納米二氧化鈦對(duì)小鼠亞慢性暴露的腸道微生物組和代謝組關(guān)聯(lián)分析

趙化冰，楊 晨，?；勖簦锋面?，張冰潔，譚有蘭，李鳳珠，王洪彬，路福平,*

（1.天津科技大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津科技大學(xué) 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

二氧化鈦（TiO2）因具有高折射率和自然白色，常被作為食品著色劑和風(fēng)味增強(qiáng)劑添加至糖果、奶制品、醬料、干蔬菜、堅(jiān)果、種子、湯、芥末、啤酒以及葡萄酒中[1]。我國(guó)對(duì)于食品中TiO2的最大使用量有著嚴(yán)格的規(guī)定（0.05%～1%）[2]。2012年，Weir等研究發(fā)現(xiàn)，糖果等含有較高劑量TiO2的食品中，其中約1/3的TiO2粒徑屬于納米級(jí)別[3]。此外，納米TiO2因其優(yōu)良的抗菌活性也常被應(yīng)用于食品包裝領(lǐng)域[4]。隨著納米TiO2應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注納米TiO2對(duì)人體的潛在危害。

納米TiO2經(jīng)口攝入后直接接觸腸道，對(duì)其造成的影響不容小覷。國(guó)內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)納米TiO2對(duì)腸道微生物組成及多樣性產(chǎn)生較大影響[5-7]。目前對(duì)于這種變化的機(jī)制尚不清楚，糞便代謝物可能是影響腸道微生物的關(guān)鍵因素[8]?；诖耍狙芯坎捎梦⑸锝M學(xué)-代謝組學(xué)技術(shù)，分析納米TiO2干預(yù)后小鼠菌群結(jié)構(gòu)和整體代謝變化規(guī)律，探討納米TiO2對(duì)小鼠腸道微生物影響的作用機(jī)制，為納米材料的生物安全性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)別C57BL/6J健康小鼠，雄性，3 周齡，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境為天津杰柯遜生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供的SPF級(jí)動(dòng)物屏障系統(tǒng)。

納米TiO2（純度高于99%） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；血脂相關(guān)測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程公司研究所；4%多聚甲醛 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；等離子電感耦合質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Scientific Forma公司；微波消解儀 奧地利安東帕公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；渦旋振蕩器 美國(guó)Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立與分組

C57BL/6J小鼠在環(huán)境適應(yīng)1 周后，被隨機(jī)分為兩組，每組7 只。適應(yīng)性飼喂1 周后，對(duì)照組每天灌胃給予磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），實(shí)驗(yàn)組按照100 mg/（kgmb·d）[9]劑量灌胃納米TiO2，將納米TiO2分散在20 mL PBS中，灌胃體積為0.2 mL，灌胃前用超聲波細(xì)胞破碎儀超聲處理20 min，使其均勻化。灌胃13 周后，以頸椎脫位的方式處死小鼠。

1.3.2 臟器指數(shù)的計(jì)算

處死小鼠后，取出完整心臟、肝臟、脾臟、腎臟等器官，將其用生理鹽水漂洗后用濾紙擦干，稱質(zhì)量，并按下式計(jì)算臟器指數(shù)。

1.3.3 血清脂質(zhì)的測(cè)定

甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平的測(cè)定均依照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3.4 血清細(xì)胞因子的測(cè)定

白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）水平均使用相應(yīng)ELISA試劑盒檢測(cè)。

1.3.5 小鼠糞便中Ti含量的測(cè)定

對(duì)小鼠處死前收集的糞便樣品進(jìn)行Ti含量的測(cè)定。稱量100 mg上述糞便樣品于特氟隆微波消化容器中，加入8 mL體積分?jǐn)?shù)68% HNO3溶液和2 mL體積分?jǐn)?shù)30%H2O2溶液，使用微波消解儀使之完全消解。冷卻后，將消化液轉(zhuǎn)移至試管中，稀釋至50 mL用于后續(xù)含量檢測(cè)。使用等離子電感耦合質(zhì)譜測(cè)定樣品中的Ti含量，以銦（20 ng/mL）作為內(nèi)標(biāo)元素。檢測(cè)限為0.076 ng/mL。

1.3.6 小鼠腸道內(nèi)容物的菌群分析

處死小鼠前，采用無(wú)菌EP管收集小鼠糞便，送至深圳華大基因有限公司進(jìn)行基因擴(kuò)增、腸道菌群16S rDNA高通量測(cè)序。

1.3.7 小鼠糞便代謝物的非靶向代謝分析

用電子天平稱取40 mg小鼠糞便，加入0.5 mL冷卻的體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液，其中含有0.6 μg/mL核糖醇作為內(nèi)標(biāo)。使用帶有珠子的Precelly 24生物樣品均質(zhì)器，將糞便進(jìn)行均質(zhì)化（每20 s中斷10 s），重復(fù)3 個(gè)循環(huán)。隨后13 500 r/min、4 ℃離心15 min，取300 μL上清液在氮?dú)庀赂稍?。干燥后，?0 μL新鮮制備的鹽酸甲氧基胺（含20 mg/mL吡啶）加入干燥的樣品中，并于60 ℃孵育30 min。加入30 μLN-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺（含體積分?jǐn)?shù)1%三甲基氯硅烷），60 ℃孵育30 min。樣本制備好后進(jìn)行上機(jī)分析。

氣相色譜-質(zhì)譜條件：色譜柱HP-5 MS（60 m×0.32 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣量：1 μL，不分流；進(jìn)氣溫度：250 ℃；溫度程序：50 ℃維持2 min，10 ℃/min升到250 ℃，維持15 min，再以10 ℃/min升到320 ℃，維持10 min；載氣：氦氣，1 mL/min恒流；傳輸線溫度：280 ℃。離子源：電子轟擊電離源；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；掃描范圍：50～700m/z。

采用MassHunter定量分析軟件包（B.08）的未知物分析（Quant-My-Way）功能對(duì)氣相色譜-質(zhì)譜的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和進(jìn)一步鑒定。代謝物通過(guò)NIST17質(zhì)譜庫(kù)鑒定，后執(zhí)行腳本AllBestHits.Unknows.script，導(dǎo)出cef格式文件進(jìn)行下一步分析。代謝物差異分析采用Metaboanalyst 5.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.metaboanalyst.ca/）進(jìn)行分析，通過(guò)總和進(jìn)行樣本歸一化，峰面積采用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，為滿足方差齊性條件，數(shù)據(jù)縮放方式優(yōu)先采用帕累托比例法。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。根據(jù)數(shù)據(jù)情況，采用不假定等方差的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。腸道代謝物和微生物區(qū)系之間的Spearman’s相關(guān)性和熱圖使用R語(yǔ)言（4.0.5版本）的psych軟件包（https://CRAN.R-project.org/package=psych）進(jìn)行計(jì)算和繪制。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米TiO2對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

機(jī)體各項(xiàng)功能運(yùn)轉(zhuǎn)正常時(shí)臟器指數(shù)較恒定。臟器指數(shù)增大，提示臟器可能發(fā)生充血、水腫或者增生等現(xiàn)象；臟器指數(shù)減小，則提示可能發(fā)生臟器萎縮或者其他病理學(xué)的改變。由表1可知，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠心、肝、脾、肺和腎的臟器指數(shù)之間差異不顯著，表明在現(xiàn)有劑量下口服納米TiO2顆粒13 周還不足以引起小鼠的器官損傷，但是不能排除器官功能的受損。之前相關(guān)的研究中同樣發(fā)現(xiàn)了臟器指數(shù)未發(fā)生變化但器官功能受損的現(xiàn)象[10-11]。這可能是暴露方式、劑量不同以及材料本身等差異造成的。

表1 納米TiO2對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of nano-TiO2 on organ coefficients in mice

2.2 納米TiO2對(duì)小鼠血脂和血糖水平的影響

納米TiO2可引起大鼠孕期腸道菌群的改變，使孕鼠空腹血糖水平升高，可能增加孕期婦女患妊娠期糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[12]。如圖1所示，攝入納米TiO2的小鼠血糖濃度顯著升高（P＝0.032），但對(duì)小鼠血脂四項(xiàng)未見(jiàn)顯著影響。血糖水平異常的原因一方面可能是納米TiO2破壞了小腸絨毛結(jié)構(gòu)，減少葡萄糖吸收表面積，從而增加了肝臟血糖攝取、利用和貯存水平；另一方面納米TiO2引起了小鼠肝臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和ROS的生成量增加，致使胰島素抵抗，從而導(dǎo)致血糖代謝紊亂[13-15]。

圖1 納米TiO2對(duì)小鼠血脂和血糖水平的影響Fig.1 Effect of nano-TiO2 on blood lipid and blood glucose levels

2.3 納米TiO2對(duì)小鼠細(xì)胞因子等指標(biāo)的影響

如圖2 所示，與對(duì)照組相比，納米Ti O2處理組的IL-6、IL-10、ROS、T-SOD水平并無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。但處理組小鼠血清中促炎細(xì)胞因子IL-6和ROS水平有上升趨勢(shì)，而抗炎細(xì)胞因子IL-10和T-SOD水平卻呈下降趨勢(shì)，均朝著對(duì)于機(jī)體不利的方向發(fā)展。納米TiO2毒性較弱，本研究設(shè)置的暴露劑量和時(shí)間內(nèi)并沒(méi)有對(duì)機(jī)體造成顯著損傷，但是仍然觀察到了損傷的趨勢(shì)。

圖2 納米TiO2對(duì)小鼠細(xì)胞因子、ROS水平及T-SOD的影響Fig.2 Effect of nano-TiO2 on cytokine levels,reactive oxygen species level and total superoxide dismutase activity

2.4 納米TiO2對(duì)小鼠腸道微生物的影響

糞便是納米TiO2的重要排出途徑之一，如圖3所示，實(shí)驗(yàn)組小鼠糞便中Ti含量顯著高于對(duì)照組（P＝0.013）。說(shuō)明納米TiO2存在與腸道微生物和糞便代謝物之間發(fā)生互相作用的可能。

圖3 納米TiO2對(duì)小鼠糞便中Ti含量的影響Fig.3 Effect of nano-TiO2 on Ti content in feces of mice

2.5 納米TiO2對(duì)小鼠腸道微生物的影響

如圖4 A 所示，在門水平上，除擬桿菌門（Bacteroides）和厚壁菌門（Firmicutes）外，變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和TM7菌門也是小鼠腸道中的高豐度類群。納米TiO2處理后，厚壁菌門在小鼠腸道中的占比與對(duì)照組相比顯著增加了49.91%。先前的研究表明，厚壁菌門與擬桿菌門的比值（Firmicutes/Bacteroides，F(xiàn)/B）在一定程度上隨著脂肪含量的增加而增加[16]。在本實(shí)驗(yàn)中由于厚壁菌門相對(duì)豐度的增加，F(xiàn)/B值也上升了75.4%，盡管該變化沒(méi)有顯著性（P＝0.083），但也提示了納米TiO2存在增加小鼠患代謝性疾病和肥胖的風(fēng)險(xiǎn)[17]。

如圖4B所示，在屬水平上，與對(duì)照組相比，別樣棒菌屬（Allobaculum）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）在納米TiO2干預(yù)后相對(duì)豐度顯著增加（P＜0.05）。Pinget等[18]同樣發(fā)現(xiàn)了別樣棒菌屬豐度增加的現(xiàn)象，別樣棒菌屬先前已被證明是一種對(duì)宿主飲食變化敏感的微生物屬，因此不難理解它在腸道中的波動(dòng)現(xiàn)象。而腸道中乳桿菌屬豐度的增加是納米TiO2引起的普遍現(xiàn)象[19-20]。攝入納米TiO2后乳桿菌屬豐度的增加極有可能與一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌格氏乳桿菌（Lactobacillus_gasseri）有關(guān)，其可產(chǎn)生過(guò)量的過(guò)氧化氫，引起腸道炎癥加重[21]。

圖4 納米TiO2對(duì)小鼠腸道微生物在不同水平的影響Fig.4 Effect of nano-TiO2 on intestinal microorganisms at different levels

2.6 納米TiO2對(duì)小鼠腸道代謝物的影響

2.6.1 對(duì)腸道非靶向代謝物的影響

通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對(duì)糞便進(jìn)行檢測(cè)，獲得了144 種代謝物。利用微陣列分析鑒定差異代謝物，如表2所示，與對(duì)照組相比，納米TiO2干預(yù)引發(fā)了糞便代謝物的廣泛變化，明顯增強(qiáng)了甘油酯類代謝、半乳糖代謝、色氨酸代謝相關(guān)代謝途徑的變化（圖5A）。腸道細(xì)菌進(jìn)行色氨酸代謝產(chǎn)生吲哚，隨后在肝臟中被吸收和代謝為循環(huán)尿毒癥毒素硫酸吲哚酚，對(duì)機(jī)體造成損傷[16]。此外，對(duì)小鼠影響最大的前25 種代謝物進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理（圖5B），可以看出，納米TiO2干預(yù)對(duì)糞便中的部分氨基酸和長(zhǎng)鏈脂肪酸穩(wěn)態(tài)造成了影響，部分氨基酸濃度和脂肪酸出現(xiàn)異常波動(dòng)。

圖5 納米TiO2對(duì)小鼠糞便代謝物的影響Fig.5 Effect of nano-TiO2 on fecal metabolites in mice

表2 小鼠糞便差異代謝物詳細(xì)信息Table 2 Detailed information of differential metabolites in mice feces

2.6.2 腸道微生物和糞便代謝物的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果

微生物和代謝物之間的相關(guān)性可能是由于微生物對(duì)代謝物的分解或代謝物對(duì)微生物生長(zhǎng)的刺激或抑制而產(chǎn)生。為了研究微生物組組成和糞便代謝之間的潛在依賴關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)計(jì)算了代謝物和微生物組變量的Spearman相關(guān)系數(shù)。如圖6所示，大多數(shù)改變的細(xì)菌與部分不同的代謝物有明顯的相關(guān)性（r＞±0.5，P＜0.05）。這些細(xì)菌主要屬于厚壁菌門（Ruminococcus（瘤胃球菌屬）、Oscillospira、Lactobacillus、Coprococcus）、變形菌門（Sutterella）和擬桿菌門（Bacteroides）。顯著相關(guān)的代謝物影響了脂質(zhì)代謝（甘油）、氨基酸代謝（尸胺、色氨酸）、碳水化合物代謝（D-半乳糖、甘油酸）、葉酸的生物合成（氨苯甲酸）。有趣的是，屬于厚壁菌門的細(xì)菌相對(duì)豐度都與代謝物水平呈負(fù)相關(guān)。例如，乳桿菌屬相對(duì)豐度與氨苯甲酸以及色氨酸水平都具有負(fù)相關(guān)性。相比之下，其他門類下的細(xì)菌相對(duì)豐度與代謝物水平均呈正相關(guān)?？梢钥闯?，納米TiO2造成的小鼠腸道微生物組和糞便代謝組紊亂是有規(guī)律可循的。

圖6 小鼠屬水平腸道微生物與顯著變化的糞便代謝物相關(guān)性Fig.6 Correlation of gut microbes at the genus level with significantly differential fecal metabolites

3 討論

本研究通過(guò)微生物組學(xué)和代謝組學(xué)兩種組學(xué)技術(shù)對(duì)納米TiO2進(jìn)行了安全性評(píng)價(jià)，有利于進(jìn)一步闡述納米TiO2對(duì)小鼠腸道共代謝機(jī)制產(chǎn)生的影響。

長(zhǎng)期高劑量地?cái)z入納米TiO2會(huì)引起部分組織內(nèi)Ti的蓄積，從而導(dǎo)致組織損傷[22-24]。同時(shí)，許多文獻(xiàn)報(bào)道納米TiO2在生物體內(nèi)引發(fā)毒性的主要原因是在體內(nèi)產(chǎn)生了自由基，引起活性氧的積累[25]。然而，本研究中實(shí)驗(yàn)組的血清IL-6、IL-10、ROS和T-SOD等參數(shù)與對(duì)照組相比并無(wú)顯著性差異，可能是在現(xiàn)有的暴露劑量和時(shí)間下，納米TiO2沒(méi)有對(duì)機(jī)體造成顯著性損傷。

大多數(shù)的納米TiO2經(jīng)過(guò)消化道通過(guò)糞便排泄到體外，并直接與腸道微生物接觸影響腸道微生物的區(qū)系結(jié)構(gòu)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，納米TiO2實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間部分腸道微生物豐度顯著不同，糞便代謝組的整體輪廓存在較明顯差異，區(qū)分度較高。通過(guò)微陣列分析鑒定出9 種差異代謝物，顯著影響了甘油酯類代謝、半乳糖代謝、色氨酸代謝3 條代謝途徑。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，9 種差異代謝物中尸胺和十五醇在實(shí)驗(yàn)組中上調(diào)，而絲氨酸、D-半乳糖、氨苯甲酸、甘油酸、甘油及色氨酸在實(shí)驗(yàn)組中下調(diào)。研究表明，糞便中較高的尸胺水平和較低的D-半乳糖、甘油、甘油酸水平與腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸病及克羅恩病等腸道疾病發(fā)病率呈正相關(guān)[27-28]。而十五醇作為脂肪醇的一種，被胃腸道吸收后具有降低低密度脂蛋白膽固醇含量、提高高密度脂蛋白膽固醇含量的作用，結(jié)合之前血脂及血糖測(cè)定結(jié)果，推測(cè)該指標(biāo)的上調(diào)可能是小鼠針對(duì)糖脂代謝異常的自身調(diào)節(jié)作用所致[29-30]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，糞便代謝物中部分氨基酸如絲氨酸、色氨酸等含量改變會(huì)影響腸-腦軸，患有自閉癥會(huì)導(dǎo)致上述氨基酸下調(diào)[31]。氨苯甲酸是某些細(xì)菌的必需營(yíng)養(yǎng)素，能夠刺激腸道細(xì)菌進(jìn)一步合成葉酸[32]。腸道菌群合成是獲取葉酸的重要途徑，實(shí)驗(yàn)組中氨苯甲酸水平下調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致小鼠葉酸缺乏，進(jìn)一步增加其他疾病患病概率[33-34]。這些差異代謝物除了參與上述3 種途徑，還參與脂質(zhì)代謝、碳水化合物代謝和氨基酸代謝。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了部分差異較大的糞便代謝物和腸道微生物的變化密切相關(guān)。腸道微生物對(duì)食物利用率的增加或減少是更復(fù)雜的宿主-微生物互相作用的結(jié)果。除了肝臟對(duì)過(guò)量葡萄糖攝取增加等原因外，糞便代謝物和腸道微生物的聯(lián)合變化可能是引起小鼠空腹血糖異常的主要原因。

本研究劑量下的納米TiO2能夠影響小鼠的腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)和糞便代謝表型，對(duì)脂質(zhì)代謝、碳水化合物代謝和氨基酸代謝途徑的糞便代謝物產(chǎn)生了顯著影響，進(jìn)一步可能導(dǎo)致小鼠空腹血糖、部分細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的異常。本研究只觀察了糞便的代謝組學(xué)特征，進(jìn)一步應(yīng)對(duì)血液、尿液以及各個(gè)臟器在不同周期的染毒樣本進(jìn)行聯(lián)合分析，從而更準(zhǔn)確得出納米TiO2的毒性作用機(jī)制。