分子的“三明治”結(jié)構(gòu)，將其修飾到層析濾紙和AuNPs上以連接重金屬離子并作為SERS信號(hào)分子，成功檢出糙米中的Cd2＋、Cu2＋和Ni2＋。Zhang Dong等[87]在魯棒親水熒光水凝膠涂層的柔性紙/紡織薄膜上建立“微型實(shí)驗(yàn)室”，基于Hg2＋和硫脲之間的氧化還原反應(yīng)誘導(dǎo)由綠色到藍(lán)色的熒光發(fā)射顏色的變化，制造出熒光水凝膠涂層可穿戴傳感手套，方便視覺觀測(cè)的同時(shí)，能有效保護(hù)食品安全監(jiān)測(cè)人員遠(yuǎn)離有毒的Hg2＋污染產(chǎn)品。Zhou Junrui等[89]基于無毒、環(huán)保的新型熒光ZnSe量子點(diǎn)的離子印跡技術(shù)，在3D旋轉(zhuǎn)μPADs平臺(tái)實(shí)現(xiàn)Cd2＋和Pb2＋的特異性和多通道檢測(cè)。合成生物學(xué)紙為As2＋的檢測(cè)搭建快速、便捷的平臺(tái)，Lin Xiaomei等[78]將調(diào)控LacZ的基因回路和無細(xì)胞系統(tǒng)嵌入到紙上，通過切割底物氯酚紅-β-D-半乳吡喃糖苷介導(dǎo)色度輸出，As2＋的檢出限為0.5 mmol/L；相比之下，Wan Xinyi等[77]基于大腸桿菌全細(xì)胞體系中應(yīng)用模塊化、級(jí)聯(lián)的信號(hào)放大方法，首先調(diào)整細(xì)胞內(nèi)感覺受體的密度來提高靈敏度，然后設(shè)計(jì)多層轉(zhuǎn)錄放大器依次提高輸出表達(dá)水平，最終將輸出信號(hào)提高了750 倍，檢測(cè)限低于0.1 μg/kg。此外，根據(jù)重金屬的特征顯色反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、拉曼效應(yīng)、與功能核酸和蛋白質(zhì)特異性結(jié)合等特性搭建多種“紙上微型實(shí)驗(yàn)室”，能夠?yàn)橹亟饘贆z測(cè)提供安全可靠的紙基平臺(tái)。

2.3 農(nóng)藥殘留和獸藥殘留

農(nóng)藥和獸藥是為保障果蔬和肉品質(zhì)量所采取的施藥措施，其殘留對(duì)人類健康和可持續(xù)發(fā)展極其不利。Song Yuqi等[86]將紙層析法與SERS聯(lián)用，對(duì)3 種獸藥（孔雀石綠、亞甲基藍(lán)、結(jié)晶紫）進(jìn)行高效分離檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)10 nmol/L。Wang Qin等[91]將雙量子點(diǎn)與高活性納米卟啉結(jié)合，建立基于雙納米信號(hào)放大的可視化熒光紙基傳感器，通過對(duì)3 種有機(jī)磷農(nóng)藥（樂果、敵敵畏、內(nèi)吸磷）產(chǎn)生的不同顏色變化響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)半定量分析。Shi Qiaoqiao等[95]開發(fā)了由AuNPs結(jié)合抗新霉素單克隆抗體和SERS探針分子4-氨基噻吩的雙標(biāo)記免疫探針，并依此建立了用于牛奶中抗生素檢測(cè)的競(jìng)爭(zhēng)型LFAs試紙條，分析物濃度與高分辨SERS信號(hào)成反比，檢出限低至216 pg/mL。金蕊[92]基于AChE-ChO-Cu3(PO4)2·3H2O納米花搭建了電化學(xué)和比色雙重信號(hào)輸出的μPADs，利用集成納米酶與生物酶于一體的多酶級(jí)聯(lián)催化特性，將對(duì)氧磷農(nóng)藥即時(shí)檢測(cè)的檢測(cè)限降至fg/mL級(jí)別。Arduini等[62]利用集成多種紙基絲網(wǎng)印刷電極的三維μPADs和便攜式電位器，以折疊和展開為基礎(chǔ)操作，利用計(jì)時(shí)電流法監(jiān)測(cè)酶活性與農(nóng)藥殘留量相關(guān)的抑制關(guān)系，無需添加任何試劑或?qū)悠愤M(jìn)行任何處理（如稀釋、過濾、調(diào)節(jié)pH值）即可實(shí)現(xiàn)對(duì)有機(jī)磷類殺蟲劑、苯氧酸類除草劑、三嗪類除草劑農(nóng)藥的多功能分析。農(nóng)藥和獸藥種類豐富，大部分為有機(jī)化合物，適合在化學(xué)試紙、LFAs及μPADs平臺(tái)上檢測(cè)，相比之下，合成生物學(xué)紙的優(yōu)勢(shì)難以在此類無核酸結(jié)構(gòu)的靶標(biāo)的檢測(cè)中體現(xiàn)。

2.4 食品添加劑

食品添加劑主要包括一些鹽類和小分子化合物，其錯(cuò)用、濫用和超標(biāo)使用將影響新陳代謝并對(duì)人體器官造成危害。如圖6所示，Gharaghani等[97]將紙層析法與μPADs結(jié)合，反復(fù)折疊色譜紙構(gòu)建3D微色譜平臺(tái)，以碳酸氫鹽緩沖液為流動(dòng)相，縱向?qū)游霾⑼瑫r(shí)比色測(cè)定了兩種偶氮食品著色劑（酒黃石和靛藍(lán)胭脂紅）。陳敏[21]制備了亞硝酸鹽化學(xué)試紙，利用亞硝酸鹽與氨基苯磺酸重氮化反應(yīng)后，再與萘乙二胺發(fā)生顯色反應(yīng)，只能完成定性或半定量檢測(cè)；相比之下，Thinikan等[99]以環(huán)保的蜂蠟作為疏水材料，采用絲網(wǎng)印刷μPADs，基于Griess偶聯(lián)反應(yīng)同時(shí)比色檢測(cè)食品中硝酸鹽和亞硝酸鹽，檢出限分別為0.4 mg/L和0.1 mg/L。因此，食品添加劑可采用紙層析法分離和初步測(cè)定，在化學(xué)試紙或μPADs平臺(tái)實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。

圖6 基于紙層析法和折疊3D μPADs檢測(cè)食品著色劑的示意圖[97]Fig.6 Schematic diagram of food colorant detection based on paper chromatography and folded 3D μPADs[97]

2.5 非法添加物

不法商販在食品生產(chǎn)中加入非法添加物，不僅危害消費(fèi)者身體健康，還可能造成社會(huì)對(duì)食品添加劑的恐慌。楊若朦等[101]根據(jù)古蔡氏法制備乙酸鉛試紙檢測(cè)食品中的亞硫酸鹽，設(shè)計(jì)的反應(yīng)裝置可用于多種揮發(fā)性有害氣體（如SO2、甲醛）的快速檢測(cè)。Li Yingying等[102]首次將基于AuNPs的LFAs應(yīng)用于減肥保健食品中濫用藥物呋塞米的檢測(cè)中，檢測(cè)限為1.0～1.2 mg/kg，12 min內(nèi)即可完成樣品前處理、特異性檢測(cè)和肉眼讀數(shù)全過程。Xie Liping等[48]以聚二甲基硅氧烷為阻隔劑，通過折紙建立了快速檢測(cè)三聚氰胺的三維μPAD，三聚氰胺使AuNPs聚集導(dǎo)致檢測(cè)區(qū)由淺粉色變?yōu)樗{(lán)紫色，比色分析的檢出限為0.1 mg/kg。

2.6 毒素

食品中的毒素通常是會(huì)干擾人體生理生化反應(yīng)的有機(jī)化合物，包括細(xì)菌性、真菌性和其他生物毒素，LFAs是其主要紙基檢測(cè)方法。Pei Pengxiang等[104]合成了一種基于不對(duì)稱雙嗪衍生物的紙基化學(xué)傳感器，以水楊醛腙作為結(jié)合位點(diǎn)和熒光信號(hào)基團(tuán)識(shí)別苦杏仁中的CN－，熒光光譜的檢測(cè)限降至0.947 μmol/L。Wang Chongwen等[105]將羧基化量子點(diǎn)固定在聚乙烯亞胺改性Fe3O4磁性納米顆粒表面，構(gòu)成磁性量子點(diǎn)納米顆粒并應(yīng)用于LFA試紙條，實(shí)現(xiàn)了食品中蛋白質(zhì)毒素的捕獲、富集和多重檢測(cè)，A型肉毒毒素和葡萄球菌腸毒素的檢出限分別為2.52 pg/mL和2.86 pg/mL。牛群峰等[106]基于LFAs和隧道磁阻傳感器建立了黃曲霉毒素B1檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)時(shí)間僅需40 s，且該系統(tǒng)可與多重檢測(cè)磁性層析紙結(jié)合實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；Zhang Ting等[108]基于Fe3O4@Au超粒子復(fù)合材料顯著的光熱效應(yīng)、磁性和直接吸附抗體的性能，建立了定量檢測(cè)赭曲霉毒素A的LFA試紙條，在808 nm波長(zhǎng)輻射下用便攜式紅外熱像儀記錄試紙條的光熱圖像以實(shí)現(xiàn)定量分析，并選取玉米、花生和大豆為樣品驗(yàn)證了其實(shí)際應(yīng)用潛力。

2.7 其他

隨著食品種類多樣化和成分復(fù)雜化，新型食品材料潛在有害組分對(duì)人體的危害無法忽視。除上述風(fēng)險(xiǎn)因子外，轉(zhuǎn)基因食品、生物源摻假、食品包裝釋出物等物質(zhì)的檢測(cè)也可依賴于“紙上微型實(shí)驗(yàn)室”。Zhang Qian等[110]基于便攜式3D打印生物傳感裝置實(shí)現(xiàn)了特異性重組酶聚合酶擴(kuò)增和LFAs的一體化操作，該裝置能在5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因組的提取，并在25 min內(nèi)完成轉(zhuǎn)基因玉米MON810的定性檢測(cè)，還可巧妙地應(yīng)用于基于等溫反應(yīng)和LFAs的其他檢測(cè)領(lǐng)域。Bougadi等[111]從基于特異性DNA探針-AuNPs建立了乳源（奶牛、綿羊、山羊）檢測(cè)的LFAs，檢測(cè)能力比其他方法高10 倍，還可用于肉類、橄欖油和豆類等其他摻假食品的檢測(cè)。Jin等[115]基于比率熒光探針設(shè)計(jì)了三磷酸腺苷的可逆識(shí)別試紙；Liu等[112]建立了由μPAD和微型盒組成的甲醛檢測(cè)系統(tǒng)，為食品包裝的安全性提供了快速的紙基檢測(cè)方法。

3 結(jié)語

“紙上微型實(shí)驗(yàn)室”為食品檢測(cè)建立了便捷、靈敏、經(jīng)濟(jì)的新平臺(tái)。不可否認(rèn)，紙基分析方法仍存在靈敏度較低、易受污染、穩(wěn)定性較差等局限性，只能作為快速篩選的手段而不能作為最終診斷的依據(jù)。因此，兼具快速和準(zhǔn)確兩大優(yōu)點(diǎn)是“紙上微型實(shí)驗(yàn)室”追求的目標(biāo)，基于此目標(biāo)，眾多改進(jìn)方法有待發(fā)掘：1）選擇更高效的樣品預(yù)處理方法或增添過濾和濃縮組件，以縮短檢測(cè)耗時(shí)；2）開發(fā)更好的顯信號(hào)方法和專門的閱讀分析儀器，以提高檢測(cè)靈敏度；3）將纖維素紙與新興材料結(jié)合、拓展紙基分析裝置的新結(jié)構(gòu)，以最大化發(fā)揮紙基便攜、快速的優(yōu)勢(shì)。綜上，“紙上微型實(shí)驗(yàn)室”正順應(yīng)現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)捷化、高通量化、多功能化的趨勢(shì)迅猛發(fā)展，可為資源匱乏地區(qū)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供簡(jiǎn)便工具，并為食品檢測(cè)提供安全、可靠的技術(shù)平臺(tái)。