刺梨多糖對非酒精性脂肪肝小鼠回腸黏膜屏障功能的影響

張 潘，汪 磊*，陳 潔，許 飛

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是最常見的慢性肝病，在世界范圍內(nèi)有很大一部分人患有這種疾病[1]。NAFLD是指在沒有過度飲酒或其他肝臟疾病（包括自身免疫性疾病、藥物誘發(fā)疾病或病毒性肝炎）的情況下，脂肪在肝細(xì)胞中積聚（5%以上肝細(xì)胞發(fā)生大泡性脂肪變性）[2]。目前，肥胖和糖尿病患者人數(shù)不斷增長，NAFLD的發(fā)病率也隨之增加。然而現(xiàn)在尚未明確NAFLD的發(fā)病機(jī)制，缺乏有效的防治方法。自Marshall教授首次提出了“腸-肝軸”的概念以后，肝臟疾病與腸道之間的緊密聯(lián)系已得到證實[3]。除了傳統(tǒng)的“二次打擊”學(xué)說，劉勤等[4]還提出了“多重打擊”學(xué)說，通過腸-肝軸，腸道微生物及其代謝產(chǎn)物可以進(jìn)入肝臟，參與NAFLD的發(fā)病機(jī)制。人體腸道菌群組成復(fù)雜，大約10萬億 種細(xì)菌存在于普通成年人的腸道中，是人體細(xì)胞數(shù)量的10 倍左右[5-6]。腸道菌群與機(jī)體處于平衡狀態(tài)，當(dāng)宿主或外界環(huán)境發(fā)生變化時，宿主與腸道菌群的平衡被破壞，導(dǎo)致腸道菌群紊亂，從而產(chǎn)生疾病。研究發(fā)現(xiàn)，將肥胖小鼠的糞便菌群移植到無菌小鼠體內(nèi)，會導(dǎo)致其腸道黏膜屏障功能破壞，肝臟脂肪含量以及體質(zhì)量增加，表明腸道菌群失調(diào)是導(dǎo)致NAFLD的重要原因[7-9]。

刺梨（RosaroxburghiiTratt）屬于薔薇科植物，是我國云貴和川西高原地區(qū)的一種重要野生資源。刺梨富含維生素，還含有抗癌物質(zhì)及抗衰老物質(zhì)，其營養(yǎng)價值和藥用價值極高。此外，刺梨含有多種生物活性成分，如有機(jī)酸、黃酮類化合物、多糖、三萜等，開發(fā)前景廣闊[10]。體外和體內(nèi)實驗表明，刺梨果實中的水溶性多糖（RosaroxburghiiTratt polysaccharide，RTFP）可以降低肥胖小鼠的體質(zhì)量，并具有降血糖、降血脂、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等有益的生物功效[11-12]。然而，目前關(guān)于RTFP通過調(diào)節(jié)NAFLD小鼠腸道菌群維持其腸道功能的機(jī)理尚未明確。

本實驗以正常飲食小鼠和NAFLD小鼠為研究對象，探究RTFP在正常飲食小鼠和NAFLD模型小鼠中對糞便菌群組成影響及回腸腸道黏膜屏障損傷的保護(hù)功效和分子機(jī)制，分析RTFP、基因調(diào)控及腸道黏膜屏障之間的關(guān)聯(lián)，以期為探索RTFP介導(dǎo)的改善NAFLD的潛在機(jī)制提供新見解。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

選取60 只雄性C57BL/6J小鼠進(jìn)行實驗（6 周齡，體質(zhì)量20～25 g）。實驗動物購買于浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0001。本研究動物實驗根據(jù)《中國實驗動物標(biāo)準(zhǔn)》并經(jīng)相關(guān)動物倫理委員會批準(zhǔn)，按照國際通行的指導(dǎo)方針和規(guī)程進(jìn)行。

刺梨 貴州綠源食品有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aminotransferase aspartate，AST/GOT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT/GPT）測試盒 南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測試試劑盒 上海星科生物科技有限公司；閉鎖小帶蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、Occludin和Claudin-1 美國Affinity Bioscience公司；TRIzol試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 上海東洋紡管理有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；飼料 無錫戴茨生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DW-40L188醫(yī)用低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；Epoch酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；LightCycler480熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 Hoffmann-La Roche有限責(zé)任公司；844-071-882 PCR儀 德國Biometra公司；Nanodrop-2000小分子蛋白核酸測定儀 賽默飛世爾科技公司；Tanon2500全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨多糖的制備

刺梨果實清洗干凈后，通過熱風(fēng)干燥和粉碎過篩，制得刺梨粉末。使用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液對刺梨粉末進(jìn)行脫色和脫脂處理，過濾后干燥，即制得刺梨干粉。按照料液比1∶30加入去離子水進(jìn)行水提，采用Sevag試劑脫蛋白，再使用AB-8大孔樹脂脫色，過濾后收集濾液進(jìn)行醇沉。醇沉后過濾，使沉淀溶于蒸餾水，進(jìn)行透析、減壓濃縮和真空干燥，即制得刺梨粗多糖RTFP。RTFP含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)63.79%碳水化合物、14.78%糖醛酸和4.10%蛋白質(zhì)。單糖測定結(jié)果表明，RTFP含有6 種單糖，包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖及巖藻糖，其物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)分別為33.80%、37.30%、20.70%、1.74%、3.43%和2.95%。此外，通過高效凝膠滲透色譜法測定RTFP含有兩個分子質(zhì)量分布不同的多糖，其平均分子質(zhì)量分別為513.02 kDa和1.32 kDa。

1.3.2 動物分組和給藥方法

將小鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下（（25±2）℃、相對濕度（60±5）%和12 h光/12 h暗循環(huán)），自由攝取食物和水。經(jīng)過一周適應(yīng)后，小鼠被隨機(jī)分成兩組，每組各30 只。一組被喂食正常飲食（對照組），另一組被喂食高脂肪飲食（模型組），構(gòu)建NAFLD模型，連續(xù)9 周。將兩組小鼠均隨機(jī)分為3 組，每組10 只，分別為對照組（CC組）、對照組＋低劑量（CLC組）、對照組＋高劑量（CHC組）、模型組（MC組）、模型組＋低劑量（MLC組）、模型組＋高劑量（MHC組）分組。CC組和MC組小鼠每日灌胃無菌生理鹽水（0.4 mL），對照組、模型組的低劑量組（CLC組和MLC組）和高劑量組（CHC組和MHC組）分別灌胃200、400 mg/（kg·d）RTFP，RTFP干預(yù)持續(xù)7 周。實驗期間，CC組和MC組小鼠分別飼喂普通飼料和高脂飼料，正常飲食和高脂肪飲食分別含有10%和60%的脂肪熱量。每周檢測并記錄小鼠的體質(zhì)量一次。實驗結(jié)束后，將小鼠麻醉，用頸椎脫位法處死小鼠，采集回腸組織、肝臟、糞便等，稱質(zhì)量，然后在液氮中快速冷凍，并在－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 回腸組織病理學(xué)檢測

回腸病理學(xué)組織切片和蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）按照Wang Lei等[12]所述方法進(jìn)行。使小鼠麻醉后，取其新鮮回腸組織。將新鮮收集的組織用生理鹽水清洗，立即用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，HE染色，觀察組織的病理切片結(jié)果。

1.3.4 回腸ZO-1、Occludin和Claudin-1mRNA相對表達(dá)量測定

使用TRIzol試劑盒從回腸組織中提取出RNA，測定其純度和濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板配制實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測反應(yīng)體系，混勻，10 000 r/min離心10 s，加入到熒光定量PCR板中，于熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，運(yùn)用2－ΔΔCt法算出相應(yīng)的Ct值，并計算各基因相對表達(dá)量。

1.3.5 生化指標(biāo)測定

回腸組織的炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α含量的測定按照酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書進(jìn)行操作?；啬c和肝臟組織的T-AOC和MDA含量、GSH-Px活力和T-SOD活力，以及肝臟中TG含量和TC含量、GPT活力和GOT活力測定均根據(jù)試劑盒說明書測定。勻漿蛋白含量測定均按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的說明書進(jìn)行實驗。

1.3.6 16S rRNA測序分析糞便菌群

使用糞便基因組DNA提取試劑盒提取糞便中的微生物總基因組DNA，利用Parse v.7.1將得到的序列以97%相似度聚類為操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用在線美吉生物云平臺進(jìn)行不同水平上的α多樣性、β多樣性、群落組成、Venn圖以及Heatmap圖相關(guān)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

實驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步匯總，用SPSS Statistics 21軟件進(jìn)行單因素方差分析，使用Duncan檢驗進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RTFP對小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響

肝臟是機(jī)體主要的代謝器官，可以分泌多種激素調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、炎癥以及脂質(zhì)代謝，與脂質(zhì)的消化、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、分解和合成代謝等過程密切相關(guān)。肝臟中TC、TG含量和GPT、GOT活力可以反映肝臟脂質(zhì)代謝和健康狀況。如圖1所示，與CC組相比，MC組的TC含量和TG含量、GPT活力和GOT活力顯著提高（P＜0.05），分別是CC組的1.22、1.12、1.25 倍和1.12 倍，表明高脂飲食使MC組小鼠出現(xiàn)脂質(zhì)代謝障礙和肝臟損傷。經(jīng)過7 周灌胃給藥處理后，各劑量對照組和各劑量模型組小鼠肝臟中TC、TG含量和GPT、GOT活力均與RTFP劑量呈負(fù)相關(guān)，與低劑量相比，高劑量RTFP產(chǎn)生的效果更加顯著（P＜0.05），其中MLC組和MHC組TG含量雖差異不顯著（P＞0.05），但是有降低趨勢。以上結(jié)果表明RTFP可以緩解肝臟脂質(zhì)代謝障礙和肝臟損傷。

圖1 RTFP對小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響Fig.1 Effects of RTFP on liver lipid metabolism in mice

2.2 刺梨多糖對小鼠肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

正常情況下，若人體內(nèi)自由基的產(chǎn)生量大于消除量，則會使自由基在體內(nèi)堆積，從而產(chǎn)生氧化損傷。如圖2所示，與CC組相比，MC組小鼠的T-AOC、T-SOD活力和GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05），表明HFD導(dǎo)致小鼠的抗氧化能力下降，氧化損傷程度升高。經(jīng)過RTFP灌胃處理后，隨著多糖劑量的增加，CC組和MC組內(nèi)小鼠的T-AOC、T-SOD活力和GSH-Px活力逐漸升高，MDA含量逐漸降低。其中，與CC組相比，CLC組小鼠的T-AOC、T-SOD活力和GSH-Px活力分別上調(diào)了6.18%、6.05%和12.29%，MDA含量降低了28.23%。與MC組相比，MLC組小鼠的T-AOC、T-SOD活力和GSH-Px活力分別上調(diào)了50.70%、21.16%和73.93%，MDA含量降低了41.02%。而與低劑量相比，高劑量RTFP治療效果更好。以上結(jié)果表明RTFP可以提高小鼠的抗氧化能力，逆轉(zhuǎn)NAFLD小鼠體內(nèi)的氧化損傷，這與文獻(xiàn)[13]報道的RTFP可以提高小鼠體內(nèi)的抗氧化能力的結(jié)果一致。

圖2 RTFP對小鼠肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of RTFP on liver oxidative stress in mice

2.3 RTFP對小鼠回腸結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響

2.3.1 RTFP對小鼠回腸長度的影響

能量攝入過多是肥胖發(fā)生的主要誘因，而小腸是能量物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體內(nèi)環(huán)境的通道和屏障[14-15]。如圖3所示，與CC組相比，MC組小鼠回腸長度縮短了29.92%，但RTFP治療緩解了回腸縮短，且高劑量的RTFP幾乎恢復(fù)了模型小鼠的回腸長度，是MC組的1.63 倍。以上結(jié)果表明RTFP對維持NAFLD小鼠腸道健康具有積極作用。

圖3 RTFP對小鼠回腸長度的影響Fig.3 Effect of RTFP on ileum length in mice

2.3.2 RTFP對小鼠回腸形態(tài)的影響

腸道學(xué)檢查結(jié)果（圖4）顯示，與CC組相比，MC組小鼠呈現(xiàn)明顯的空泡形態(tài)且絨毛結(jié)構(gòu)排列稀疏，有明顯脫落和斷裂的情況，炎癥細(xì)胞浸潤增強(qiáng)。但隨著RTFP劑量的增加，CC組和MC組回腸隱窩深度降低，黏膜除形成環(huán)狀襞外，絨毛結(jié)構(gòu)也趨于完整，雖然仍有小面積脫落，但是整體結(jié)構(gòu)密集，排列有序，使腸黏膜的表面積增加，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，表明補(bǔ)充RTFP可以改善隱窩病變和腸道結(jié)構(gòu)完整性。

圖4 小鼠回腸病理切片觀察結(jié)果（200×）Fig.4 Pathological observation of ileum in mice (200×)

2.3.3 RTFP對小鼠回腸ZO-1、Occludin和Claudin-1mRNA相對表達(dá)量的影響

完整的腸黏膜屏障對于維持宿主的生理屏障和先天免疫功能至關(guān)重要，在營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的上皮運(yùn)輸以及對穿透微生物群的防御中發(fā)揮重要作用[16]。腸上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)主要是由Claudins、ZO和Occludin等組成，可以有效阻止有害微生物的進(jìn)入，影響腸道的通透性[17]。如圖5所示，與CC組相比，MC組小鼠回腸Claudin-1和ZO-1mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），分別降低了60.71%和63.37%，然而經(jīng)過RTFP處理后，回腸Claudin-1和ZO-1mRNA相對表達(dá)量均有提高。此外，低劑量和高劑量的RTFP均能顯著提高CC組和MC組小鼠回腸OccludinmRNA相對表達(dá)量（P＜0.05）。結(jié)果表明，RTFP可以促進(jìn)緊密連接蛋白的表達(dá)，從而修復(fù)腸黏膜屏障損傷。

圖5 RTFP對小鼠回腸ZO-1（A）、Occludin（B）和Claudin-1（C）mRNA相對表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of RTFP on mRNA expression levels of ZO-1 (A),Occludin (B) and Claudin-1 (C) in ileum of mice

2.4 RTFP對小鼠回腸氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

如圖6所示，與CC組相比，MC組小鼠的T-AOC、T-SOD活力、GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05），而MDA含量顯著升高（P＜0.05），表明MC組小鼠的抗氧化能力下降，氧化損失程度升高。然而，經(jīng)過RTFP灌胃處理后，隨著多糖劑量的增加，CC組小鼠的T-AOC由10.15 U/mg逐漸升高到19.52 U/mg，T-SOD活力由145.40 U/mg逐漸升高到154.80 U/mg，GSH-Px活力由45.07 μmol/g逐漸升高到68.73 μmol/g，MDA含量由6.40 nmol/mg逐漸降低到5.16 nmol/mg。而MC組小鼠的T-AOC由8.29 U/mg逐漸升高到16.30 U/mg，T-SOD活力由133.16 U/mg逐漸升高到148.09 U/mg，GSH-Px活力由32.40 μmol/g逐漸升高到64.91 μmol/g，MDA含量由10.36 nmol/mg逐漸降低到6.42 nmol/mg。這表明RTFP可以提高小鼠的抗氧化能力，逆轉(zhuǎn)NAFLD小鼠體內(nèi)的氧化損傷，與上述RTFP可以提高小鼠肝臟組織的抗氧化能力的結(jié)果一致。

圖6 RTFP對小鼠回腸氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of RTFP on oxidative stress in ileum of mice

2.5 RTFP對小鼠回腸組織炎癥反應(yīng)的影響

慢性低級別炎癥是肥胖最重要的特征之一[18]。為了評估RTFP的抗炎作用，檢測了小鼠回腸組織中促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。如圖7所示，與CC組相比，高脂飲食可以顯著提高M(jìn)C組小鼠回腸組織中IL-6、IL-1β、TNF-α含量（P＜0.05），分別提高了7.82、3.64 倍及4.12 倍。經(jīng)過灌胃處理后，低劑量和高劑量的RTFP均能顯著降低MC組小鼠的IL-6、IL-1β和TNF-α含量（P＜0.05），但對CC組小鼠的IL-6、IL-1β含量和TNF-α含量無顯著影響（P＞0.05），這可能是由于CC組小鼠機(jī)體處于健康狀態(tài)，所以RTFP對正常飲食小鼠產(chǎn)生的效果不顯著，但可以緩解高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠腸道炎癥。這與Sang Tingting等[19]研究的靈芝破壁孢子多糖通過調(diào)節(jié)腸道微生物群抑制HFD誘導(dǎo)的炎癥的結(jié)果一致。

圖7 RTFP對小鼠回腸組織炎癥反應(yīng)的影響Fig.7 Effect of RTFP on inflammatory response in ileum of mice

2.6 RTFP對小鼠糞便菌群的影響

2.6.1 RTFP對小鼠糞便菌群α多樣性的影響

2.6.1.1 稀釋性曲線和Shannon指數(shù)曲線

選擇97%相似度的OTU水平構(gòu)建可以衡量物種豐富度和多樣性的稀釋性曲線和Shannon指數(shù)曲線。如圖8所示，隨測序數(shù)量的增加，稀釋曲線和Shannon指數(shù)曲線趨向平滑，表明測序數(shù)據(jù)量合理，測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息[20]。

圖8 各樣本稀釋性曲線（A）和Shannon指數(shù)曲線（B）Fig.8 Rarefaction curves (A) and Shannon index curves (B) of different samples

2.6.1.2 菌群多樣性分析

α多樣性指數(shù)中Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可估算樣本中微生物多樣性，Ace指數(shù)和Chao指數(shù)用來估計樣本物種豐度，Coverage指數(shù)則反映本次測序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實情況。如表1所示，與CC組相比，MC組Shannon指數(shù)顯著降低（P＜0.05），Simpson指數(shù)升高，Ace指數(shù)和Chao指數(shù)顯著降低（P＜0.05），表明高脂飲食導(dǎo)致小鼠糞便群落多樣性和豐度降低，破壞菌群平衡。經(jīng)過RTFP灌胃處理后，對照組和模型組內(nèi)Shannon、Simpson等指數(shù)雖無顯著變化（P＞0.05），但是組內(nèi)Shannon指數(shù)呈升高趨勢、Simpson指數(shù)呈降低趨勢以及Ace指數(shù)和Chao指數(shù)與多糖呈劑量依賴式增長。此外，各組Coverage指數(shù)均高于0.99，表明樣本中物種基本被檢出，進(jìn)一步驗證測序數(shù)充分。以上結(jié)果表明RTFP在一定程度上可以調(diào)節(jié)腸道菌群，增加物種多樣性。

表1 不同處理組糞便菌群的α多樣性分析結(jié)果Table 1 α-Diversity analysis of fecal flora in different treatment groups of mice

2.6.2 RTFP對小鼠糞便菌群β多樣性的影響

通過β多樣性分析，可研究不同樣品間群落結(jié)構(gòu)的相似性[21]。如圖9A所示，在Bray-Curtis距離矩陣上進(jìn)行β多樣性分析，發(fā)現(xiàn)MC組和CC組在OTU水平上的層次聚類樹存在明顯差異。主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）結(jié)果顯示，MC、MLC組和MHC組之間的菌群分離具有統(tǒng)計學(xué)意義；部分CLC組和CHC組樣本與CC組無明顯差異，與RTFP在正常小鼠中產(chǎn)生的溫和效應(yīng)一致（圖9B）。主成分分析（principal component analysis，PCA）結(jié)果顯示，每個組的微生物群落組成具有明顯的聚類。PC1表現(xiàn)出28.04%變異，這主要反映了正常飲食和高脂飲食對腸道菌群結(jié)構(gòu)變化的影響。PC2顯示總方差的14.45%，主要反映了RTFP對腸道菌群的影響，從圖中可以發(fā)現(xiàn)部分MLC組趨向于CC組（圖9C）。30 個樣本的微生物組成的非度量多維尺度分析（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）圖顯示，RTFP處理組和CC組的微生物組成有明顯的不同（圖9D）。結(jié)果表明，RTFP在調(diào)節(jié)腸道菌群中發(fā)揮著重要的作用。

圖9 不同處理組糞便菌群的β多樣性分析結(jié)果Fig.9 β-Diversity analysis of fecal microbiota in different treatment groups of mice

2.6.3 RTFP對小鼠糞便微生物群落組成的影響

2.6.3.1 RTFP不同處理組小鼠糞便菌群的物種數(shù)目分析

Venn圖可用于統(tǒng)計多個組或樣本中所共有和獨有的物種數(shù)目（如OTU），并能直觀顯示不同環(huán)境樣本中物種組成相似性及重疊情況。如圖10所示，6 組樣本中共有172 個OTU，CC、CLC、CHC、MC、MLC組和MHC組分別單獨有11、19、14、16、1 個和3 個OTU，說明6 組樣本中OTU組間差異不大，且經(jīng)過RTFP處理后，MC組小鼠獨有的菌種減少，表明小鼠腸道菌群經(jīng)過RTFP處理后菌群主體維持相對的穩(wěn)定，從另一方面說明RTFP具有維持NAFLD腸道菌群相對穩(wěn)定的能力。

圖10 RTFP不同處理組小鼠糞便菌群的Venn圖Fig.10 Venn diagram showing shared and unique OTUs from fecal microbiota of mice among different RTFP treatment groups

2.6.3.2 門水平上糞便組成分析

如圖11 所示，在門分類水平上，CC 組和MC組小鼠主要由厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）組成，占總序列的80%以上。Firmicutes與Bacteroidetes比值（Firmicutes/Bacteroidetes，F(xiàn)/B）的增加或降低被認(rèn)為是生物失調(diào)，前者通常表現(xiàn)為肥胖，后者則表現(xiàn)為炎癥性腸病[22]。與CC組相比，MC組Firmicutes相對豐度顯著提高（CC組59.31%、MC組75.69%），Bacteroidetes相對豐度明顯降低（CC組28.47%、MC組5.75%），使F/B值明顯升高，表明腸道菌群多樣性被破壞、菌群紊亂，這與Chang等[23]報道的肥胖小鼠腸道微生物中F/B值增加的結(jié)果一致。然而，經(jīng)過RTFP灌胃處理后，CC組和MC組小鼠部分菌群失調(diào)有所恢復(fù)。隨著灌胃劑量的增加，CC組小鼠的Firmicutes和Bacteroidetes相對豐度逐漸降低和升高，與MC組相比，MLC組和MHC組的F/B值分別降低了11.17%和34.27%，表明RTFP干預(yù)可降低NAFLD小鼠腸道微生物中F/B值，調(diào)節(jié)NAFLD小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)。

圖11 在門分類水平上小鼠糞便菌群組成Fig.11 Fecal microbiota composition at the phylum level

2.6.3.3 科水平上糞便組成分析

如圖12 所示，在科水平分類上比較了22 個最豐富的腸道菌群，與CC 組相比，MC 組毛螺菌科（Lachnospiraceae）、韋榮球菌科（Erysipelotrichaceae）、顫螺旋菌科（Oscillospiraceae）、螺桿菌科（Helicobacteraceae）等菌科的相對豐度明顯增加，Muribaculaceae、擬桿菌科（Bacteroidaceae）、乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）等菌科的相對豐度明顯減少。其中，Lactobacillus和Bidifidobactrium作為重要的益生菌，在保護(hù)腸道屏障功能、預(yù)防和治療肥胖、糖尿病等代謝類疾病具有重要意義[24-27]。本研究中，經(jīng)過RTFP灌胃處理后，模型小鼠的Lactobacillaceae相對豐度有所恢復(fù)，但未能提升Bifidobacteriaceae相對豐度。Zeng Huawei等[28]研究發(fā)現(xiàn)，長期的HFD會導(dǎo)致肥胖相關(guān)的回腸和結(jié)腸炎癥，并增加了結(jié)腸癌風(fēng)險信號的表達(dá)，伴隨著小鼠腸道Lachnospiraceae相對豐度的增加。本研究經(jīng)過RTFP干預(yù)后，CC組和MC組小鼠腸道中的Lachnospiraceae相對豐度呈劑量依賴式下降，與Cui Hongxin等[29]報道小檗堿可以降低糖尿病小鼠腸道微生物組中的Lachnospiraceae相對豐度的結(jié)果一致。幽門螺桿菌（Helicobacterpylori）是慢性胃炎、消化性潰瘍及胃癌等胃腸道疾病的重要環(huán)境致病因子[30]，本研究中高劑量RTFP干預(yù)后可以明顯降低模型小鼠腸道微生物中Helicobacteraceae相對豐度。此外，在CC組中許多被抑制的物種并未受到HFD的影響，表明RTFP可能富集特定的細(xì)菌物種。以上結(jié)果表明，RTFP的降脂和抗炎作用可能與其對NAFLD小鼠腸道微生物的調(diào)控作用有關(guān)。

圖12 在科分類水平上小鼠糞便菌群的組成Fig.12 Fecal microbiota composition at the family level

2.6.3.4 RTFP在屬水平上改善HFD誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂

如圖13 所示，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)CLC 組與CC組最相似。與CC組相比，MC組Muribaculaceae、Alistipes、Akkermansia、Lachnospiraceae 等菌屬的相對豐度降低，Erysipelotrichaceae、Coriobacteriaceae、Allobaculum、Faecalibaculum等菌屬的相對豐度增加。其中，有研究報道，嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansiamuciniphila）的相對豐度在HFD作用下不斷減少，Akkermansia相對豐度與炎癥之間存在顯著負(fù)相關(guān)，與脂肪組織褐變過程標(biāo)志物含量呈正相關(guān)[31-33]。本研究中發(fā)現(xiàn)，低劑量RTFP干預(yù)小鼠的腸道微生物組成中Akkermansia相對豐度較其他NAFLD小鼠高。此外，Mu Hongna等[34]研究發(fā)現(xiàn)Coriobacteriaceae_UCG-002、Faecalibaculum與血脂水平正相關(guān)，本研究中RTFP 干預(yù)可降低模型小鼠Coriobacteriaceae_UCG-002相對豐度，但對Faecalibaculum相對豐度無明顯影響。除此之外，Chen Guijie等[35]觀察到，在HFD喂養(yǎng)的小鼠中，添加苦丁茶和茯磚茶可以抑制Erysipelotrichaceae的生長，進(jìn)而預(yù)防肥胖，并調(diào)節(jié)腸道微生物菌群，本研究同樣發(fā)現(xiàn)RTFP可以降低模型小鼠腸道微生物組成中Erysipelotrichaceae相對豐度。以上結(jié)果表明，RTFP可以調(diào)節(jié)高脂飲食引起的腸道菌群失調(diào)。

圖13 小鼠糞便菌群在屬分類水平上的熱圖Fig.13 Heatmap of fecal microbiota at the genus level

3 結(jié)論

本研究中以正常飲食和高脂飲食小鼠為對象，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過RTFP灌胃給藥處理后，小鼠回腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，并減少隱窩病變和炎性細(xì)胞浸潤，保護(hù)腸道上皮屏障。RTFP還可以提高小鼠抗氧化能力，促進(jìn)脂質(zhì)代謝，降低炎癥水平，加強(qiáng)腸道免疫，改善腸道屏障功能，對機(jī)體健康產(chǎn)生了積極影響。此外，通過對高脂飲食肥胖小鼠糞便菌群進(jìn)行16S rRNA基因測序分析，發(fā)現(xiàn)RTFP處理增加了Bacteroidetes相對豐度，降低了Firmicutes相對豐度，抑制了Erysipelotrichaceae、Coriobacteriaceae、Helicobacteraceae等致病菌的增長，促進(jìn)Lachnospiraceae、Muribaculaceae、Akkermansiaceae等有益菌生長，提高菌群豐富度和多樣性，從而使腸道菌群微生態(tài)趨于正常水平，有效緩解了HFD引起的腸道代謝紊亂。以上結(jié)果表明，RTFP干預(yù)具有作為預(yù)防HFD引起的NAFLD治療策略的潛力。