救必應(yīng)-玫瑰茄復(fù)方牙膏的抑菌功效評(píng)價(jià)

鐘漢寧 余 濤 馮 嬌

(東莞波頓香料有限公司，廣東 東莞 523403)

引言

口腔衛(wèi)生是總體健康和生活質(zhì)量的根本所在，世界衛(wèi)生組織將癌癥、心血管疾病、齲病列為嚴(yán)重威脅人類健康的三大疾病。在大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家，口腔保健知識(shí)薄弱，齲病發(fā)病率仍呈上升趨勢(shì)，世界衛(wèi)生組織官方網(wǎng)站數(shù)據(jù)顯示，全世界60%～90%的學(xué)齡兒童和近100%的成年人有齲齒[1]。牙齒菌斑中的細(xì)菌尤其是厭氧菌及其產(chǎn)物是引起牙齦炎、牙周病的主要因素，其作為始動(dòng)因子與其他因素相互聯(lián)系、相互作用，影響著牙周病的發(fā)生、發(fā)展[2]。又如，細(xì)菌因素(主要是變形鏈球菌)在引起齲病的三大因素(細(xì)菌因素、食物因素、宿主牙齒和唾液因素)中起著核心作用，即三大因素最終都是通過(guò)細(xì)菌起作用[3]。因此，在牙膏的清潔功效中，抑菌作用的研究是所必須和重要的。

1 救必應(yīng)粉末和玫瑰茄提取物的制備

1.1 救必應(yīng)粉末的制備

取500g救必應(yīng)原料粗粉，加入6倍重量的70%乙醇溶液，85℃加熱回流提取2次，每次2 h；合并濾液后減壓濃縮至適當(dāng)體積，噴霧干燥即得救必應(yīng)粗提物。

1.2 玫瑰茄提取物的制備

將100g玫瑰茄干粉碎，加入一定濃度的乙醇溶液，加熱回流提取兩次，合并兩次濾液，過(guò)濾，減壓濃縮至無(wú)醇味，離心取上清液加30%丙二醇后及得玫瑰茄提取物。

2 救必應(yīng)-玫瑰茄復(fù)方牙膏的制備

2.1 復(fù)方牙膏的試驗(yàn)配方

配方見(jiàn)表1[4]。

表1

2.2 復(fù)方牙膏的配置

按表1組成原料的重量百分比稱取各原料，將其按順溶解，利用牙膏制膏機(jī)和真空泵進(jìn)行均質(zhì)乳化，最后得所需的成品膏體[5]。將其命名為樣品JM0612。

3 牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)

3.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

AIRTECH生物安全柜、BAKER RUSKINN Concept400厭氧培養(yǎng)箱、THERMO微生物培養(yǎng)箱、牛津杯(內(nèi)徑6mm、外徑8mm、高度10mm)；腦心浸液肉湯(BHI)、BHI固體培養(yǎng)基(向BHI中加入1.5%細(xì)菌瓊脂)、TSA+5%脫纖維羊血(血瓊脂平板)。

3.2 實(shí)驗(yàn)方法

3.2.1 樣品的制備

將2.2中所得樣品JM0612稱取1g用蒸餾水溶解并定容至10mL作為100%的樣品液，以此100%樣品液依次用蒸餾水稀釋至濃度80%、60%、40%、20%、10%、5%。

3.2.2 菌懸液的制備

從-80℃冰箱里取出金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、牙齦卟啉單胞菌(ATCC BAA-038W83)、變異鏈球菌(ATCC25175)凍存管，放至在生物安全柜待其恢復(fù)至常溫。以金黃色葡萄球菌為例，接一環(huán)即10μL出來(lái)接種至固體BHI中分離純化，37℃培養(yǎng)48h。從固體BHI中挑取1個(gè)單獨(dú)菌落至200mLBHI 液體培養(yǎng)基中， 37℃培養(yǎng)48h。取1mL出來(lái)到9mL濃度為0.85%的生理鹽水中，稀釋兩次，稀釋100倍，制作成約107℃FU/mL的菌懸液待用。牙齦卟啉單胞菌和變異鏈球菌用血瓊脂平板分離純化，用厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，其他步驟同上。

3.2.3 放置牛津杯和平板培養(yǎng)

溶解BHI固體培養(yǎng)基，恢復(fù)至46℃傾注15mL于平板中待其凝固。吸取100μL菌懸液用L型涂布棒均勻涂布在平板上。用無(wú)菌鑷子夾取三個(gè)牛津杯以等腰三角形的位置放置在平板上。分別吸取200μL每濃度待測(cè)樣品加入至兩個(gè)牛津杯中，剩下一個(gè)牛津杯加0.85%的生理鹽水作對(duì)照。同一樣品兩塊平板平行對(duì)照。將加好樣的平板于37℃培養(yǎng)48h后，讀取結(jié)果。牙齦卟啉單胞菌和變異鏈球菌用血瓊脂培養(yǎng)，用厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，其他步驟同上。

3.2.4 讀取結(jié)果

用游標(biāo)卡尺量取每個(gè)抑菌圈的直徑，以毫米(mm)作單位保留兩位有效數(shù)字并記錄結(jié)果。同一樣品所對(duì)應(yīng)的兩塊平板共4個(gè)牛津杯，計(jì)算其平均抑菌圈直徑保留兩位有效數(shù)字并記錄。所得的結(jié)果見(jiàn)表2及其備注。

表2

3.3 結(jié)果分析

抑菌性能的評(píng)價(jià)為：抑菌圈<10mm為無(wú)抑菌作用，抑菌圈>10mm且<15mm的為中度抑菌，抑菌圈>15mm的為高度抑菌。從表2可見(jiàn)，抑菌圈直徑呈梯度。本實(shí)驗(yàn)中，樣品JM0612在樣品濃度為5%(即50mg/mL)時(shí)仍對(duì)S.A有良好的抑菌作用；在樣品濃度為20%(即100mg/mL)時(shí)仍對(duì)P.G有良好的抑菌作用；而對(duì)S.M的抑菌作用較弱。

4 平板稀釋法抑菌實(shí)驗(yàn)

4.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

AIRTECH生物安全柜、BAKER RUSKINN Concept400厭氧培養(yǎng)箱、THERMO微生物培養(yǎng)箱；腦BHI肉湯、BHI固體培養(yǎng)基、血瓊脂平板。

4.2 實(shí)驗(yàn)方法

4.2.1 樣品的制備

同樣是將樣品JM0612稱取1g用蒸餾水溶解并定容至10mL作為100%的樣品液。根據(jù)表2的結(jié)果，將濃度稀釋濃度至50%、25%、12.5%、6.25%。

4.2.2 菌懸液的制備

同3.2.2步驟制作成約107CFU/mL的菌懸液待用。

4.2.3 藥物平板的制備和培養(yǎng)

吸取1.5mL各濃度的樣品液至平板中，溶解BHI固體培養(yǎng)基，恢復(fù)至46℃吸取13.5mL于平板中(此操作相當(dāng)于把每個(gè)濃度再稀釋10倍，便于計(jì)算其每塊平板的用藥量)，充分搖勻平板，待其凝固。吸取0.1mL菌懸液用L型涂布棒均勻涂布在BHI固體培養(yǎng)基上。每個(gè)濃度兩塊平板作平行對(duì)照，吸取1.5mL生理鹽水+13.5BHI作空白對(duì)照。三個(gè)菌均用固體BHI培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)48h。牙齦卟啉單胞菌和變異鏈球菌用厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

4.2.4 讀取結(jié)果

記錄每塊平板上的菌落總數(shù)，以CFU作單位并記錄。同一樣品所對(duì)應(yīng)的兩塊平板的菌落總數(shù)取平均值并記錄。其結(jié)果如表3和其備注。

表3

4.3 結(jié)果分析

4.3.1 初步結(jié)果

從表3可讀取各最小抑菌濃度(MIC)。本實(shí)驗(yàn)中，樣品JM0612對(duì)S,A的MIC 12.5mg/mL；對(duì)P.G的MIC為50 mg/mL。而對(duì)S.M的MIC無(wú)法得出結(jié)果。

5 針對(duì)變異鏈球菌的復(fù)實(shí)驗(yàn)

5.1 優(yōu)化方案

步驟參照4.2.1～4.2.4，但樣品JM0612稱取2g用蒸餾水溶解并定容至10mL作為100%的樣品液。然后將其依次稀釋至75%、50%、25%，藥物平板制備時(shí)改為4mL樣品液+16mLBHI。其他步驟不變。可總結(jié)為100%用藥量為為400mg/mL、75%為300mg/mL、50%為400mg/mL、25%為100mg/mL。

5.2 復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表4和備注。

表4

5.3 復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

從表4可知，復(fù)實(shí)驗(yàn)中，樣品JM0612對(duì)S.M的MIC為300mg/mL，即可認(rèn)為表2中在樣品濃度20%(200mg/mL)時(shí)出現(xiàn)的抑菌圈，不認(rèn)為其產(chǎn)生抑菌作用。

6 討論和總結(jié)

6.1 牛津杯法和平板稀釋法的比較

牛津杯法相對(duì)容易操作，但其樣品液的滲透受各種原因的影響，如樣品液的濃度和澄清程度、瓊脂含量的多少、牛津杯插入的深度、培養(yǎng)環(huán)境的溫濕度都會(huì)造成影響，有時(shí)會(huì)發(fā)生在培養(yǎng)48h以后，樣品液沒(méi)有完全滲透到瓊脂里的情況。抑菌圈大小能直觀顯示其有抑菌效果但是無(wú)法測(cè)定最小抑菌濃度。與牛津杯法的原理相同的還有濾紙片法和牛津杯傾注法，從這種瓊脂擴(kuò)散法的結(jié)果來(lái)看，不同方法抑菌強(qiáng)弱順序并不一致，所以幾種抑菌方法同時(shí)使用時(shí)結(jié)果有可能不一致，從而造成結(jié)果難以判斷[6]。而平板稀釋法操作較為復(fù)雜，但是能夠使數(shù)值比較精準(zhǔn)。關(guān)鍵是選擇合適的樣品稀釋濃度，以及制作藥物平板時(shí)樣品和培養(yǎng)基需要充分混合均勻，使整塊平板均勻分布樣品液。此方法不僅能反應(yīng)樣品的抑菌性能，還能測(cè)定其最小抑菌濃度。

6.2 關(guān)于變異鏈球菌結(jié)果的分析

既往研究認(rèn)為，以變異鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌為代表的變異鏈球菌群是引起齲齒的主要致病菌[7,8]。因此研究牙膏對(duì)變異鏈球菌的抑菌作用非常關(guān)鍵。在本實(shí)驗(yàn)中，樣品JM0612對(duì)S.M的抑菌圈水平一般，其MIC值高達(dá)300mg/mL，這其中的因素可以進(jìn)行分析，例如提取物的抑菌成分的組成、有效抑菌成分的含量、牙膏的配方和制作、變異鏈球菌的生物作用機(jī)理[9]，菌種的血清分型、菌種的活力或變異耐藥等都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。為解決此問(wèn)題，需要查閱更多的植物提取物的文獻(xiàn)，做好實(shí)驗(yàn)室的內(nèi)部監(jiān)控計(jì)劃，以及優(yōu)化和完善抑菌實(shí)驗(yàn)方案。

6.3 牙膏評(píng)價(jià)體系及前景

中藥牙膏抑菌性能的評(píng)價(jià)是中藥牙膏功效評(píng)價(jià)體系的重要支柱。而中藥牙膏功效評(píng)價(jià)體系的建立，減少了以往臨床實(shí)驗(yàn)的周期，及時(shí)掌握牙膏的真實(shí)效果，有效地縮短研發(fā)和推廣周期，在牙膏同質(zhì)化、競(jìng)爭(zhēng)白熱化階段，將有較好的應(yīng)用前景[10]。此外，無(wú)機(jī)抗菌牙膏技術(shù)具有長(zhǎng)效、刺激性小、毒副作用小、不產(chǎn)生耐藥菌株的特點(diǎn)。生物抗菌牙膏技術(shù)具有顯著的消炎、殺菌等作用，可作為抗生素的替代品[11]。總而言之，牙膏的技術(shù)研究，評(píng)價(jià)體系的建立是推動(dòng)行業(yè)科技發(fā)展進(jìn)入高質(zhì)量、規(guī)范化、國(guó)家化新階段的必由之路。