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    高鹽刺激嗜堿性粒細胞產(chǎn)生促炎因子及其分子機制

    2023-03-09 13:55:20鐘菁華王中亮高金燕陳紅兵
    食品科學(xué) 2023年3期
    關(guān)鍵詞:堿性過敏粒細胞

    鐘菁華,王中亮,武 涌,高金燕,陳紅兵,*

    (1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西 南昌 330047;2.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西 南昌 330047;3.江西省食物過敏重點實驗室,江西 南昌 330047;4.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,江西 南昌 330047)

    食物過敏是影響人體健康的特異性免疫性疾病之一,表現(xiàn)為機體在攝入某些食物蛋白后會產(chǎn)生一系列不良反應(yīng)。臨床癥狀主要有嘔吐、腹瀉、便血、濕疹等,嚴重時可導(dǎo)致休克和死亡[1]。大量的研究表明,在過去20~30 年中,食物過敏的發(fā)病率逐漸上升,且呈現(xiàn)出每10 年增加1.2 個百分點的趨勢[2-3]。環(huán)境因素似乎是導(dǎo)致最近食物過敏患病率增加的主要因素,而環(huán)境因素中飲食習(xí)慣的改變被認為是這種流行趨勢的潛在驅(qū)動因素[4]。西方飲食成分以高脂、高糖、高鹽、深加工以及低纖維為特點,高脂和低纖維飲食已被明確證實可以影響食物過敏的發(fā)病進程[5-7]。而高鹽飲食對食物過敏的影響尚不清楚。根據(jù)相關(guān)文獻報道,成年人每天對于食鹽的生理需求量僅為4 g,世界衛(wèi)生組織建議成年人每天攝鹽量不應(yīng)超過5 g[8]。但調(diào)査發(fā)現(xiàn),部分國家人均每日攝鹽量超過了10 g。中國是傳統(tǒng)的高鹽飲食國家,中國北方仍然是世界上鹽攝入量最高的地區(qū)之一(每天11.2 g),甚至以清淡飲食著稱的南方,其居民日均食鹽攝入量已從1980年代的8.8 g,大幅增加到2010年代的10.2 g[9]。高鹽是否是誘發(fā)食物過敏患病率上升的原因有待研究。

    食物過敏主要是由輔助性Th2細胞驅(qū)動的,具體而言,Th2細胞產(chǎn)生的白細胞介素(interleukin,IL)-4促使B細胞發(fā)生類別轉(zhuǎn)換,進而分泌大量的抗原特異性免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)E,最終介導(dǎo)肥大細胞和嗜堿性粒細胞的效應(yīng)反應(yīng)[10-11]。在早期的研究中,嗜堿性粒細胞是晚期的效應(yīng)細胞,當致敏機體再次攝入過敏原后,抗原會迅速與致敏的嗜堿性粒細胞表面的特異性IgE結(jié)合,使嗜堿性粒細胞脫顆粒[12];最近的研究表明嗜堿性粒細胞是產(chǎn)生IL-4的主要來源之一,在誘導(dǎo)Th2細胞介導(dǎo)的免疫和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[13-14]。此外,嗜堿性粒細胞在外周血中循環(huán)并遷移到炎癥部位,可以通過調(diào)節(jié)其他免疫細胞(包括T細胞、B細胞或肥大細胞)來促進食物過敏的發(fā)生[15-16]。因此,嗜堿性粒細胞產(chǎn)生的IL-4可能是前期初始T細胞活化進而向Th2方向分化的重要因素,然而嗜堿性粒細胞產(chǎn)生IL-4的條件及免疫機制尚不清楚。

    近年來,越來越多的研究表明,過量攝入食鹽可以顯著影響機體的免疫系統(tǒng)[17-19]。例如,Wu Chuan等[19]發(fā)現(xiàn)高鹽飲食可以調(diào)節(jié)T細胞反應(yīng),特別是可以激活血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶1(serum and glucocorticoidregulated kinase 1,SGK1)通路來誘導(dǎo)致病性Th17細胞的產(chǎn)生,進而加重自身免疫性疾病。另一項獨立研究也表明,高鹽誘導(dǎo)致病性Th17細胞的產(chǎn)生依賴于P38及其下游靶點SGK1的激活[20]。進一步的研究也證實高鹽會促進促炎性Th細胞的產(chǎn)生,其機制可能是通過抑制調(diào)節(jié)性T(regulatory T,Treg)細胞的免疫抑制功能從而發(fā)揮作用[21]。針對過敏性疾病,Matthias等[22]發(fā)現(xiàn)NaCl可以在體外誘導(dǎo)Th2細胞極化(顯著增加Th2細胞因子IL-4和IL-13的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)錄因子GATA3的表達),進而調(diào)節(jié)過敏性皮炎微環(huán)境,而這也與SGK1信號通路有關(guān)。本研究聚焦食物過敏的重要效應(yīng)細胞——嗜堿性粒細胞,探究高鹽條件下KU812細胞脫顆粒及相關(guān)細胞因子的產(chǎn)生情況,隨后,重點探究高鹽條件下是否會促進嗜堿性粒細胞產(chǎn)生IL-4,及其產(chǎn)生IL-4細胞因子的分子機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    人外周血嗜堿性白細胞株(KU812) 中國科學(xué)院上海生化與細胞研究所;雞蛋過敏患者血清 江西省兒童醫(yī)院;1640培養(yǎng)基、胎牛血清 北京CellMax公司;CCK-8試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;IL-6試劑盒、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α試劑盒、TRIzol 美國Thermo Fisher公司;組胺試劑盒、β-氨基己糖苷酶(β-hexaminosidase,β-HEX)試劑盒上海撫生實業(yè)有限公司;PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、TB Green Premix ExTaqII(Tli RNaseH Plus) 日本TaKaRa公司;P38抑制劑SB202190、SGK1抑制劑GSK650394 美國MCE公司;無酶無菌水、青鏈霉素混合液(100×) 北京索萊寶科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    CO2細胞培養(yǎng)箱、全波長多功能酶標儀、超低溫冰箱、高速冷凍離心機、Applied Biosystems QuantStudioTM3、超微量核酸蛋白測定儀 美國Thermo Fisher公司;聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀日本Biometra 公司;CKX41 倒置熒光顯微鏡美國Olympus公司。

    1.3 方法

    1.3.1 細胞培養(yǎng)

    KU812細胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液(100×)的1640培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

    1.3.2 不同濃度NaCl干預(yù)后KU812細胞存活率的測定

    取對數(shù)期的KU812細胞以每孔100 μL加入96 孔板中,保證每孔細胞數(shù)2×105個/mL,空白組加入等量培養(yǎng)基,96 孔板外圈加入一圈磷酸鹽緩沖液,次日每孔分別加入10 μL不同濃度的NaCl,使其終濃度分別為10、20、30、40、50、60 mmol/L,對照組和空白組加入等量磷酸鹽緩沖液,24 h后,每孔加入10 μL的CCK-8試劑,2 h后于450 nm波長處測定吸光度。根據(jù)下式計算不同濃度NaCl干預(yù)后KU812細胞的存活率。

    1.3.3 高鹽條件下卵白蛋白誘導(dǎo)的KU812細胞脫顆粒模型的構(gòu)建

    1.3.3.1 雞蛋過敏血清池的構(gòu)建

    雞蛋過敏患者血清池是由雞蛋過敏患者的血清等體積混合制備而成(n=10),患者的血清信息如表1所示。

    表1 雞蛋過敏患者信息Table 1 Information of egg allergic patients

    1.3.3.2 IgE介導(dǎo)的KU812細胞體外活化實驗

    取對數(shù)期的KU812細胞以每孔300 μL加入48 孔板中,保證每孔細胞數(shù)2×106個/mL;次日,每孔加入30 μL雞蛋過敏血清池與細胞共孵育24 h;24 h后,陽性組加入終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的卵白蛋白(ovalbumin,OVA),實驗組加入終濃度為40 mmol/L的NaCl和終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的OVA,對照組加入等量磷酸鹽緩沖液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后,常溫下1 000 r/min離心10 min,收集上清液并分裝(用來測定組胺、β-HEX、IL-6、TNF-α水平),置于-20 ℃凍存?zhèn)溆?;收集的細胞立即加入TRIzol,吹打均勻后置于-80 ℃凍存以備后續(xù)提取RNA。

    1.3.3.3 組胺、β-HEX質(zhì)量濃度的測定

    按相應(yīng)試劑盒的說明書測定組胺、β-HEX質(zhì)量濃度。

    1.3.3.4 IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度的測定

    按相應(yīng)試劑盒的說明書測定IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度。

    1.3.4 NaCl刺激KU812細胞實驗

    取對數(shù)期的KU812細胞以每孔1 mL加入2 孔板中,保證每孔細胞數(shù)106個/mL;次日,實驗組每孔加入終濃度為40 mmol/L的NaCl,對照組加入等量的無菌水。培養(yǎng)24 h后收集細胞,提取RNA。

    取對數(shù)期的KU812細胞以每孔1 mL加入12 孔板中,保證每孔細胞數(shù)106個/mL;次日,實驗組每孔加入終濃度為5 μmol/L的SGK1抑制劑或終濃度為10 μmol/L的P38抑制劑刺激0.5 h,對照組加入等量的二甲基亞砜刺激,0.5 h后兩組再加入終濃度為40 mmol/L的NaCl刺激。培養(yǎng)24 h后收集細胞,提取RNA。

    1.3.5 KU812細胞RNA的提取

    根據(jù)TRIzol試劑說明書進行操作,步驟如下:在加入1 mL TRIzol的KU812細胞中加入200 μL的氯仿,混勻,劇烈渦旋15 s,冰上靜置3 min;4 ℃、12 000 r/min離心15 min,取上層液體400 μL后加入等量異丙醇,輕輕混勻,冰上靜置10 min;4 ℃、12 000 r/min離心10 min;去上清液,加入500 μL的體積分數(shù)75%乙醇溶液,混勻使沉淀懸浮,4 ℃、7 500 r/min離心10 min,重復(fù)此步驟一次;去上清液,倒扣離心管3 min左右來簡單干燥RNA,吸取適量的無酶水溶解RNA,電泳檢測提取RNA的質(zhì)量并測定樣品的OD260nm/280nm比值和RNA濃度,樣品于-80 ℃保存。

    1.3.6 KU812細胞RNA的反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR

    將RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA:1)在0.2 mL無酶管中加入2 μL的5×gDNA Eraser Buffer和1 μL的gDNA Eraser,再加入RNA,最后加無酶水至總體系為10 μL,置于42 ℃反應(yīng)2 min。2)再配制10 μL的Master Mix(1 μL Prim eScript RT Enzyme Mix I、1 μL RT Primer Mix 4、4 μL 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)、4 μL RNase Free dH2O),再分別加入至步驟1中的反應(yīng)液中,放入PCR儀中進行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)條件為:37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s;最后結(jié)束溫度設(shè)為4 ℃。反應(yīng)結(jié)束后樣品置于-20 ℃保存。

    在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)網(wǎng)站查找相應(yīng)的引物序列,進行篩選后由上海生工公司進行合成,引物信息如表2所示。

    表2 qPCR相關(guān)引物信息Table 2 Primer sequences used for qPCR

    PCR條件:采用20 μL的體系,在八連管中分別加入10 μL TB Green Premix ExTaqII(Tli RNaseH Plus)(2×)、0.8 μL PCR正向引物(10 μmol/L)、0.8 μL PCR反向引物(10 μmol/L)、0.4 μL ROX Reference Dye II(50×)、2 μL的cDNA溶液和6 μL滅菌水,擴增程序為:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃34 s,40 個循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    數(shù)據(jù)分析及圖表繪制均采用GraphPad Prism 8.3.0軟件進行,數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同濃度NaCl對KU812細胞增殖的影響

    使用細胞存活率這一指標來表征KU812細胞受NaCl濃度影響下的增殖能力變化,一般認為,樣品對細胞無毒性時細胞存活率不低于95%。通過CCK-8實驗發(fā)現(xiàn),隨著NaCl濃度的升高,細胞存活率下降(圖1)。在設(shè)置的6 個NaCl濃度中,10~40 mmol/L NaCl濃度下細胞存活率能保持在95%以上,說明此濃度范圍對細胞無毒性;而50 mmol/L和60 mmol/L的NaCl使細胞的存活率低于95%,說明該濃度NaCl對細胞有毒性。因此,在后續(xù)的實驗中,選取40 mmol/L作為NaCl作用細胞的最大無毒終濃度,這也與之前Kleinewietfeld[20]和Hernandez[21]等探究T細胞分化時所選取的NaCl濃度一致。

    圖1 不同濃度NaCl對KU812細胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of NaCl on KU812 cell proliferation

    2.2 NaCl對KU812細胞脫顆粒釋放生物活性介質(zhì)組胺和β-HEX的影響

    雞蛋過敏患者血清池與KU812細胞共孵育時,血清中的抗原特異性IgE會與嗜堿性粒細胞表面高親和力的FcεRI受體結(jié)合,使細胞處于致敏狀態(tài),再加入OVA(在有無高鹽條件下)激發(fā)后,OVA與IgE特異性結(jié)合,引起FcεRI交聯(lián)并觸發(fā)致敏的KU812細胞脫顆粒。KU812細胞在脫顆粒時會釋放預(yù)合成的生物活性介質(zhì)(組胺和β-HEX),兩者是嗜堿性粒細胞脫顆粒的標志性檢測物,其釋放水平的高低直接影響過敏癥狀的嚴重程度[23]。本實驗通過ELISA檢測KU812細胞脫顆粒產(chǎn)生的生物活性介質(zhì),如圖2所示,對照組、OVA組和OVA+NaCl組釋放的組胺質(zhì)量濃度分別為45.98、47.69、46.91 ng/mL;釋放的β-HEX質(zhì)量濃度分別為69.68、70.52、71.01 ng/mL。最終結(jié)果表明OVA組和OVA+NaCl組釋放的組胺和β-HEX質(zhì)量濃度并沒有顯著性差異(P>0.05),說明NaCl并不能促進KU812細胞脫顆粒產(chǎn)生生物活性介質(zhì)。

    圖2 NaCl對KU812細胞脫顆粒釋放生物活性介質(zhì)的影響Fig.2 Effect of NaCl on the release of bioactive mediators by KU812 cells after degranulation

    2.3 NaCl對KU812細胞產(chǎn)生細胞因子IL-6和TNF-α的影響

    IL-6和TNF-α是常見的促炎細胞因子,有研究表明在食物過敏患者的血清中IL-6和TNF-α水平顯著上升,它們能作為食物過敏患者后期隨訪的標志性檢測物[24]。本實驗通過ELISA檢測KU812細胞脫顆粒產(chǎn)生的炎癥因子,如圖3所示,對照組、OVA組和OVA+NaCl組釋放的IL-6質(zhì)量濃度分別931.58、1 015.91、1 255.69 pg/mL;釋放的TNF-α質(zhì)量濃度分別為3.46、5.71、7.51 pg/mL。結(jié)果表明OVA+NaCl組比OVA組更能促進KU812細胞產(chǎn)生IL-6和TNF-α(P<0.05)。進一步通過qPCR進行驗證,同樣也發(fā)現(xiàn)OVA+NaCl組中KU812細胞的IL-6和TNF-α基因相對表達量顯著升高(P<0.05)。這些結(jié)果揭示NaCl雖然不能調(diào)節(jié)KU812細胞產(chǎn)生生物活性介質(zhì),但是可以促進KU812產(chǎn)生相關(guān)的促炎細胞因子?,F(xiàn)有文獻報道,NaCl是Th2細胞的離子檢查點,能夠促進T細胞向Th2細胞分化并產(chǎn)生相應(yīng)的細胞因子[22]。因此推測,NaCl可能也是促進KU812細胞產(chǎn)生細胞因子的離子檢查點。

    圖3 ELISA和qPCR檢測40 mmol/L NaCl對KU812細胞脫顆粒相關(guān)細胞因子分泌的影響Fig.3 Effect of 40 mmol/L NaCl on the secretion of degranulationrelated cytokines by KU812 cells detected by ELISA and qPCR

    2.4 NaCl對KU812細胞產(chǎn)生細胞因子IL-4的影響

    IL-4是由過敏反應(yīng)中Th2細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞產(chǎn)生的促炎因子和多效性細胞因子在初始T細胞分化成Th2細胞和過敏反應(yīng)的發(fā)生中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。嗜堿性粒細胞能分泌大量的IL-4,通過嗜堿性粒細胞-IL-4-肥大細胞軸來促進食物過敏的產(chǎn)生[14]。Matthias等[22]在過敏性皮炎患者的皮膚活檢標本中發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細胞,且過敏性皮炎患者受損皮膚鈉濃度是未受損皮膚和健康對照組皮膚的30 倍,表明皮膚中的鈉積累與這種Th2介導(dǎo)的疾病有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)NaCl可以高度顯著促進嗜堿性粒細胞KU812細胞釋放IL-4(P<0.001)(圖4A)。而IL-4是促進和維持Th2型細胞免疫的關(guān)鍵細胞因子,NaCl很可能促進食物過敏的產(chǎn)生。

    研究表明NaCl濃度的增加伴隨著高滲透性的增加,可以誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的激活[25]。且在其他細胞中SGK1基因可以調(diào)節(jié)Na+運輸和鹽穩(wěn)態(tài)[26]。SGK1在NaCl轉(zhuǎn)運的背景下被廣泛研究,NaCl濃度的適度升高可以誘導(dǎo)T細胞中SGK1的表達,從而促進致病性Th17細胞的產(chǎn)生[20]。同樣地,本研究也發(fā)現(xiàn)高鹽條件下會高度顯著促進KU812細胞SGK1基因的表達(P<0.001)(圖4B)。綜上,是否是由于SGK1的高表達從而導(dǎo)致高鹽條件下KU812細胞產(chǎn)生IL-4,仍需后續(xù)繼續(xù)研究。

    圖4 NaCl對KU812細胞IL-4和SGK1基因表達的影響Fig.4 Effect of NaCl on IL-4 and SGK1 gene expression in KU812 cells detected by qPCR

    2.5 NaCl促進KU812產(chǎn)生IL-4的分子機制

    為了進一步探究在嗜堿性粒細胞KU812細胞中SGK1和IL-4表達間的靶向關(guān)系,本研究在40 mmol/L的NaCl條件下,利用SGK1的特異性抑制劑GSK650394處理KU812細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SGK1抑制劑可以極顯著降低KU812細胞中SGK1的表達(P<0.01)(圖5A),并可以顯著降低IL-4基因的表達(P<0.05)(圖5B)。這一結(jié)果揭示NaCl調(diào)節(jié)KU812細胞產(chǎn)生IL-4是由滲透敏感轉(zhuǎn)錄因子SGK1所介導(dǎo)的。

    此外,哺乳動物的高滲應(yīng)激是通過P38感知的,其下游靶標是滲透敏感轉(zhuǎn)錄因子SGK1[27]。P38信號可以調(diào)節(jié)SGK1激活,高濃度的NaCl可以促進P38磷酸化,從而激活SGK1[20]。在T細胞活化的相關(guān)研究中,NaCl通過P38-SGK1信號通路來促進Th17和Th2細胞的產(chǎn)生[22,28]。Guo Hongxia等[29]也發(fā)現(xiàn),高濃度NaCl加重結(jié)腸炎的機制依賴于P38和SGK1的上調(diào)。本實驗進一步探究NaCl調(diào)節(jié)KU812細胞產(chǎn)生IL-4是否受到P38-SGK1通路的調(diào)控。為了證實SGK1受P38信號的調(diào)控,本實驗在有無P38抑制劑(SB202190)的情況下,測定了NaCl刺激下KU812細胞中SGK1的表達情況。結(jié)果顯示,P38抑制劑可以高度顯著抑制SGK1的表達(P<0.001)(圖5C),這與許多文獻中的結(jié)果[20,30]一致。此外,P38抑制劑可以高度顯著降低NaCl刺激下KU812細胞產(chǎn)生的IL-4含量(P<0.001)(圖5D)。Kleinewietfeld等[20]研究NaCl調(diào)節(jié)初始T細胞分化時發(fā)現(xiàn),葡萄糖酸鈉與NaCl效果一樣,可以促進致病性Th17細胞的產(chǎn)生,而甘露醇和氯化鎂卻不能,這揭示了NaCl起作用的因素是鈉離子。在本實驗的細胞培養(yǎng)體系中,具體是Na+還是Cl-產(chǎn)生作用并不能夠確定,仍需要進一步研究。綜合以上結(jié)果,本研究初步揭示NaCl可以通過P38-SGK1信號通路來調(diào)節(jié)KU812細胞產(chǎn)生IL-4,具體的機制示意圖如圖6所示。

    圖5 qPCR檢測SGK1抑制劑和P38抑制劑對NaCl刺激KU812相關(guān)基因SGK1和IL-4表達的影響Fig.5 Effect of SGK1 inhibitor and p38 inhibitor on the expression of SGK1 and IL-4 in KU812 stimulated by NaCl detected by qPCR

    圖6 NaCl對KU812細胞產(chǎn)生IL-4的影響機制示意圖Fig.6 Schematic diagram of the mechanism of the effect of sodium chloride on IL-4 production by KU812 cells

    3 結(jié)論

    本研究發(fā)現(xiàn)高濃度的NaCl并不能促進嗜堿性粒細胞(KU812)脫顆粒產(chǎn)生生物活性介質(zhì)組胺和β-HEX,但可以調(diào)節(jié)KU812細胞的炎癥因子反應(yīng)。值得注意的是,NaCl可以促進KU812細胞產(chǎn)生食物過敏重要調(diào)控因子IL-4,其產(chǎn)生機制依賴于P38-SGK1信號通路。因此,本研究結(jié)果提示NaCl可能是嗜堿性粒細胞炎癥因子反應(yīng)的離子檢查點,然而高鹽飲食是否增加食物過敏的風(fēng)險,仍需要進一步研究。

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