• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    微生物利用一碳底物生產(chǎn)單細胞蛋白研究進展

    2023-03-09 13:55:00傅曉瑩喬瑋博史碩博
    食品科學 2023年3期
    關(guān)鍵詞:途徑利用生產(chǎn)

    傅曉瑩,喬瑋博,史碩博*

    (北京化工大學 北京軟物質(zhì)科學與工程高精尖創(chuàng)新中心,北京 100029)

    世界人口持續(xù)增長、人們消費模式變化和氣候變暖給高蛋白食品的生產(chǎn)供應(yīng)帶來了巨大的挑戰(zhàn)[1]。目前蛋白質(zhì)類食品的主要來源是動物、植物,其中動物蛋白的生產(chǎn)周期長、耗費大量勞動力資源,生產(chǎn)效率較低,且在動物飼養(yǎng)過程中還會產(chǎn)生CH4等溫室氣體;而植物種植占地面積大、耗水量多,受氣候變化影響較大,且植物蛋白缺乏甲硫氨酸、賴氨酸等人類必需氨基酸,營養(yǎng)價值低[2-3]。預(yù)計到2050年,傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)將無法滿足人類對高蛋白膳食的需求[4]。事實上,由于食物分配不均,許多人目前無法獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì),導(dǎo)致營養(yǎng)不良,尤其是在發(fā)展中國家該問題更為常見[5]。因此,需要開發(fā)新型高質(zhì)量蛋白質(zhì)來保障食品蛋白供給安全。

    微生物具有高水平的蛋白質(zhì)含量,可以合成人體所需的必需氨基酸,在生物反應(yīng)器中部分微生物蛋白質(zhì)的產(chǎn)量可以達到每立方米每小時數(shù)千克,這比傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)高出幾個數(shù)量級,且對環(huán)境的影響以及依賴極小[6-7]。微生物單細胞蛋白不僅蛋白質(zhì)含量高,還含有糖類、脂質(zhì)、維生素、無機鹽和一些重要的氨基酸,營養(yǎng)價值高,可作為食品工業(yè)的新型替代蛋白[8]。與植物和動物蛋白生產(chǎn)相比,微生物單細胞蛋白生產(chǎn)周期短,能源利用效率高,只需小部分土地,且不受天氣和氣候變化的影響。第一次世界大戰(zhàn)期間,德國曾用酵母蛋白取代了一半的進口蛋白質(zhì)來源[7]。目前全球已有幾家公司在以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)來自藻類、真菌或細菌的單細胞蛋白,并出售給人們食用。微生物生產(chǎn)單細胞蛋白的底物來源廣泛且價格低廉,包括一碳化合物、工業(yè)和農(nóng)業(yè)廢棄物等[4]。因此,食用微生物蛋白具有替代傳統(tǒng)的食物和飼料供應(yīng)方式的潛力。

    微生物可以利用多種底物生產(chǎn)蛋白[4],其中利用一碳化合物高效生產(chǎn)單細胞蛋白受到廣泛關(guān)注。一碳化合物是指具有單個碳原子的化合物,包括CO、CO2、CH4、甲醇、甲醛和甲酸。這些一碳底物來源廣泛、制備簡單、價格低廉且儲量豐富,被認為是生物煉制的新型和長期可持續(xù)的原料[9-11]。微生物利用一碳化合物生產(chǎn)單細胞蛋白,不僅可以拓展食品蛋白的供給體系,還可以促進一碳資源的清潔利用,助力我國“雙碳”目標的實現(xiàn)[11]。目前利用一碳化合物生產(chǎn)單細胞蛋白的天然微生物種類主要包括甲基營養(yǎng)菌、化能自養(yǎng)菌和光能自養(yǎng)菌。隨著合成生物學的最新進展和一碳利用途徑的揭示,天然一碳利用微生物的碳利用途徑被優(yōu)化[12],且一些原本不能利用一碳化合物的異養(yǎng)菌也被開發(fā)利用一碳底物[13-14]。

    綜上,利用一碳化合物合成微生物蛋白的生產(chǎn)過程綠色低碳,具有廣闊的應(yīng)用前景。本文首先介紹微生物單細胞蛋白在食品中的應(yīng)用及安全性;然后論述近年來天然微生物利用一碳化合物綠色生產(chǎn)單細胞蛋白的研究進展;同時,闡述天然一碳利用微生物的代謝機制以及相關(guān)途徑的優(yōu)化改造;最后對利用合成生物學方法改造微生物生產(chǎn)單細胞蛋白的前景進行展望。

    1 微生物單細胞蛋白在食品領(lǐng)域的商業(yè)化發(fā)展及安全性評價

    微生物單細胞蛋白是利用不同的原料培養(yǎng)真菌、細菌或微藻獲得的微生物菌體蛋白。單細胞蛋白中蛋白質(zhì)含量高,富含人類所需的必需氨基酸,可補充人體所需營養(yǎng),去除核酸后可作為食品蛋白直接食用。與動物蛋白和植物蛋白相比,單細胞蛋白生產(chǎn)周期短、原料來源廣、能源利用率高,且對環(huán)境的影響和依賴性很小,可作為動植物蛋白食品的替代來源[2,4]。單細胞蛋白還含有多種維生素、不飽和脂肪酸和無機鹽,營養(yǎng)價值高,可用于生產(chǎn)功能性食品。此外,鑒于單細胞蛋白良好的水合性、膠凝性、乳化性和組織成型性等功能特性,其亦可作為食品添加劑應(yīng)用于食品加工[15-16]。

    1.1 單細胞蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用

    微生物單細胞蛋白的蛋白質(zhì)含量高,含有多種維生素和無機鹽,是一種理想的食品蛋白質(zhì)來源。單細胞蛋白具有良好的組織成型性可用于生產(chǎn)“人造肉”等新食品[17],Marlow Foods公司利用絲狀鐮刀菌(Fusarium venenatum)制成單細胞蛋白產(chǎn)品Quorn,該產(chǎn)品主要用于生產(chǎn)香腸肉餅、即食漢堡等,目前在全球15 個國家進行商業(yè)化生產(chǎn)[16]。單細胞蛋白含有豐富的必需氨基酸、維生素和無機鹽,可作為營養(yǎng)強化劑添加至餅干、飲料和奶制品中,提高食品的營養(yǎng)價值[17-18]。此外,微藻單細胞蛋白含有豐富的不飽和脂肪酸,其中二十二碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)是人體必需的脂肪酸,目前利用微藻生產(chǎn)的不飽和脂肪酸已作為營養(yǎng)保健食品銷售[19]。

    微生物單細胞蛋白還可作為多種食品添加劑,用于食品加工。酵母濃縮蛋白具有顯著的鮮味,已被廣泛用于醬汁、肉汁等食品的增味;新鮮酵母和活性干酵母可作為發(fā)酵劑,用于饅頭、面包的加工;此外,酵母細胞壁多糖β-葡聚糖可作為乳化穩(wěn)定劑用于乳制品加工[15,20]。利用單細胞蛋白良好的水合性,將其用于肉制品和焙烤食品的制作,可減少加工過程中水分的流失,保持食品良好的口感和風味[17,20]。微藻單細胞蛋白中含有豐富的色素,可生產(chǎn)食用天然色素。微藻單細胞蛋白還富含天然抗氧化劑,包括類胡蘿卜素、酚類化合物、維生素和植物甾醇等,可用于食物保存[21]。有研究表明,添加微藻單細胞蛋白可顯著提高魚肉對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除能力,延緩脂肪氧化,延長肉制品保質(zhì)期[22]。

    目前用于商業(yè)生產(chǎn)的微生物單細胞蛋白包括好氧甲烷氧化菌(Methylococcus capsulatus)單細胞蛋白[4]、絲狀鐮刀菌單細胞蛋白[16]、用于功能性食品生產(chǎn)的小球藻(Chlorella vulgaris)單細胞蛋白[23]、用于含β-胡蘿卜素的食品添加劑或保健品生產(chǎn)的杜氏鹽藻(Dunaliella salina)單細胞蛋白[24]和用于含蝦青素的保健食品生產(chǎn)的雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)單細胞蛋白等[25]。

    1.2 單細胞蛋白應(yīng)用于食品的安全性

    安全性是單細胞蛋白能否作為食品生產(chǎn)原料首先要考慮的問題。影響單細胞蛋白安全性的因素包括微生物生產(chǎn)原料的安全性、單細胞蛋白的RNA含量、微生物本身是否產(chǎn)生毒素以及潛在的過敏原等[4]。相關(guān)研究人員討論了單細胞蛋白安全性并指出:生產(chǎn)單細胞蛋白菌株不能是病原菌,菌株不產(chǎn)生毒素;生產(chǎn)原料中重金屬殘留含量不能超過要求;在微生物培養(yǎng)和產(chǎn)品處理中要求無污染、無溶劑殘留和熱損害;最終產(chǎn)品應(yīng)無病菌、無活細胞、無溶劑殘留;單細胞蛋白產(chǎn)品必須進行動物毒性實和致癌實驗,還要進行人體臨床試驗,測定人體對單細胞蛋白的耐受性和可接受性,才能用于食品生產(chǎn)[26-27]。

    微生物具有自身代謝的特點,為了使單細胞蛋白符合作為食物的要求,通常采用特定的后處理來提高這種產(chǎn)品的消化性和可接受性[16]。微藻細胞具有細胞壁,生產(chǎn)微藻單細胞蛋白時需要將細胞壁破碎,使單細胞蛋白更容易被人體消化。細菌和真菌等微生物生長快速,其細胞含有高含量核酸,這致使相應(yīng)微生物單細胞蛋白或多或少都含有部分核酸,尤其是RNA[8]。當單細胞蛋白用于食品生產(chǎn)時,高核酸含量是一個問題。人體攝入RNA分解產(chǎn)生的嘌呤化合物會增加血漿中的尿酸濃度,而人體缺乏尿酸酶,尿酸會在體內(nèi)積累,積累過多甚至會導(dǎo)致腎結(jié)石和痛風。因此,利用單細胞蛋白生產(chǎn)食品蛋白時,需要增加核酸脫除環(huán)節(jié),添加核糖核酸酶使RNA降解,將核酸含量減小到規(guī)定的限值以下[4,28]。

    細菌在生長過程中會產(chǎn)生有害毒素,細菌產(chǎn)生的毒素分為外毒素和內(nèi)毒素,在將非致病菌用于單細胞蛋白生產(chǎn)前,需要進行毒素去除。外毒素由細菌分泌到細胞外的培養(yǎng)基中,外毒素的主要成分為蛋白質(zhì),化學性質(zhì)不穩(wěn)定,60 ℃處理30 min即可破壞,還可通過乙醇、甲醛或稀酸處理使其變性或者脫毒成為類毒素;內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的組成成分,也稱脂多糖,其去除較為困難,需160 ℃處理2~4 h才可被破壞,因此可通過基因工程手段抑制脂多糖形成基因的活性避免生成脂多糖[4,28]。微生物單細胞蛋白會存在一些潛在的過敏原,可以通過物理、化學或生物方法對其進行處理,從而降低或消除致敏性[29]。為了提高消費者對微生物單細胞蛋白的心理可接受度,單細胞蛋白產(chǎn)品還需加工成一定的結(jié)構(gòu)和形狀再供消費者食用。

    2 天然微生物利用一碳化合物生產(chǎn)單細胞蛋白

    目前利用一碳化合物生產(chǎn)單細胞蛋白的天然微生物主要包括甲醇酵母、化能自養(yǎng)菌和光合自養(yǎng)微生物三大類。其中甲醇酵母以甲醇為底物,生產(chǎn)的單細胞蛋白中蛋白質(zhì)含量較高,富含必需氨基酸和維生素,且酵母菌體較大易于分離回收[20]?;茏责B(yǎng)菌生長速度快,包括乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)和好氧甲烷氧化菌等,其中乙醇梭菌以CO為底物,而好氧甲烷氧化菌以CH4為底物,利用它們生產(chǎn)的單細胞蛋白不僅蛋白質(zhì)和必需氨基酸含量高,還具有較高的消化吸收率,但單細胞蛋白核酸含量較高[8]。光合自養(yǎng)微生物包括微藻和光合細菌兩類,二者均以CO2為底物。微藻光合固碳效率較高,生產(chǎn)的單細胞蛋白富含葉綠素、維生素和不飽和脂肪酸,且核酸含量較低,但微藻細胞壁不易消化[21];光合細菌單細胞蛋白含有豐富的必需氨基酸、類胡蘿卜素、維生素和聚羥基脂肪酸酯,可用于生產(chǎn)功能性食品[30]。

    2.1 甲醇酵母單細胞蛋白

    甲醇酵母是一種重要的甲基營養(yǎng)酵母,包括巴斯德畢赤酵母(Komagataella pastoris)、多形漢遜酵母(Ogataea polymorpha)和博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)等,這類酵母通過木酮糖單磷酸(xylulose monophosphate,XuMP)途徑以甲醇為碳源進行生長[31]。在甲醇酵母中,甲醇首先在醇氧化酶的作用下氧化生成甲醛,然后甲醛和5-磷酸木酮糖(xylulose 5-phophate,Xu5P)反應(yīng),生成的3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮進入糖酵解途徑參與細胞代謝[32]。甲醇酵母細胞利用甲醇生成甲醛的過程在過氧化物酶體中進行,這有利于降低甲醛對細胞的毒性,從而提高細胞生長速度[10]。甲醇是一種清潔能源,價格低廉且來源充足,利用甲醇為碳源是甲醇酵母用于單細胞蛋白生產(chǎn)的優(yōu)勢,甲醇利用效率決定了其蛋白生產(chǎn)過程的經(jīng)濟性。甲醇酵母培養(yǎng)結(jié)束后,培養(yǎng)液經(jīng)離心、脫水干燥即可得到甲醇酵母單細胞蛋白(圖1A)。甲醇酵母中蛋白質(zhì)含量較高,且富含必需氨基酸、維生素和金屬離子,最初被用于生產(chǎn)單細胞蛋白,但甲醇酵母對甲醇的利用效率較低,且甲醇對細胞有一定的毒性[20,31],與動物和植物蛋白相比,甲醇酵母單細胞蛋白生產(chǎn)成本較高、經(jīng)濟性較差,因此研究人員轉(zhuǎn)而開發(fā)甲醇酵母生產(chǎn)重組蛋白[33]。目前甲醇酵母是生產(chǎn)重組蛋白的一種重要平臺微生物,已有超過5 000 種重組蛋白使用甲醇酵母生產(chǎn)[34-35]。

    2.2 化能自養(yǎng)微生物單細胞蛋白

    2.2.1 乙醇梭菌單細胞蛋白

    乙醇梭菌是一種厭氧的化能自養(yǎng)菌,它通過Wood-Ljungdahl途徑利用CO或CO2作為碳源,以H2作為還原劑,生產(chǎn)燃料乙醇、微生物蛋白等高附加值化學品[36-38]。乙醇梭菌等化能自養(yǎng)菌的發(fā)酵過程與現(xiàn)有工業(yè)發(fā)酵技術(shù)的相容性較好,是構(gòu)建一碳氣體生物轉(zhuǎn)化細胞工廠的理想微生物之一。乙醇梭菌已通過中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心鑒定,經(jīng)微生物藥敏試驗、菌種毒力試驗、抗生素基因及致病基因檢測分析證實乙醇梭菌安全無毒,可作為食品工業(yè)菌體蛋白的生產(chǎn)菌種[39-40]。

    北京首朗生物科技有限公司和中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所以鋼鐵工業(yè)尾氣中的CO為碳源、氨水為氮源,利用梭菌液態(tài)厭氧發(fā)酵工藝,實現(xiàn)22 s快速高效產(chǎn)出乙醇和乙醇梭菌蛋白。目前該成果已實現(xiàn)工業(yè)化,達到了生物合成乙醇梭菌蛋白年產(chǎn)萬噸級的工業(yè)生產(chǎn)能力[41]。CO發(fā)酵乙醇醪液經(jīng)蒸餾除乙醇后還含有較多的菌體蛋白,該研究人員根據(jù)乙醇梭菌發(fā)酵醪液的特性,開發(fā)了完整的乙醇梭菌蛋白生產(chǎn)工藝(圖1B):首先控制乙醇梭菌發(fā)酵醪液的pH值和溫度,使菌體蛋白變性沉降;隨后經(jīng)離心濃縮,并添加絮凝劑后混合均勻,再進行壓濾脫水;產(chǎn)生的濾餅經(jīng)干燥、粉碎后得到乙醇梭菌蛋白粉。該蛋白干粉的粗蛋白質(zhì)量分數(shù)達到80%以上、粗灰分質(zhì)量分數(shù)不超過7%[37]。乙醇梭菌單細胞蛋白產(chǎn)品的消化率較高,且富含必需氨基酸,目前主要應(yīng)用于生產(chǎn)動物飼料[41-42],該產(chǎn)品中核酸含量較高,需要在生產(chǎn)工藝中添加去除核酸的環(huán)節(jié),具有開發(fā)成新型替代食品蛋白的潛力。

    2.2.2 好氧甲烷氧化菌單細胞蛋白

    全球產(chǎn)生的CH4氣體在進入大氣前,有很大一部分會被甲烷氧化菌氧化代謝。好氧甲烷氧化菌對于減少大氣中CH4含量、減緩溫室效應(yīng)具有重要作用[43]。好氧甲烷氧化菌在自然界中分布廣泛,根據(jù)細菌結(jié)構(gòu)和進化發(fā)育關(guān)系可分為3 種類型,分別屬于變形菌門(Proteobacteria)γ亞型、α亞型和疣微菌門(Verrucomicrobia)。變形菌門的好氧甲烷氧化菌首先利用自身的甲烷單加氧酶將甲烷氧化為甲醇,甲醇再經(jīng)甲醇脫氫酶催化氧化生成甲醛。隨后,變形菌門γ亞型的好氧甲烷氧化菌通過核酮糖單磷酸(ribulose monophosphate,RuMP)途徑將甲醛進一步轉(zhuǎn)化利用,變形菌門α亞型的好氧甲烷氧化菌則將甲醛轉(zhuǎn)化為甲酸后進入絲氨酸循環(huán)[44]。疣微菌門的好氧甲烷氧化菌是先將甲烷轉(zhuǎn)化成CO2,再通過Calvin-Benson-Bassham(CBB)循環(huán)將CO2轉(zhuǎn)化利用[45]。

    好氧甲烷氧化菌生長速率較高,利用該菌生產(chǎn)的單細胞蛋白純度高,單細胞蛋白作為胞內(nèi)產(chǎn)物,其生產(chǎn)能力與好氧甲烷氧化菌生長水平密切相關(guān)。微生物的比生長速率在很大程度上由培養(yǎng)環(huán)境決定[46],而底物CH4氣體在水中溶解度較低,因此好氧甲烷氧化菌發(fā)酵培養(yǎng)時的氣液傳質(zhì)速率嚴重影響了其對CH4的轉(zhuǎn)化利用。使用強制環(huán)流發(fā)酵罐(forced circulation loop reactor,F(xiàn)CLR)以連續(xù)培養(yǎng)方式進行好氧甲烷氧化菌發(fā)酵,不僅強化了氣液傳質(zhì),還保持了較高的單細胞蛋白生產(chǎn)效率。好氧甲烷氧化菌的菌體較小,離心過程能耗較大,且該菌單細胞蛋白的核酸含量較高,需經(jīng)過核酸去除,再進行干燥、成型,最終得到可供人類食用的好氧甲烷氧化菌單細胞蛋白[43]。

    丹麥UniBio和美國Calysta公司分別開發(fā)了利用變形菌門γ亞型好氧甲烷氧化菌通過RuMP途徑將CH4轉(zhuǎn)化為單細胞蛋白的發(fā)酵技術(shù)。UniBio公司使用帶有靜態(tài)混合器的U形環(huán)流發(fā)酵罐,其單細胞蛋白生產(chǎn)效率達到4 kg/(m3·h),且產(chǎn)品UniProtein?蛋白質(zhì)量分數(shù)達72%[4]。該產(chǎn)品為自由流動的紅棕色顆粒,不含毒素和重金屬,具有較長的保質(zhì)期,可進一步用于新型替代食品蛋白的開發(fā)研究。美國Calysta公司的最新產(chǎn)品Positive Protein單細胞蛋白使用其專利發(fā)酵平臺制成。如圖1C所示,該平臺建立了一種循環(huán)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng),甲烷氧化菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的CO2會被系統(tǒng)捕獲,經(jīng)過甲烷化再進入發(fā)酵罐中。Positive Protein蛋白質(zhì)的可消化率較高,還含有豐富的支鏈氨基酸,可與優(yōu)質(zhì)的動物蛋白質(zhì)相媲美,能夠作為一種營養(yǎng)又健康的食品替代蛋白,用于多種人類食品的生產(chǎn)[47]。

    2.3 光能自養(yǎng)微生物單細胞蛋白

    2.3.1 微藻單細胞蛋白

    微藻是重要的光合固碳微生物,它通過CBB循環(huán)將CO2轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛進入中心碳代謝。微藻在光合作用的光反應(yīng)階段利用葉綠素將H2O分解成氧氣,并產(chǎn)生ATP和還原力NADPH,在暗反應(yīng)階段利用光反應(yīng)產(chǎn)生的ATP和NADPH將CO2同化為有機物用于自身生長[9]。微藻生長速率較快,其蛋白質(zhì)量分數(shù)高達70%,是單細胞蛋白的重要來源。微藻單細胞蛋白含有較多葉綠素、維生素和不飽和脂肪酸(EPA和DHA),且核酸含量較低,具有生產(chǎn)功能性高蛋白食品的潛力[21]。

    微藻生產(chǎn)單細胞蛋白的效率受CBB循環(huán)中CO2捕獲酶的影響較大,利用合成生物學方法提高CO2捕獲酶的效率可有效提高微藻光合固碳能力,從而提升微藻單細胞蛋白的生產(chǎn)能力[9]。1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,RuBisCO)是CBB循環(huán)中的關(guān)鍵碳捕獲酶,Wei Li等[48]在Nannochloropsis oceanica中過表達了內(nèi)源的RuBisCO活化酶,通過提高RuBisCO的表達量,使得微藻生長速率提高了32%,生物質(zhì)積累量提高了46%,從而增強了微藻單細胞蛋白生產(chǎn)能力。光生物反應(yīng)器(photobioreactor,PBR)對于微藻培養(yǎng)十分重要,它決定著微藻細胞的生長速率和CO2利用效率,進而決定單細胞蛋白的生產(chǎn)效率。PBR分為開放式和封閉式兩大類。開放式PBR包括自然池塘、人工跑道池塘等,它們結(jié)構(gòu)簡單、成本低、操作方便,但易受環(huán)境和氣候的影響,光照、溫度的可控性差,還容易遭受雜菌污染。開放式PBR以太陽光為光源,由于太陽光的穿透能力有限,微藻開放培養(yǎng)多為單層跑道池塘的淺水養(yǎng)殖[49-50]。封閉式PBR的光源包括外置光源和內(nèi)置光源,微藻培養(yǎng)時的溫度、pH值、CO2供應(yīng)量和光照都可控制,光能利用效率高、微藻培養(yǎng)密度大,但生產(chǎn)成本較高。封閉式PBR包括柱式、管式和平板式反應(yīng)器等,多用于實驗室規(guī)模的微藻培養(yǎng),放大培養(yǎng)較為困難[50-51]。

    微藻種類較多,可以根據(jù)生產(chǎn)需求選擇不同的藻株,小球藻蛋白含量較高可用于生產(chǎn)單細胞蛋白。Pan Minmin等開發(fā)了一種新型的三室小球藻生物電化學反應(yīng)器,可以實現(xiàn)清潔培養(yǎng)小球藻和處理工業(yè)有機廢水同時進行。該研究為利用工業(yè)廢水清潔生產(chǎn)微藻蛋白提供了一種方法[52]。杜氏鹽藻(Dunaliella salina)、雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)等蛋白質(zhì)含量較低,可用于生產(chǎn)類胡蘿卜素、蝦青素、維生素、極性脂質(zhì)和甘油等高附加值產(chǎn)品[24-25,53]。微藻大多具有堅硬的細胞壁,人體很難消化,微藻培養(yǎng)后需對其進行細胞破碎來提高微藻單細胞蛋白的消化率,得到的微藻細胞裂解物經(jīng)過干燥,即可獲得微藻單細胞蛋白(圖1D)[51]。

    2.3.2 紫色光合細菌單細胞蛋白

    紫色光合細菌是一種厭氧的光合細菌,它通過細菌葉綠素(bacteriochlorophylls,BChls)吸收近紅外光,再利用自身豐富的類胡蘿卜素吸收可見光。紫色光合細菌包括紫色硫細菌和紫色非硫細菌兩類,它們通過CBB循環(huán)實現(xiàn)CO2的利用。紫色光合細菌不僅可以CO2為碳源進行光合自養(yǎng)生長,還可分解利用食品工業(yè)廢水的有機碳、氮、磷進行異養(yǎng)生長,收集的紫色光合細菌生物質(zhì)可用于生產(chǎn)單細胞蛋白[30,54]。

    紫色光合細菌生長需要充足的光照,由于透光率與細胞密度成反比關(guān)系,單位體積的紫色光合細菌細胞產(chǎn)量往往維持在較低水平,因此利用紫色光合細菌生產(chǎn)單細胞蛋白的重要挑戰(zhàn)是降低生產(chǎn)成本,提高生產(chǎn)效率[55]。紫色光合細菌經(jīng)過厭氧培養(yǎng)后,將培養(yǎng)液離心收集細胞,再去除核酸得到菌體蛋白,經(jīng)過脫水干燥后即可獲得紫色光合細菌單細胞蛋白(圖1E),目前紫色光合細菌的培養(yǎng)包括開放體系和封閉體系兩類。開放式培養(yǎng)體系(如跑道池塘)具有低成本、操作簡單、易清洗和低能耗的優(yōu)點,但易受天氣影響,因而難以實現(xiàn)紫色光合細菌長期穩(wěn)定的生長,且存在生產(chǎn)效率低和易受到其他微生物污染等問題。封閉培養(yǎng)體系(如管式/平板式PBR)具有光照表面積大、氣液傳質(zhì)速率高、生產(chǎn)強度高、不易受到污染等優(yōu)勢,但培養(yǎng)成本較高[49],其中平板式PBR應(yīng)用比較廣泛[56]。

    圖1 天然微生物利用一碳底物生產(chǎn)單細胞蛋白的工藝流程Fig.1 Flow chart for the microbial production of SCPs from single carbon substrates

    紫色光合細菌單細胞蛋白的蛋白質(zhì)含量高,含有豐富的必需氨基酸、類胡蘿卜素、維生素和聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA),營養(yǎng)價值較高,可用于研究開發(fā)功能性食品。目前紫色光合細菌單細胞蛋白主要用于生產(chǎn)飼料,而在食品工業(yè)中的應(yīng)用報道較少,且紫色光合細菌單細胞蛋白商業(yè)化生產(chǎn)還處于早期階段,需進一步研究開發(fā)新型紫色光合細菌PBR,使其具備穩(wěn)定的高生產(chǎn)強度,同時降低生產(chǎn)成本[30]。

    不同種類微生物利用一碳底物合成單細胞蛋白的特性如表1所示。

    表1 不同種類微生物利用一碳底物合成單細胞蛋白的比較Table 1 Comparison of SCP synthesis by different microbial species utilizing single carbon substrates

    3 天然一碳利用微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)

    天然微生物具有豐富的一碳代謝網(wǎng)絡(luò),利用這些代謝途徑可以實現(xiàn)一碳化合物生產(chǎn)單細胞蛋白。但目前天然微生物的一碳利用效率較低,需要利用合成生物學手段對一碳代謝網(wǎng)絡(luò)進行分析和改造,以提高微生物一碳利用效率。這樣不僅可以高效生產(chǎn)單細胞蛋白,而且有效減少碳排放,助力“雙碳”目標的實現(xiàn)[10-11]。當前主要的一碳代謝途徑包括以下種類。

    3.1 RuMP和XuMP途徑

    RuMP途徑存在于甲基營養(yǎng)細菌中,例如甲醇芽孢桿菌和甲基營養(yǎng)型嗜甲基菌;而XuMP途徑主要存在于甲基營養(yǎng)酵母中,包括畢赤酵母(Pichia pastoris)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)和博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)[57]。RuMP、XuMP途徑十分相似,都是甲醛結(jié)合戊糖進行碳原子重排,一碳分子后續(xù)經(jīng)由糖酵解途徑進入中心碳代謝,而戊糖的再生保證循環(huán)的持續(xù)運轉(zhuǎn),這兩個途徑的主要區(qū)別在于甲醛進入磷酸戊糖途徑的方式。在RuMP途徑中,甲醛在己糖磷酸合成酶(hexulose phosphate synthase,HPS)催化下可以與5-磷酸核酮糖(ribulose 5-phophate,Ru5P)結(jié)合生成6-磷酸己酮糖(hexulose 6-phosphate,H6P),然后在磷酸己糖異構(gòu)酶(phosphohexulose isomerase,PHI)的作用下發(fā)生異構(gòu)化,生成6-磷酸果糖(fructose 6-phosphate,F(xiàn)6P)進入中心碳代謝(圖2A)。在XuMP途徑中,在二羥丙酮合成酶(dihydroxyacetone synthase,DAS)的作用下,Xu5P的糖醛基團轉(zhuǎn)移到甲醛上,生成3-磷酸甘油醛和二羥丙酮,二羥丙酮可利用二羥丙酮激酶(dihydroxyacetone kinase,DHAK)進一步轉(zhuǎn)化為磷酸二羥丙酮(dihydroxyacetone phosphate,DHAP),從而進入中心代謝(圖2B)[10]。

    3.2 CBB循環(huán)

    CBB循環(huán)是廣泛存在于光合自養(yǎng)和化能自養(yǎng)微生物的一碳利用途徑,包括微藻、藍細菌、光合細菌和甲烷氧化菌等[11]。CBB循環(huán)的關(guān)鍵酶是RuBisCO,它催化CO2親電加成到烯二醇形式的1,5-二磷酸核酮糖(ribulose 1,5-bisphosphate,RuBP),產(chǎn)生不穩(wěn)定的C6中間體。C6中間體之后自發(fā)水解成兩個3-磷酸甘油酸分子,在ATP水解驅(qū)動下再由NADPH進一步還原為3-磷酸甘油醛(圖2C)。CBB循環(huán)生成1 個3-磷酸甘油醛分子需要消耗9 個ATP分子和6 個NADPH分子,能量利用效率較低,其關(guān)鍵酶RuBisCO的催化效率低且對底物CO2專一性差[58]。優(yōu)化其關(guān)鍵酶可以提高CO2利用效率,如Dur?o等通過過表達輔助RuBisCO折疊的GroEL/ES伴侶蛋白基因和敲除用于RuBisCO組裝的RbcX伴侶蛋白基因,將RuBisCO的CO2羧化效率提高了大約3 倍[59]。

    圖2 基于戊糖磷酸途徑的天然一碳利用途徑Fig.2 Pathways for the utilization of natural single carbon compounds based on pentose phosphate pathway

    3.3 絲氨酸循環(huán)

    甲烷氧化菌等許多甲基營養(yǎng)菌可以通過絲氨酸循環(huán)來代謝利用甲烷、甲醇、甲醛和甲酸。如圖3A所示,甲酸通過多步催化反應(yīng)首先生成活性中間體——5,10-亞甲基-四氫葉酸,在絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT)的作用下,5,10-亞甲基-四氫葉酸將其一碳單元轉(zhuǎn)移至甘氨酸從而生成絲氨酸,并經(jīng)后續(xù)多步催化被依次轉(zhuǎn)化為丙酮酸、草酰乙酸、蘋果酸等重要中間體,蘋果酸則與輔酶A反應(yīng)生成蘋果酰輔酶A,再進一步生成乙醛酸和乙酰輔酶A,乙酰輔酶A作為重要的中心代謝產(chǎn)物可進入后續(xù)代謝途徑中。絲氨酸循環(huán)生成1 分子乙酰輔酶A理論上需要消耗2 分子ATP和3 分子NADPH,還原力和ATP消耗較少。絲氨酸循環(huán)與中心碳代謝通路有較多重疊,因此在對該循環(huán)進行人工改造時需要考慮如何減少中心代謝通路的干擾[60],如Yu Hong等[61]通過引入絲氨酸脫水酶實現(xiàn)絲氨酸一步生成丙酮酸,改造了天然的絲氨酸循環(huán)。新的絲氨酸循環(huán)反應(yīng)步驟較少,并且消除了影響甲酸利用效率的副反應(yīng)。

    3.4 Wood-Ljungdahl途徑

    Wood-Ljungdahl途徑(也稱還原性乙酰輔酶A途徑)可將CO2和甲酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A進入中心碳代謝,該途徑需要金屬離子和鐵氧還蛋白的參與。還原性乙酰輔酶A途徑的關(guān)鍵酶包括一氧化碳脫氫酶、甲酸脫氫酶和亞甲基呋喃脫氫酶,這些關(guān)鍵酶對氧敏感,該通路主要存在于化能自養(yǎng)厭氧微生物中,包括產(chǎn)乙酸菌(如楊氏梭菌(Clostridium ljungdahlii))和產(chǎn)甲烷菌[11,62],其中產(chǎn)乙酸菌通過H2或NADPH提供還原力,而產(chǎn)甲烷菌利用金屬還原劑提供還原力。Wood-Ljungdahl途徑固定1 分子CO2僅需要消耗1 分子ATP和2 分子NADPH,是一種能源利用效率高、生物質(zhì)產(chǎn)量高的一碳利用途徑[63](圖3B)。調(diào)控該途徑關(guān)鍵酶的表達可顯著提高微生物合成單細胞蛋白的效率。Straub等在伍氏醋酸桿菌(Acetobacterium woodii)中選擇性過表達了Wood-Ljungdahl途徑中4 個關(guān)鍵酶的基因和與ATP生成相關(guān)的兩個基因,提高了伍氏醋酸桿菌的生長速率[64]。

    圖3 基于5,10-亞甲基-四氫葉酸同化的天然一碳利用途徑Fig.3 Pathways for the utilization of natural single carbon compounds based on 5,10-methylenetetrahydrofolate assimilation

    3.5 圍繞乙酰輔酶A到琥珀酰輔酶A的一碳利用途徑

    還原性三羧酸(reductive tricarboxylic acid,rTCA)循環(huán)、二羧酸/4-羥基丁酸(dicarboxylate/4-hydroxybutyrate,DC/HB)循環(huán)、3-羥基丙酸/4-羥基丁酸(3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate,HP/HB)循環(huán)和3-羥基丙酸(3-hydroxypropionate,3-HPA)雙循環(huán)是圍繞兩種常見的代謝物乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A演化而來,并且每個循環(huán)與該組中的另一個循環(huán)共享多個反應(yīng)[65]。

    rTCA循環(huán)通過逆轉(zhuǎn)三羧酸循環(huán)固定了2 分子CO2,它主要存在于變形菌、綠硫細菌和水生細菌中[28]。rTCA循環(huán)利用鐵氧還蛋白和NADPH作為電子供體,該循環(huán)生成1 分子乙酰輔酶A需要消耗2 分子ATP,耗能較少[58]。rTCA循環(huán)的關(guān)鍵步驟是檸檬酸分解成乙酰輔酶A和草酰乙酸。一直以來認為,該檸檬酸分解反應(yīng)由可逆的ATP依賴性檸檬酸裂合酶(adenosine triphosphate dependent citrate lyase,ACL)催化或者由檸檬酰輔酶A合成酶和檸檬酰輔酶A裂解酶催化的兩步反應(yīng)來代替,直到2018年才在乙酸脫硫桿菌中發(fā)現(xiàn)了具有可逆活性的檸檬酸合酶,該酶不僅能夠催化乙酰輔酶A和草酰乙酸生成檸檬酸,還可以催化檸檬酸分解反應(yīng),為該途徑的優(yōu)化提供了新的思路[66-67]。

    圍繞乙酰輔酶A到琥珀酰輔酶A的一碳利用途徑如圖4所示。

    圖4 圍繞乙酰輔酶A到琥珀酰輔酶A的天然一碳利用途徑Fig.4 Pathways for the utilization of natural single carbon compounds with transformation from acetyl-CoA to succinyl-CoA

    4 結(jié)語

    作為一種新型食品蛋白,微生物單細胞蛋白不僅蛋白質(zhì)含量高,還含有糖類、脂質(zhì)、維生素、無機鹽和必需氨基酸,具有很高的營養(yǎng)價值。目前發(fā)展和應(yīng)用單細胞蛋白已經(jīng)成為全球廣受關(guān)注的食品創(chuàng)新領(lǐng)域,許多企業(yè)和組織將業(yè)務(wù)聚焦于單細胞蛋白生產(chǎn),將其轉(zhuǎn)化為更可口、更營養(yǎng)的食品原料,不斷豐富和改善人類食品[70]。其中,微生物利用一碳化合物生產(chǎn)單細胞蛋白,不僅原料來源廣、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)設(shè)備占地面積小、不受天氣和氣候變化影響、能源利用效率高,還能促進一碳資源的清潔利用,減少碳排放。

    基于豐富的一碳代謝途徑,目前已實現(xiàn)天然一碳利用微生物生產(chǎn)單細胞蛋白,但由于這類微生物存在一碳利用效率低、單細胞蛋白生產(chǎn)成本高的問題,因此利用合成生物學和基因工程手段改良微生物性狀,進一步強化底物利用效率,有望助力實現(xiàn)單細胞蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)[71]。微藻和光合細菌通過CBB循環(huán)以CO2為碳源生產(chǎn)單細胞蛋白,利用基因工程方法優(yōu)化其關(guān)鍵酶可提高CO2利用效率,進一步提高單細胞蛋白生產(chǎn)效率[9]。在釀酒酵母等傳統(tǒng)被認為可食用的菌種中構(gòu)建異源一碳利用途徑生產(chǎn)單細胞蛋白也是一種新的研究方向[72-73]。釀酒酵母作為真核模式生物,具有安全無毒、易于生產(chǎn)、基因背景清晰,基因操作容易等優(yōu)點。改造模式微生物利用一碳化合物生產(chǎn)單細胞蛋白,不僅可以拓展食品蛋白供給來源,還可以促進一碳資源的高效利用。

    目前利用一碳化合物實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)單細胞蛋白的微生物種類主要包括細菌和微藻。這兩類微生物單細胞蛋白的蛋白質(zhì)含量較高,但微藻細胞壁較厚,需要經(jīng)過細胞破碎來提高單細胞蛋白的可消化性;而細菌蛋白的核酸(尤其是RNA)含量較高,需要增加核酸脫除工藝。與動物和植物蛋白生產(chǎn)相比,目前微生物利用一碳底物生產(chǎn)單細胞蛋白供人類食用成本較高,且相關(guān)培養(yǎng)工藝和生產(chǎn)技術(shù)仍不成熟。一些微生物單細胞蛋白如乙醇梭菌蛋白已用作飼料蛋白生產(chǎn)[41],可通過升級生產(chǎn)工藝提高單細胞蛋白的安全性和可接受度,進而用于生產(chǎn)食品蛋白。此外,雖然微生物單細胞蛋白可用于生產(chǎn)高營養(yǎng)食品原料、可直接改善終產(chǎn)品的功能屬性,但目前受眾面較窄。未來在保持其營養(yǎng)價值的前提下,既要確保單細胞蛋白的安全性和功能性,更要注重產(chǎn)品的顏色、氣味、口味等感官特性為食用者所喜歡,從而提高產(chǎn)品在消費者中的可接受度,實現(xiàn)微生物單細胞蛋白食品的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

    猜你喜歡
    途徑利用生產(chǎn)
    利用min{a,b}的積分表示解決一類絕對值不等式
    用舊的生產(chǎn)新的!
    利用一半進行移多補少
    “三夏”生產(chǎn) 如火如荼
    構(gòu)造等腰三角形的途徑
    多種途徑理解集合語言
    利用數(shù)的分解來思考
    Roommate is necessary when far away from home
    減少運算量的途徑
    S-76D在華首架機實現(xiàn)生產(chǎn)交付
    99久久精品热视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 色播亚洲综合网| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 国产av国产精品国产| 久久久久久久久大av| 黄片无遮挡物在线观看| 国内精品美女久久久久久| 看免费成人av毛片| 国产色爽女视频免费观看| 久久午夜福利片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 在线观看三级黄色| 2021天堂中文幕一二区在线观| 欧美三级亚洲精品| 国产av码专区亚洲av| 一级毛片aaaaaa免费看小| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产久久久一区二区三区| 中文字幕亚洲精品专区| 99久国产av精品国产电影| 青青草视频在线视频观看| 有码 亚洲区| 97超视频在线观看视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 深夜a级毛片| 在线看a的网站| 亚洲经典国产精华液单| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 99热这里只有是精品50| 亚洲成人一二三区av| 国产老妇伦熟女老妇高清| 色播亚洲综合网| 国产精品女同一区二区软件| 少妇人妻久久综合中文| 最新中文字幕久久久久| 22中文网久久字幕| 成人免费观看视频高清| 18+在线观看网站| 国产探花在线观看一区二区| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲精品成人av观看孕妇| 热99国产精品久久久久久7| 91久久精品国产一区二区成人| 国产黄a三级三级三级人| 成人国产麻豆网| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 嘟嘟电影网在线观看| 乱系列少妇在线播放| 好男人视频免费观看在线| av卡一久久| 69av精品久久久久久| 一级毛片久久久久久久久女| 麻豆国产97在线/欧美| 欧美日韩在线观看h| 国产精品成人在线| 久久久午夜欧美精品| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲av二区三区四区| 高清视频免费观看一区二区| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 欧美成人午夜免费资源| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲四区av| 禁无遮挡网站| 国产淫片久久久久久久久| 少妇熟女欧美另类| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲国产色片| 在线免费十八禁| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日韩强制内射视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 久久ye,这里只有精品| 欧美国产精品一级二级三级 | 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲精品国产av蜜桃| 伊人久久国产一区二区| av线在线观看网站| 视频中文字幕在线观看| 777米奇影视久久| 精华霜和精华液先用哪个| 日韩制服骚丝袜av| 七月丁香在线播放| 七月丁香在线播放| 99热网站在线观看| 国产男人的电影天堂91| 日韩av免费高清视频| 一级毛片电影观看| 男女边吃奶边做爰视频| 一级a做视频免费观看| 日日啪夜夜撸| av在线亚洲专区| 国产精品久久久久久久久免| 国产黄片视频在线免费观看| 美女主播在线视频| 岛国毛片在线播放| 国产 一区 欧美 日韩| 热99国产精品久久久久久7| 啦啦啦在线观看免费高清www| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久久久网色| 免费大片18禁| 午夜免费鲁丝| 国产高清有码在线观看视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 欧美成人a在线观看| 乱系列少妇在线播放| 嘟嘟电影网在线观看| 97在线人人人人妻| 日韩视频在线欧美| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 亚洲欧美精品自产自拍| 午夜福利在线在线| 久久精品国产自在天天线| 777米奇影视久久| 黑人高潮一二区| 有码 亚洲区| 校园人妻丝袜中文字幕| 深爱激情五月婷婷| 嫩草影院新地址| 久久午夜福利片| 久久久久精品性色| 好男人在线观看高清免费视频| 51国产日韩欧美| 亚洲精品国产av蜜桃| av在线老鸭窝| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲性久久影院| 免费观看av网站的网址| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 欧美bdsm另类| 国产高清有码在线观看视频| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲精品国产av成人精品| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美3d第一页| 亚洲精品一区蜜桃| 一级毛片aaaaaa免费看小| 91精品一卡2卡3卡4卡| 99视频精品全部免费 在线| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲怡红院男人天堂| 又大又黄又爽视频免费| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产成年人精品一区二区| 欧美另类一区| 69av精品久久久久久| 午夜激情福利司机影院| 久久久久久久国产电影| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲,欧美,日韩| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产黄色免费在线视频| 日韩大片免费观看网站| 欧美性感艳星| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 三级国产精品片| 九九爱精品视频在线观看| kizo精华| 国产有黄有色有爽视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 一本色道久久久久久精品综合| 国产视频首页在线观看| 日本av手机在线免费观看| 国产av国产精品国产| 亚洲最大成人手机在线| 午夜激情福利司机影院| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国国产精品蜜臀av免费| 秋霞伦理黄片| 欧美日本视频| 九九在线视频观看精品| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲av男天堂| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲va在线va天堂va国产| 婷婷色av中文字幕| 男女那种视频在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 熟女电影av网| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 日韩中字成人| 日日撸夜夜添| 欧美一区二区亚洲| 男人爽女人下面视频在线观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 天天一区二区日本电影三级| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲天堂av无毛| 一级片'在线观看视频| 欧美激情在线99| 熟女人妻精品中文字幕| 高清在线视频一区二区三区| 免费看光身美女| 男女啪啪激烈高潮av片| 日韩三级伦理在线观看| 69av精品久久久久久| 最近的中文字幕免费完整| av在线app专区| 国产成人一区二区在线| 永久网站在线| 美女主播在线视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 在现免费观看毛片| 晚上一个人看的免费电影| 又爽又黄a免费视频| 久久亚洲国产成人精品v| 男女边摸边吃奶| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 99热6这里只有精品| 亚洲av成人精品一区久久| 色5月婷婷丁香| 两个人的视频大全免费| 草草在线视频免费看| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲国产最新在线播放| 水蜜桃什么品种好| tube8黄色片| 日韩国内少妇激情av| 久久精品人妻少妇| 成人黄色视频免费在线看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 成人亚洲精品av一区二区| 97超碰精品成人国产| 22中文网久久字幕| 亚洲国产欧美在线一区| 综合色丁香网| 一级黄片播放器| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久热精品热| 丰满乱子伦码专区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲成人一二三区av| 看黄色毛片网站| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲国产欧美在线一区| 美女内射精品一级片tv| 一级av片app| 亚洲性久久影院| 大话2 男鬼变身卡| 又大又黄又爽视频免费| 校园人妻丝袜中文字幕| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲国产精品999| 2021天堂中文幕一二区在线观| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲国产精品成人久久小说| 在线观看人妻少妇| 欧美三级亚洲精品| 久久久久久伊人网av| 亚洲精品影视一区二区三区av| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲国产精品999| 制服丝袜香蕉在线| 一级毛片 在线播放| 精品久久久精品久久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 成年版毛片免费区| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 中文字幕制服av| 看十八女毛片水多多多| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 天美传媒精品一区二区| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日韩国内少妇激情av| 亚洲欧美精品专区久久| 中国国产av一级| 久久人人爽人人片av| 国产又色又爽无遮挡免| 国产黄色免费在线视频| 久久精品综合一区二区三区| 麻豆成人午夜福利视频| 青春草视频在线免费观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 日日撸夜夜添| 精品久久久精品久久久| 在线观看人妻少妇| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产v大片淫在线免费观看| 久热这里只有精品99| 日韩人妻高清精品专区| 日韩av不卡免费在线播放| 777米奇影视久久| 国产老妇伦熟女老妇高清| 天堂网av新在线| 交换朋友夫妻互换小说| 国国产精品蜜臀av免费| 日韩一区二区三区影片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 久久精品人妻少妇| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 色视频在线一区二区三区| 热re99久久精品国产66热6| 91狼人影院| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久久精品欧美日韩精品| 少妇熟女欧美另类| 国产伦理片在线播放av一区| 午夜福利在线在线| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 成人漫画全彩无遮挡| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲不卡免费看| 人人妻人人看人人澡| 22中文网久久字幕| 听说在线观看完整版免费高清| 免费黄色在线免费观看| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 性插视频无遮挡在线免费观看| videos熟女内射| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲怡红院男人天堂| 久久国内精品自在自线图片| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 制服丝袜香蕉在线| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日韩一区二区三区影片| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲国产精品成人久久小说| av在线app专区| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产男人的电影天堂91| 好男人视频免费观看在线| 国产日韩欧美亚洲二区| 午夜福利高清视频| 国产成人精品婷婷| 一级黄片播放器| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 草草在线视频免费看| 97热精品久久久久久| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久久久久久午夜电影| 亚洲成人一二三区av| 在线精品无人区一区二区三 | 日韩欧美 国产精品| 国产男女内射视频| 日韩一区二区三区影片| 国产毛片在线视频| 成人黄色视频免费在线看| 日韩欧美精品免费久久| 国产成人精品一,二区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 一本色道久久久久久精品综合| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲在久久综合| av免费在线看不卡| 成年人午夜在线观看视频| 在线播放无遮挡| 最新中文字幕久久久久| 一级毛片我不卡| 在线观看一区二区三区激情| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 在线观看美女被高潮喷水网站| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| kizo精华| 欧美日韩精品成人综合77777| 精品久久久精品久久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲精品自拍成人| 色播亚洲综合网| 午夜视频国产福利| 成人国产麻豆网| 日本欧美国产在线视频| 久久亚洲国产成人精品v| 一区二区av电影网| 国产成人aa在线观看| 十八禁网站网址无遮挡 | 国产 一区 欧美 日韩| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲人成网站在线播| 国产高潮美女av| 搡老乐熟女国产| 国产成人免费无遮挡视频| 日本欧美国产在线视频| 在现免费观看毛片| 日韩在线高清观看一区二区三区| eeuss影院久久| 在现免费观看毛片| 高清视频免费观看一区二区| 成人国产麻豆网| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲自拍偷在线| 亚洲精品国产av成人精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产永久视频网站| 听说在线观看完整版免费高清| 男人狂女人下面高潮的视频| h日本视频在线播放| 国产男人的电影天堂91| 国产69精品久久久久777片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日韩成人av中文字幕在线观看| 精品久久久噜噜| 中文天堂在线官网| 在线观看免费高清a一片| 久久久精品免费免费高清| 26uuu在线亚洲综合色| 午夜爱爱视频在线播放| 伊人久久精品亚洲午夜| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久人人爽人人片av| 久久久久久久久久成人| 日日撸夜夜添| 国产精品国产三级国产专区5o| 99久久精品一区二区三区| 日韩欧美 国产精品| av在线播放精品| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产精品久久久久久久电影| 日韩强制内射视频| 中文字幕免费在线视频6| 永久网站在线| 久久6这里有精品| 久久这里有精品视频免费| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产片特级美女逼逼视频| 黄色配什么色好看| 高清av免费在线| 久久99热6这里只有精品| av.在线天堂| 18禁在线播放成人免费| 联通29元200g的流量卡| 亚洲自拍偷在线| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产精品.久久久| 我要看日韩黄色一级片| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲天堂av无毛| 午夜福利视频1000在线观看| www.av在线官网国产| 久久久国产一区二区| 成人亚洲精品av一区二区| 交换朋友夫妻互换小说| 婷婷色综合www| 99久久精品一区二区三区| 99热国产这里只有精品6| 久久人人爽人人片av| 老司机影院毛片| 国产av国产精品国产| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产精品人妻久久久影院| 嘟嘟电影网在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 嫩草影院入口| 人妻 亚洲 视频| 日韩伦理黄色片| 97精品久久久久久久久久精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久韩国三级中文字幕| 特大巨黑吊av在线直播| 日韩av在线免费看完整版不卡| 精品久久久精品久久久| 久久久久国产网址| 激情五月婷婷亚洲| 国产日韩欧美在线精品| 草草在线视频免费看| 亚洲精品456在线播放app| 男女边摸边吃奶| 在现免费观看毛片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产av国产精品国产| 国产精品不卡视频一区二区| 777米奇影视久久| 高清在线视频一区二区三区| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品伦人一区二区| 国产爱豆传媒在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 成人亚洲欧美一区二区av| 一区二区三区四区激情视频| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲内射少妇av| 国产免费又黄又爽又色| 国产成人91sexporn| 成人二区视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 麻豆成人午夜福利视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 91久久精品国产一区二区成人| 午夜免费男女啪啪视频观看| 在线观看三级黄色| 亚洲精品一区蜜桃| 精品久久久久久久久亚洲| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品国产露脸久久av麻豆| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久久久久久久久成人| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 人妻一区二区av| 久久精品综合一区二区三区| 男女无遮挡免费网站观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 美女主播在线视频| 欧美丝袜亚洲另类| 在线观看av片永久免费下载| 日本一二三区视频观看| 免费av不卡在线播放| 免费观看无遮挡的男女| 高清视频免费观看一区二区| 青春草亚洲视频在线观看| 少妇的逼水好多| 在线观看三级黄色| 黄色欧美视频在线观看| 各种免费的搞黄视频| 国产高清三级在线| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲人成网站在线播| 五月伊人婷婷丁香| 欧美3d第一页| freevideosex欧美| 欧美xxxx性猛交bbbb| 边亲边吃奶的免费视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 成人亚洲欧美一区二区av| 美女内射精品一级片tv| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产精品久久久久久av不卡| 少妇高潮的动态图| 91在线精品国自产拍蜜月| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲欧洲日产国产| 中文字幕久久专区| av又黄又爽大尺度在线免费看| av线在线观看网站| 亚洲av成人精品一二三区| 直男gayav资源| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲国产成人一精品久久久| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲成人一二三区av| 亚洲精品成人久久久久久| 免费看日本二区| 亚洲天堂av无毛| 嘟嘟电影网在线观看| 国产精品成人在线| 91精品国产九色| 免费观看a级毛片全部| 极品教师在线视频| 成人黄色视频免费在线看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产一区二区三区av在线| 嘟嘟电影网在线观看| 日本午夜av视频| 99热这里只有精品一区| 精品一区二区免费观看| 观看免费一级毛片| 在线观看三级黄色| 精品视频人人做人人爽| 久久久精品94久久精品| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲精品国产成人久久av| 国产精品人妻久久久久久| 91久久精品国产一区二区三区| 午夜免费观看性视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 中国美白少妇内射xxxbb| 青青草视频在线视频观看| 久久亚洲国产成人精品v| 在线观看国产h片| 看黄色毛片网站| 国产亚洲最大av| 成人午夜精彩视频在线观看| 九色成人免费人妻av| 久久这里有精品视频免费| 男女边吃奶边做爰视频| 午夜视频国产福利| 久久精品综合一区二区三区| 久久亚洲国产成人精品v| 欧美性感艳星| 久久鲁丝午夜福利片| 校园人妻丝袜中文字幕| 色综合色国产| 卡戴珊不雅视频在线播放| 欧美日韩综合久久久久久| 久久久久网色| 亚洲精品视频女| 久久久久性生活片| 美女主播在线视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 日韩伦理黄色片| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美人与善性xxx| 一个人观看的视频www高清免费观看|