中國(guó)水仙離體快繁技術(shù)研究進(jìn)展

劉曉紅,馮雅妹

(太原學(xué)院 藝術(shù)設(shè)計(jì)系,山西 太原 030032)

中國(guó)水仙(Narcissustazettavar.chinensis)是石蒜科水仙屬的一種多年生草本植物。作為歐洲水仙(N.tazetta)的一個(gè)變種,中國(guó)水仙在唐朝初期由地中海引進(jìn)到中國(guó),因其耐寒性差,主要分布于東南沿海溫度濕潤(rùn)地區(qū),北方地區(qū)主要用于室內(nèi)水養(yǎng)觀賞[1]。中國(guó)水仙花姿雅致,花色淡雅,芳香,是早春重要的園林花卉,可用于片植、花壇、花境等,還可作切花以及盆栽。

由于是同源三倍體植物,中國(guó)水仙很難通過(guò)雜交的方式來(lái)獲得后代,所以自然條件下多用分球繁殖。但這種繁殖方式不僅繁殖系數(shù)低,周期長(zhǎng),而且病毒積累也較為嚴(yán)重。離體快繁不僅可以進(jìn)行脫毒苗的培養(yǎng),而且短時(shí)間內(nèi)可以得到大量的優(yōu)良植株,因此離體快繁技術(shù)對(duì)于中國(guó)水仙的繁育有著重要意義。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)始于19世紀(jì)末,20世紀(jì)后期迅速發(fā)展成熟[2]。20世紀(jì)70年代初首例水仙花(Narcissustazettacv. Grand Soleil d’Or)離體植株再生獲得成功[3]。雖然中國(guó)水仙在我國(guó)已有近千年的栽培歷史[4],但對(duì)它離體培養(yǎng)開(kāi)始得并不早,始于20世紀(jì)80年代。福建省由于得天獨(dú)厚的水仙資源條件在中國(guó)水仙組織培養(yǎng)方面的研究位于全國(guó)前列。1980年丁雪英等[5]以漳州水仙鱗片、莖錐、嫩葉等為外植體,由愈傷組織獲得鱗莖和綠株,并繼續(xù)分生得到了帶根的水仙鱗莖。陳振光[6]用中國(guó)水仙鱗莖外植體通過(guò)一年切塊繁殖,可獲得以萬(wàn)計(jì)的小鱗莖,大大提高了水仙的繁殖系數(shù)。在之后的40多年間,中國(guó)水仙的離體快繁技術(shù)取得了一些進(jìn)展。

1 低溫預(yù)處理

低溫預(yù)處理可以提高中國(guó)水仙組織培養(yǎng)的成活率和誘導(dǎo)率。完全沒(méi)有經(jīng)過(guò)低溫預(yù)處理的漳州水仙鱗莖組織切塊會(huì)發(fā)黃發(fā)褐,成活率很低。經(jīng)過(guò)4～10 ℃低溫預(yù)處理4～9周后,誘導(dǎo)率會(huì)大幅提高[7]。低溫預(yù)處理可以保持外植體原有的顏色和活力,減少褐化,提高誘導(dǎo)能力[8-9]。冷處理后的鱗莖盤(pán)分化時(shí)間縮短,分化能力明顯增強(qiáng)[10]。楊柳燕等[11]發(fā)現(xiàn)冷處理9周水仙鱗莖誘導(dǎo)率為100%。鄭春明[8]將2～3 a生鱗莖球存放在4 ℃左右的冷藏箱中,發(fā)現(xiàn)低溫處理3周可明顯提高外植體的成活率、生長(zhǎng)速度和誘導(dǎo)率。

2 消毒劑的研究

2.1 升汞處理

莊曉英[10]對(duì)8種不同升汞濃度和熱水處理時(shí)間組合研究表明:用0.1%的升汞處理20 min,55～60 ℃的無(wú)菌熱水處理2 min,0.1%的升汞處理5 min,中國(guó)水仙外植體污染率最低、增殖系數(shù)最高。蔡月琴等[12]發(fā)現(xiàn)0.1%升汞處理組滅菌效果比2%次氯酸鈉處理組好。水仙鱗莖用0.1%的升汞處理12 min內(nèi)層鱗片的污染率最低,存活率最高,達(dá)到73.3%。劉炤[13]對(duì)不同的消毒滅菌方式進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)采用多步混合消毒方式可以有效降低中國(guó)水仙鱗莖污染率。

2.2 次氯酸鈉處理

對(duì)中國(guó)水仙花苞來(lái)說(shuō),相對(duì)于0.1%的升汞,滅菌溫和的2%的次氯酸鈉浸泡處理20 min效果最好[12]。對(duì)水仙花苞和主球進(jìn)行消毒處理,25%次氯酸鈉處理20 min污染率達(dá)100%,用30%次氯酸鈉消毒側(cè)球30 min污染率則降到39.1%[14]。25%次氯酸鈉浸泡“云香水仙”鱗莖30 min的消毒效果最佳,在次氯酸鈉濃度相同的情況下,消毒時(shí)間越長(zhǎng),污染率越低[15]。

綜上可知,消毒劑的使用除自身濃度和處理時(shí)間外,必要時(shí)還需要與其他方式,如熱水處理等相配合,才能達(dá)到最佳的消毒效果。

3 外植體部位及大小

3.1 外植體部位的選擇

3.1.1鱗莖和鱗片

中國(guó)水仙離體培養(yǎng)最常用的外植體是帶鱗莖盤(pán)的雙鱗片、雙鱗片或鱗片[16]。不帶鱗莖盤(pán)的鱗片培養(yǎng)誘導(dǎo)率較低,鱗莖最內(nèi)層鱗片培養(yǎng)效果較好[7-8]。章萍萍等[17]則認(rèn)為漳州水仙鱗莖誘導(dǎo)中層最好,外層則容易產(chǎn)生褐化。雙鱗繁殖被認(rèn)為是水仙組織快繁的有效方法[18]。

莊曉英[10]發(fā)現(xiàn)鱗莖盤(pán)、鱗莖、試管小鱗莖葉都可以分化出愈傷組織,其中鱗莖盤(pán)是最佳的外植體,分化率可達(dá)100%。熊莉君等[19]也發(fā)現(xiàn)帶鱗莖盤(pán)的中國(guó)水仙鱗莖外植體的脫分化和再分化能力都很強(qiáng)。因此認(rèn)為,在選擇外植體的過(guò)程中,選擇形態(tài)學(xué)下端的外植體較好。

3.1.2花葶

欒愛(ài)業(yè)[20]選擇3種不同生長(zhǎng)階段的花葶,發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)一段時(shí)間后,花苞還沒(méi)有抽出鱗莖時(shí)的花葶誘導(dǎo)率最高,幼嫩的花葶外植體容易褐變,但當(dāng)材料逐漸成熟時(shí)褐變會(huì)消失。王文婷[14]用花葶直接誘導(dǎo)不定芽,發(fā)現(xiàn)花葶雖然可以成功地誘導(dǎo)出不定芽,但是誘導(dǎo)出來(lái)的芽普遍較小,綠葉的抽出也相對(duì)困難,并且誘導(dǎo)苗后期培養(yǎng)中非常容易死亡。

3.1.3子房

將中國(guó)水仙子房外植體做成切片培養(yǎng),可以產(chǎn)生大量的不定芽[6]。子房的愈傷組織的誘導(dǎo)率較高,質(zhì)量也好。由子房誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織分化培養(yǎng),也表現(xiàn)良好[14]。崔瑞峰等[21]卻發(fā)現(xiàn)子房外植體對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織能力比鱗莖、花梗和葉片差。蔡月琴等[12]發(fā)現(xiàn)消毒后子房接種后可迅速脫分化,但進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)就變得很困難,最終會(huì)褐化并死亡。漳州水仙子房在不同時(shí)間取材,愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果也不同。幼嫩子房的誘導(dǎo)率并不高,誘導(dǎo)程度會(huì)隨著子房成熟度提高[20]。

3.2 外植體的大小

外植體切法與大小影響小鱗莖的質(zhì)量和增殖率。何瑋毅等[22]發(fā)現(xiàn)8 mm×5 mm左右的中國(guó)水仙帶鱗片的鱗莖盤(pán)在增殖率和小鱗莖的質(zhì)量等方面優(yōu)于4 mm×3 mm的外植體。但是外植體的體積越小,經(jīng)過(guò)流水處理后的外植體的污染率越低[8]。

3.3 外植體的年齡及月份

陳振光等[23]對(duì)中國(guó)水仙外植體的年齡及月份的研究發(fā)現(xiàn)1 a生的中國(guó)水仙鱗莖分化和誘導(dǎo)小鱗莖能力都很強(qiáng)。對(duì)于不同月份來(lái)說(shuō),九月份外植體誘導(dǎo)率最高。莊曉英[10]對(duì)1～3 a生的經(jīng)過(guò)冷處理鱗莖的鱗莖盤(pán)和鱗莖葉做了對(duì)比研究卻認(rèn)為從分化率和增殖率來(lái)看,2 a生的鱗莖盤(pán)最佳。

綜上所述,中國(guó)水仙適合的外植體部位有鱗莖盤(pán)、雙鱗片、花葶、子房、花藥[24-25],花序軸[26]等,但帶鱗片的鱗莖盤(pán)是最常用和分化效果最好的外植體。對(duì)于鱗莖的年齡來(lái)說(shuō),選擇1 a生中國(guó)水仙最好,冷處理的鱗莖盤(pán)則選擇2 a生的最好;接種時(shí)間選擇九月份最佳。流水沖洗的時(shí)間相同,外植體的越小,污染率越低。

4 培養(yǎng)基

4.1 基本培養(yǎng)基

早期進(jìn)行中國(guó)水仙外植體培養(yǎng)時(shí),學(xué)者們大多數(shù)都選擇MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基,因?yàn)檫@個(gè)培養(yǎng)基養(yǎng)分?jǐn)?shù)量和比例合適且適用范圍廣。如李招文等[7]對(duì)中國(guó)水仙在MS和N6兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的對(duì)比試驗(yàn)表明MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的水仙鱗莖成球率和誘導(dǎo)率都比在N6培養(yǎng)基里的高。欒愛(ài)業(yè)[20]選用MS,N6和MS(1/2NH4NO3)3種培養(yǎng)基誘導(dǎo)中國(guó)水仙的子房和花葶的愈傷組織,其中MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最高。陸春芳等[9]對(duì)相同激素的MS培養(yǎng)基和N6培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比,認(rèn)為MS培養(yǎng)基是崇明水仙組培的最佳培養(yǎng)基。陳振光等[23]發(fā)現(xiàn)中華培養(yǎng)基是誘導(dǎo)小鱗莖最佳的培養(yǎng)基,誘導(dǎo)率在初代培養(yǎng)中高達(dá)54.5%,在增殖繼代培養(yǎng)中高達(dá)108.3%;其次是N6培養(yǎng)基;Morel培養(yǎng)基效果最差。

4.2 激素配比的研究

在組培過(guò)程中激素對(duì)于外植體的生長(zhǎng)有重要作用,激素可以提高外植體的初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的速度,縮短外植體培養(yǎng)的時(shí)間,提高效率,因此激素的選擇對(duì)中國(guó)水仙工廠化發(fā)展具有重要意義。

中國(guó)水仙愈傷組織的誘導(dǎo)大多使用的激素是萘乙酸(NAA),2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和6-芐氨基嘌呤(6-BA)。崔瑞峰等[21]認(rèn)為只采用2,4-D進(jìn)行培養(yǎng)效果就很好。而丁雪英等[5]認(rèn)為培養(yǎng)基中加入NAA 3 mg/L,2,4-D 1 mg/L誘導(dǎo)愈傷組織的效果好。楊柳燕[11]、王文婷[14]、熊莉君[19]、楊會(huì)苗[27]、顧亨森[28]、方琪等[29]則發(fā)現(xiàn)6-BA和2,4-D的組合效果最佳。對(duì)于6-BA+NAA的組合,無(wú)論什么濃度下的培養(yǎng)基都無(wú)法誘導(dǎo)出來(lái)愈傷組織,它只對(duì)分裂有用,對(duì)于分化來(lái)說(shuō)用處不大[29]。還有研究發(fā)現(xiàn)3種激素組合使用效果也好[30]。

不同激素濃度組合還會(huì)影響誘導(dǎo)小鱗莖的效果。如李招文等[7]在利用水仙鱗莖進(jìn)行初代培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)基中加入2 mg/L的NAA對(duì)小珠球的形成效果較好;附加6-BA,成球率略有下降。劉炤[13]采用鱗莖作為外植體發(fā)現(xiàn)激素組合為NAA 1 mg/L+6-BA 5 mg/L時(shí)分化小鱗莖效果最好,楊柳燕[31]也發(fā)現(xiàn)NAA和6-BA組合的效果最佳。繼代培養(yǎng)中小鱗莖的發(fā)生與生長(zhǎng)素有著密切關(guān)系,有學(xué)者認(rèn)為只用NAA繼代培養(yǎng)效果最好[7]。而有些學(xué)者則認(rèn)為幾種生長(zhǎng)素組合的培養(yǎng)效果較好。如丁雪英等[6]發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)培養(yǎng)的最佳激素配比為2,4-D∶NAA=1 mg/L∶3 mg/L,并在培養(yǎng)基中添加10%的椰汁效果最好。另外也有研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素組合中加入6-BA的分化效果最好[13-14]。

NAA和6-BA對(duì)不定芽的誘導(dǎo)起到主要作用,如金雄霞等[32]對(duì)中國(guó)水仙鱗莖盤(pán)外植體和愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)NAA 1.0 mg/L+6-BA 10 mg/L最好。林加根等[33]認(rèn)為漳州水仙鱗莖誘導(dǎo)芽的最佳培養(yǎng)基是MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。王文婷[14]對(duì)花葶的誘導(dǎo)試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)最佳培養(yǎng)基激素組合為6-BA 5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

生根培養(yǎng)中研究最多的是NAA的濃度,如顧亨森等[28]用中國(guó)水仙的不定芽和中國(guó)水仙小鱗莖為外植體,發(fā)現(xiàn)NAA的濃度在0.01～0.30 mg/L時(shí)不定芽都可以生根;對(duì)于小鱗莖來(lái)說(shuō)NAA濃度0.03 mg/L最合適。劉炤[13]對(duì)比發(fā)現(xiàn)只添加NAA的培養(yǎng)基生根效果比只添加IBA的好,最佳的生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5 mg/L。而蔡月琴等[12]的生根培養(yǎng)過(guò)程中卻發(fā)現(xiàn)1/2MS+ IBA 1 mg/L的培養(yǎng)效果最好,證明IBA對(duì)生根誘導(dǎo)也有很好的促進(jìn)作用。另外NAA和IBA組合使用對(duì)生根也有良好的效果[32-33]。

4.3 糖類及附加物

糖類可以為組織培養(yǎng)提供碳源,陳振光等[23]對(duì)不同種糖類試驗(yàn)表明砂糖的誘導(dǎo)效果好于蔗糖。楊柳燕等[26]發(fā)現(xiàn)提高蔗糖濃度,有利于試管球的增殖和膨大,蔗糖濃度在40 g/L時(shí)試管球的增殖率最大,可達(dá)157.5%。活性炭顯著降低試管球的增殖率,但對(duì)生根則有著促進(jìn)作用。而鄭春明[8]發(fā)現(xiàn)硝酸銀的濃度在2.5 mg/L時(shí)水仙的誘導(dǎo)率高達(dá)91%,適量的硝酸銀對(duì)不定芽的形成有促進(jìn)作用,愈傷組織再分化時(shí)不定芽不但生長(zhǎng)速度較快,而且芽健壯整齊。但過(guò)量的硝酸銀則起到抑制作用,其生理生化機(jī)理不明。熊莉君等[19]將MS培養(yǎng)基中KH2PO4濃度加倍時(shí)小鱗莖增長(zhǎng)速度較快,證明了P、K肥可以促使小鱗莖增大。

5 培養(yǎng)環(huán)境

光質(zhì)和光照時(shí)間都會(huì)影響中國(guó)水仙的培養(yǎng)效果,水仙愈傷組織誘導(dǎo)黃光效果最好,紅光最差。綠光進(jìn)行愈傷組織分化時(shí)的分化率最高[34]。MS培養(yǎng)基中KH2PO4濃度加倍與黑暗組合處理時(shí),對(duì)水仙小鱗莖徑圍增大有顯著影響[19]。

6 煉苗和移栽

煉苗和移栽是植物離體快繁過(guò)程的最后一步,它關(guān)系著組培苗成活率的高低。鄭春明[8]對(duì)組培苗在4種不同處理介質(zhì)中的移栽成活率進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)成活率都高于75%。楊柳燕等[11]將水仙組培苗室溫?zé)捗绾笾苯釉匀氪筇?可見(jiàn)水仙組培苗的適應(yīng)能力比較強(qiáng)。

7 中國(guó)水仙離體快繁脫毒技術(shù)的應(yīng)用

中國(guó)水仙離體快繁技術(shù)不僅可以大量快速地將具有優(yōu)良性狀的植株繁育,在其他方面也有著重要作用。如在水仙脫毒方面有重要意義,利用DHT和高溫處理會(huì)降低病毒率;利用DHT和病毒唑各30 mg/L可有效降低NMAV病毒(水仙斑駁相關(guān)病毒),且不影響試管球存活;利用DHT和病毒唑各10 mg/L可將NDV(水仙退化病毒)和NCLV病毒(水仙普通潛隱)完全去除[31]。

8 存在問(wèn)題與前景展望

與其他植物一樣,中國(guó)水仙的組織培養(yǎng)中也面臨著污染、褐化和玻璃化三大難題,此外病毒積累也是一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題,因此利用微莖尖培養(yǎng)等技術(shù)生產(chǎn)中國(guó)水仙脫毒苗是非常必要的。

由于組織培養(yǎng)生產(chǎn)成本較高,有學(xué)者用液體培養(yǎng)基[32]進(jìn)行水仙外植體震蕩培養(yǎng),不添加凝膠成分也可以獲得較佳的成果。因此探討如何在保證培養(yǎng)效果的前提下降低生產(chǎn)成本,也是今后中國(guó)水仙組織培養(yǎng)的一個(gè)研究方向。

目前中國(guó)水仙組織培養(yǎng)相關(guān)的研究報(bào)道數(shù)量不多,可運(yùn)用于生產(chǎn)的成熟的組織培養(yǎng)快繁體系尚未建立。未來(lái)需要更加重視水仙的組織培養(yǎng)相關(guān)研究,以推動(dòng)水仙生物技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)突破。