CaCl2電解水處理提高綠豆芽品質(zhì)及其機(jī)理

張馨丹，李 翠，薛文通，劉海杰*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

綠豆富含多種營養(yǎng)活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類、氨基酸、酚類、礦質(zhì)元素等[1]。綠豆發(fā)芽后得到綠豆芽，大量研究已經(jīng)證明綠豆經(jīng)過萌發(fā)后，其VC、酚類物質(zhì)、膳食纖維、γ-氨基丁酸、礦質(zhì)元素等的含量大幅度提高，同時植酸、蛋白酶抑制劑等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)含量明顯降低[2-4]。我國綠豆芽消費(fèi)需求量巨大，據(jù)估算，每人年消費(fèi)芽菜18.25 kg（每人每天 50 g），按全國14億人口計，芽菜年需求量達(dá)2 555萬 t[5]。然而，由于其含水量高，質(zhì)地脆弱極易受到損傷而引起品質(zhì)劣變，從而影響貨架期。在常溫下一般只可保存1～2 d，在低溫冷藏條件下也只有3～5 d，生產(chǎn)和銷售受到一定制約[6]。

電解水是在電解槽中通過電解含有稀鹽酸（HCl）或食鹽（NaCl）的溶液而得到的，在食品工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用[7]。其不僅可以實現(xiàn)對果蔬的消毒殺菌[8]、促進(jìn)活性成分積累[9]，同時大量的研究表明電解水可以通過抑制褐變、降低呼吸強(qiáng)度和乙烯產(chǎn)生、抑制細(xì)胞壁降解、清除活性氧積累等實現(xiàn)對果蔬的采后保鮮[10]。鈣作為植物生長重要的信號分子和調(diào)節(jié)物質(zhì)，其可以維持細(xì)胞膜的完整性，增強(qiáng)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及與細(xì)胞間的黏結(jié)作用，調(diào)節(jié)體內(nèi)各種酶的代謝過程及活性等達(dá)到延緩衰老、維持果蔬品質(zhì)的目的[11]，其中氯化鈣（CaCl2）是果蔬保鮮常用的鈣鹽。綠豆芽不僅保鮮期短，同時已被確定為食源性疾病發(fā)生的一個重要風(fēng)險因素[12]，因此需要采取一定的處理手段來延長貨架期、提高食用安全性。目前關(guān)于CaCl2電解水（CaCl2electrolyzed water，CEW）應(yīng)用的相關(guān)報道還比較少。因此，本研究探討CEW處理對綠豆芽采收后貯藏期間品質(zhì)的影響，并對作用機(jī)理進(jìn)行探討，旨在為綠豆芽的貯藏保鮮提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用的綠豆品種‘草原巨峰’綠豆購自北京市海淀區(qū)圣熙8號美廉美超市。

三氯乙酸、硫代巴比妥酸、碘化鉀、鄰苯二酚、硼酸、四硼酸鈉、無水碳酸鈉 上海麥克林生化科技有限公司；無水碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林-酚、亞硝酸鈉、氯化鋁、愈創(chuàng)木酚、L-苯丙氨酸、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、TritonX-100 北京索萊寶科技有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WS150III恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海樹立儀器儀表有限公司；電解水生成器 實驗室自制；RC-3F有效氯測定儀 日本笠原理化工業(yè)株式會社；pH測定儀上海佑科儀器儀表有限公司公司；UV-1600紫外-可見分光光度計 日本島津公司；CT3質(zhì)構(gòu)儀 Brookfield（中國）有限公司；低場核磁共振成像儀 上海紐邁電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 綠豆芽生產(chǎn)與貯藏

CEW制備：首先配制25 mmol/L的CaCl2溶液，在電解之前用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為4.4±0.05，之后倒入無隔膜電解槽中，接通電源，以恒定電流3.0 A電解，通過調(diào)節(jié)電解時間，控制電解水有效氯濃度為10 mg/L（用有效氯測定儀測定）。之后再次用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5.50±0.05，得到CaCl2電解水，記作25CaE10。

綠豆萌發(fā)：挑選籽粒飽滿、無蟲害的綠豆種子，自來水沖洗干凈，用5 倍籽粒體積的CEW于室溫黑暗條件下浸種5 h，自來水組作為對照。浸種完畢后，將種子單層平鋪于覆有紗布的發(fā)芽盒中，置于25 ℃、相對濕度85%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，期間每天噴淋3 次保持種子濕潤，具體流程如圖1所示。4 d后收獲豆芽，瀝干表面水分，裝入保鮮袋中4 ℃低溫貯藏，并于貯藏第0、1、3、5天取綠豆芽鮮樣測定采后各生理指標(biāo)。

圖1 CEW處理生產(chǎn)綠豆芽示意圖Fig.1 Schematic diagram of the application of CEW processing to produce mung bean sprouts

1.3.2 綠豆芽指標(biāo)測定

1.3.2.1 綠豆芽質(zhì)量損失率的測定

在貯藏前測定每份綠豆芽的質(zhì)量，在貯藏過程中取樣時再次測定每份綠豆芽的質(zhì)量。結(jié)果取3 次測量的平均值。質(zhì)量損失率計算公式如下。

1.3.2.2 綠豆芽相對電導(dǎo)率的測定

參照Wang Lei等[13]的方法測定，采用簡易浸泡法。

1.3.2.3 綠豆芽硬度、脆度的測定

采用CT3質(zhì)構(gòu)儀測定綠豆芽下胚軸的硬度及脆度，利用標(biāo)準(zhǔn)探頭TA44（4 mm DIAM、35 mm LONG）進(jìn)行50%形變壓縮實驗。探頭速率為0.5 mm/s，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載6.8 g。測定部位為距下胚軸基部2 cm處。

1.3.2.4 綠豆芽菌落總數(shù)的測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[14]測定綠豆芽菌落總數(shù)。

1.3.2.5 綠豆芽丙二醛、過氧化氫含量的測定

采用硫代巴比妥酸法[15]測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；采用碘化鉀法[15]測定過氧化氫（H2O2）含量。

1.3.2.6 綠豆芽總酚含量的測定

采用福林-酚法[16]測定總酚含量，結(jié)果以每克樣品所含沒食子酸質(zhì)量計，單位為mg/gmf。

1.3.2.7 綠豆芽褐變指數(shù)的測定

參照Sikora等[17]的方法測定綠豆芽褐變指數(shù)。取綠豆芽鮮樣，黑暗放置5 min，充分吸凈表面水分。取下胚軸中段2 g，加入8 mL蒸餾水，冰浴研磨成勻漿，4 ℃、6 000 r/min離心15 min后取上清測定波長420 nm下的吸光度，最終以10×OD420nm表示褐變指數(shù)。

1.3.2.8 綠豆芽水分狀態(tài)的測定

利用低場核磁共振儀分析軟件中的FID脈沖序列尋找磁場的中心頻率及硬脈沖寬，利用硬脈沖回波序列CPMG采集不同貯藏時間綠豆芽的橫向弛豫時間T2圖譜。測定參數(shù)為：時間點(diǎn)數(shù)據(jù)722 434、射頻延時0.08 ms、模擬增益20 db、重復(fù)采樣等待時間5 000 ms、回波時間0.3 ms、回波個數(shù)1 2000和重復(fù)采樣次數(shù)16。將采集生成的自旋回波信號導(dǎo)入核磁共振反演擬合軟件各自反演，反演方法為SIRT。

1.3.2.9 綠豆芽褐變相關(guān)酶活力的測定

采用鄰苯二酚法[18]測定多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力；采用愈創(chuàng)木酚法[15]測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活力；參照張禮良等[19]的方法測定苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均進(jìn)行3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，利用Excel軟件分析數(shù)據(jù)，SPSS 26軟件進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncan多重比較分析數(shù)據(jù)顯著性差異，顯著水平為P＜0.05，使用Origin和Excel軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏過程中綠豆芽質(zhì)量損失率、相對電導(dǎo)率以及代謝物MDA、H2O2含量的變化

從圖2可以看出，在貯藏過程中，自來水對照組和25CaE10處理組綠豆芽的質(zhì)量損失率、相對電導(dǎo)率、MDA以及H2O2含量變化趨勢一致，均表現(xiàn)為逐漸增加，除了貯藏1 d時的質(zhì)量損失率，25CaE10處理組的其余相關(guān)指標(biāo)數(shù)值始終低于對照組。在貯藏1 d時，綠豆芽均還處于較新鮮的狀態(tài)，失水較少，細(xì)胞膜較完整，H2O2還未開始積累，氧化損傷較輕；貯藏3 d時，質(zhì)量損失率、相對電導(dǎo)率、MDA含量以及H2O2含量均有所提高，其中，質(zhì)量損失率有較為明顯的提高，但處理組與對照組之間不存在顯著差異（P＞0.05）；貯藏5 d時，對照組與處理組的各指標(biāo)數(shù)值進(jìn)一步增加，其中，對照組的質(zhì)量損失率由8.59%升高到20.66%，增加約1.41 倍，水分流失嚴(yán)重，而25CaE10處理組質(zhì)量損失率（10.36%）明顯低于自來水對照組，降低了約49.9%，并且存在顯著差異（P＜0.05）；而貯藏5 d時對照組、25CaE10處理組的相對電導(dǎo)率分別為26.64%、22.24%，降低約16.5%；同時，25CaE10處理組的MDA、H2O2含量分別為2.243 nmol/gmf、192.176 nmol/gmf，相比對照組分別降低約27.5%、36.8%。說明CEW處理一定程度上抑制了綠豆芽的蒸騰失水，維持了綠豆芽細(xì)胞膜的完整性，減少內(nèi)容物的流失，抑制MDA、H2O2含量的升高，減少積累，延緩細(xì)胞膜脂過氧化的速度。

圖2 CEW處理對綠豆芽貯藏過程中質(zhì)量損失率（A）、相對電導(dǎo)率（B）、MDA含量（C）、H2O2含量（D）的影響Fig.2 Effects of CEW treatment on mass loss percentage (A),relative conductivity (B),MDA content (C) and H2O2 content (D) of mung bean sprouts during storage

2.2 CEW處理對綠豆芽采后低溫貯藏水分狀態(tài)的影響

水分的自由度隨T2弛豫時間的變化而不同，T2越短說明水分和物質(zhì)的結(jié)合程度越高，反之越低。從圖3可以看出，綠豆芽的T2圖譜大致有4 個峰，分別代表不同狀態(tài)水分的分布情況，根據(jù)弛豫時間T2，將其劃分為結(jié)合水（T210.1～10 ms）、不易流動水（T2210～100 ms）、自由水（T23100～1 000 ms）3 種，水分狀態(tài)與王娟等[20]關(guān)于靈武長棗的檢測結(jié)果基本一致。以峰面積A21表示結(jié)合水含量，A22表示不易流動水含量，A23表示自由水含量，三者之和A表示總水分含量，結(jié)果如表1所示。

圖3 綠豆芽貯藏3 d時的橫向弛豫時間（T2）圖譜Fig.3 Transverse relaxation time (T2) spectra of mung bean sprouts stored for three days

表1 綠豆芽貯藏過程中不同狀態(tài)水的峰面積變化Table 1 Changes in the peak area of water in different states in mung bean sprouts during storage

從表1可以看出，綠豆芽中的水分主要以自由水的形態(tài)存在，其次是不易流動水，結(jié)合水含量最少。在貯藏過程中，對照組與25CaE10處理組綠豆芽的總水分含量A和不易流動水含量A22、自由水含量A23變化趨勢相同，均表現(xiàn)為不斷降低，說明貯藏期間綠豆芽水分不斷流失，其中不易流動水、自由水散失嚴(yán)重；結(jié)合水含量A21基本保持穩(wěn)定，不易散失。此外，在貯藏1、3、5 d時，25CaE10處理組的總水分含量A和自由水含量A23均顯著低于對照組（P＜0.05），不易流動水含量A22和結(jié)合水含量A21略高于對照組，差異不顯著（P＞0.05），說明CEW處理因為鈣離子的引入，一定程度上對水分狀態(tài)產(chǎn)生影響。同時，進(jìn)一步分析實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)25CaE10處理組總水分含量下降速率較慢，推測較好的保水性可能也是其貯藏效果最佳的原因之一。

2.3 CEW處理對綠豆芽貯藏期間質(zhì)構(gòu)特性的影響

從圖4可以看出，在貯藏過程中，對照組和25CaE10處理組綠豆芽的硬度、脆度均表現(xiàn)為逐漸降低的趨勢，25CaE10處理組的硬度、脆度始終高于對照組。貯藏0 d時，25CaE10處理組與對照組硬度存在顯著差異（P＜0.05），在貯藏第1、3、5天時，相比于前一個采樣時間點(diǎn)，自來水組的硬度下降率分別為2.05%、4.05%、15.11%，而25CaE10處理組為5.65%、0.93%、4.93%，說明CEW處理可以延緩綠豆芽的軟化；貯藏5 d時，對照組綠豆芽的硬度與0 d相比顯著降低（P＜0.05），為355.67 g，而25CaE10組的硬度為456.33 g，約為對照組的1.28 倍。脆度的變化趨勢與硬度相似，隨著貯藏時間的延長，脆度變化較為緩慢，處理組與對照組之間存在顯著差異（P＜0.05）。在貯藏過程中，相比于前一個采樣時間點(diǎn)，對照組的脆度下降率分別為5.44%、9.48%、5.42%，而25CaE10處理組分別為1.59%、6.20%、3.78%；貯藏5 d時，處理組脆度仍然可達(dá)529.67 g，約是對照組的1.21 倍。說明CEW處理一定程度上可以有效延緩綠豆芽硬度以及脆度的下降，保持質(zhì)地和口感。

圖4 CEW處理對綠豆芽貯藏過程中硬度（A）、脆度（B）的影響Fig.4 Effects of CEW treatment on hardness (A) and brittleness (B) of mung bean sprouts during storage

2.4 綠豆芽貯藏過程中微生物數(shù)量的變化

從圖5可以看出，在低溫貯藏過程中，對照組和25CaE10處理組綠豆芽的菌落總數(shù)均表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢，貯藏0 d即綠豆芽采收時，處理組的菌落總數(shù)顯著低于對照組，貯藏過程中，25CaE10處理組的菌落總數(shù)始終低于對照組（P＜0.05）。同時，在貯藏期間，25CaE10處理組的菌落總數(shù)與對照組之間始終存在顯著差異（P＜0.05），貯藏1、3、5 d 時，其菌落總數(shù)對數(shù)值較對照組分別降低約1.08、1.09、0.71（lg（CFU/g））。說明CEW處理可以有效減少菌落總數(shù)，抑制微生物生長，這也為延長綠豆芽貨架期和提高豆芽品質(zhì)提供了有力保障。

圖5 CEW處理對綠豆芽貯藏過程中菌落總數(shù)的影響Fig.5 Effects of CEW treatment on total bacterial count in mung bean sprouts during storage

2.5 CEW處理對綠豆芽采后低溫貯藏過程中褐變的影響

貯藏期間綠豆芽的外觀以及褐變情況如圖6所示。對照組綠豆芽在貯藏3 d時已有較為明顯的失水皺縮和褐變現(xiàn)象，貯藏5 d時品質(zhì)劣變現(xiàn)象加重，而25CaE10處理組狀況良好。從圖6B可以看出，在貯藏過程中，對照組和25CaE10處理組綠豆芽的褐變指數(shù)均表現(xiàn)為逐漸增加的變化趨勢，25CaE10處理組的褐變指數(shù)始終顯著低于對照組（P＜0.05），并且隨著貯藏時間的延長，差異逐漸明顯；貯藏3 d時，對照組綠豆芽的褐變指數(shù)明顯增加，從貯藏1 d時的3.25增加到貯藏3 d時的4.90，而處理組的褐變指數(shù)增加緩慢，貯藏3 d時為3.14，相比對照組降低約35.9%；貯藏5 d時，處理組褐變指數(shù)為3.51，相比對照組降低了約33.9%。由此可見，CEW處理一定程度上可以抑制綠豆芽的褐變，延緩品質(zhì)劣變。

圖6 綠豆芽貯藏過程中外觀（A）及褐變指數(shù)（B）的變化Fig.6 Changes in visual appearance (A) and browning index (B) of mung bean sprouts during storage

2.6 CEW處理對綠豆芽貯藏過程中總酚及褐變相關(guān)酶的抑制作用

如圖7A所示，兩組總酚含量均隨著貯藏時間的延長略有增加，但25CaE10處理組的總酚含量始終顯著低于對照組（P＜0.05），在貯藏3 d和5 d時，其總酚含量分別為0.864、1.026 mg/gmf，相較對照組分別降低約25.8%、19.8%。酚類物質(zhì)作為酶促褐變的重要底物，其含量的降低有利于控制酶促褐變，進(jìn)一步說明CEW處理可在一定程度上抑制綠豆芽褐變。

圖7 CEW處理對綠豆芽貯藏過程中總酚含量（A）及PPO（B）、POD（C）、PAL（D）活力的影響Fig.7 Effects of CEW treatment on total phenol content (A) and PPO (B),POD (C) and PAL (D) activity of mung bean sprouts during storage

從圖7B～D可以看出，在低溫貯藏前期，對照組和25CaE10處理組綠豆芽的PPO、POD、PAL活力變化趨勢一致，均表現(xiàn)為貯藏前期逐漸增加，貯藏第5天時開始下降，25CaE10處理組相關(guān)酶活力始終顯著低于對照組（P＜0.05）。貯藏1 d，各組別PPO活力緩慢增加，到貯藏3 d時，對照組綠豆芽的PPO活力大幅度提高，從貯藏1 d的525 U/（gmf·min）增加到1 200 U/（gmf·min），增加了約1.29 倍，而25CaE10處理組的PPO活力相對較低，只有350 U/（gmf·min），相比對照組活力降低了約70.8%。綠豆芽POD活力同樣在貯藏3 d快速增長，25CaE10處理組的POD活力仍低于對照組，其活力為965 U/（gmf·min），相比對照組的1 317.5 U/（gmf·min），降低了約26.8%。此外，在貯藏過程中，綠豆芽的PAL活力較高，在貯藏3 d時，對照組的PAL活力為138.45 U/（gmf·h），而25CaE10處理組的活力為122.55 U/（gmf·h），降低約11.5%。通過對綠豆芽的褐變指數(shù)以及褐變相關(guān)酶的測定發(fā)現(xiàn)，綠豆芽在貯藏3 d時出現(xiàn)明顯的褐變現(xiàn)象，CEW處理能夠很好地抑制褐變相關(guān)酶活力，延緩綠豆芽的褐變。

3 討論

果蔬在貯藏過程中，伴隨著水分散失、組織軟化、酶促褐變以及氧化損傷等導(dǎo)致品質(zhì)劣變的過程。綠豆芽含水量極高，水分是新鮮果蔬重要的組成部分，蒸騰作用是導(dǎo)致水分流失的重要原因[21]。鈣和電解水分別處理均能引起果蔬質(zhì)量損失率的降低，減少水分損失[22-23]，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CEW處理可降低綠豆芽的質(zhì)量損失率，同時核磁共振檢測水分狀態(tài)結(jié)果表明，CEW處理后水分狀態(tài)略有改變，結(jié)合水含量增加，導(dǎo)致水分不易散失。此外，貯藏期間的成熟軟化是一個復(fù)雜的過程，涉及到細(xì)胞壁降解、呼吸作用、能量代謝、微生物侵染、乙烯調(diào)控等[24]。其中，細(xì)胞壁主要物質(zhì)果膠和纖維素的降解是軟化的主要因素[25]，細(xì)胞壁降解酶在其中發(fā)揮了主要的作用。鈣和電解水處理都能夠降低多聚半乳糖醛酸酶等細(xì)胞壁相關(guān)酶活力，抑制細(xì)胞壁成分分解[10,26]，同時鈣作為細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)物質(zhì)，還可與細(xì)胞壁中的果膠結(jié)合形成果膠酸鈣，進(jìn)一步維持細(xì)胞壁強(qiáng)度，保持硬度[27]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CEW能夠抑制綠豆芽的硬度降低，同時保持一定的脆度，推測機(jī)理與抑制各種細(xì)胞壁降解酶活力相關(guān)。

綠豆芽極易發(fā)生酶促褐變，褐變不僅影響產(chǎn)品外觀還會影響食用品質(zhì)。酶促褐變發(fā)生的三大必要條件包括氧氣、PPO以及酚類底物。正常細(xì)胞中PPO與酚類物質(zhì)是分離的，因此不易發(fā)生褐變，而當(dāng)細(xì)胞膜受損后，二者相互接觸，PPO被激活，催化酚類物質(zhì)氧化聚合從而引起褐變[31]。因此，褐變的發(fā)生與細(xì)胞膜的完整性、總酚含量、PPO、POD、PAL等酶活力、ROS代謝等密切相關(guān)[31-32]。本研究結(jié)果表明，CEW處理可降低綠豆芽在貯藏過程中的褐變指數(shù)和總酚含量，同時抑制PPO、POD、PAL活力，配合相對電導(dǎo)率、MDA含量和H2O2含量的下降，從而有效緩解褐變。此外，綜合分析褐變相關(guān)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)綠豆芽的褐變主要發(fā)生在貯藏3 d時，在此階段施加干預(yù)，可以很好地抑制褐變現(xiàn)象。綜上所述，CaCl2電解水處理對綠豆芽的采后低溫貯藏保鮮具有一定的積極意義。

4 結(jié)論

利用含25 mmol/L CaCl2的電解水浸泡、噴淋綠豆萌發(fā)得到豆芽后，能夠減少貯藏過程中綠豆芽的水分散失，增加結(jié)合水含量，保持硬度和脆度，降低表面微生物數(shù)量，維持細(xì)胞膜的完整性，減少代謝物MDA以及H2O2的積累，同時還可顯著抑制褐變現(xiàn)象，降低酶促褐變底物酚類物質(zhì)的含量以及褐變相關(guān)酶PPO、POD、PAL活力，延緩了品質(zhì)劣變，對綠豆芽起到一定的保鮮效果。