口腔微生態(tài)的研究進(jìn)展及益生菌在口腔護(hù)理中的應(yīng)用研究

陳敏珊 鄭 娟 李 平

(廣州薇美姿實(shí)業(yè)有限公司，廣東 廣州 510665)

引言

人體口腔環(huán)境是由多種微生物集合形成的復(fù)雜的微生物系統(tǒng)，口腔中的微生物包括：細(xì)菌、真菌、原蟲、支原體、病毒等，口腔中的細(xì)菌種類超過(guò)700種?？谇晃⑸锿ㄟ^(guò)共生、競(jìng)爭(zhēng)、拮抗等相互作用達(dá)到一個(gè)口腔微生態(tài)的平衡。只有微生物群落之間與微生物群落與宿主之間維持生態(tài)平衡才能保持口腔健康。當(dāng)有外來(lái)微生物進(jìn)入口腔或者口腔環(huán)境中固有的某些微生物在口腔中過(guò)量生長(zhǎng)，逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌群，打破了口腔微生態(tài)的平衡，進(jìn)而導(dǎo)致口腔疾病的發(fā)生。

在20世紀(jì)后期，尤其是在發(fā)達(dá)國(guó)家，主要采用口服抗生素的化學(xué)療法來(lái)治療細(xì)菌感染性疾病。但是長(zhǎng)期服用抗生素不僅會(huì)破壞口腔生態(tài)平衡，同時(shí)也會(huì)加劇細(xì)菌耐藥性問題的嚴(yán)重性。

隨著關(guān)于益生菌方面研究的逐漸開展，研究者已經(jīng)證實(shí)了益生菌可以用于防治腸道感染、泌尿系統(tǒng)感染等方面，同時(shí)這種防治疾病的方式也逐漸被應(yīng)用到口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。益生菌療法不僅可以通過(guò)不同機(jī)制抑制致病菌的生長(zhǎng)，同時(shí)還能維持正常的口腔微生態(tài)菌群，保障口腔健康。

1 口腔微生態(tài)的研究進(jìn)展

微生態(tài)系是指在宿主一定結(jié)構(gòu)的空間內(nèi)，正常微生物群以宿主組織和細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物為環(huán)境，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的能獨(dú)立進(jìn)行物質(zhì)、能量及基因相互交流的統(tǒng)一的生物系統(tǒng)。人是由自己的細(xì)胞和微生物細(xì)胞組成的，人類與許多細(xì)菌保持著永久的和親密的關(guān)系。在人體內(nèi)部的表面上寄居者數(shù)以萬(wàn)計(jì)的細(xì)菌，這些寄住在人體各特殊部位或表面的生物群被稱為正常菌叢(normal flora)，或稱為固有菌叢。正常菌叢中的成員可稱之為常居菌或固有菌。迄今尚無(wú)關(guān)于人體內(nèi)固有菌叢精確數(shù)量的報(bào)道，據(jù)保守估計(jì)，其總數(shù)多于人體細(xì)胞的總數(shù)，人體細(xì)胞數(shù)約為1013個(gè)，而人體內(nèi)細(xì)菌數(shù)約為1014個(gè)。這些常居菌的大多數(shù)寄居在口腔、腸道中，口腔正常菌叢之間以及它們與宿主之間的相互作用成為口腔生態(tài)系(oral ecosystem)。許多正常菌叢和其宿主之間呈動(dòng)力的平衡狀態(tài)(dynamic equilibrium)，這些共生微生物通過(guò)抵抗病原體而有助于宿主健康，維持體內(nèi)平衡并調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[1]。

1.1 口腔微生態(tài)的組成

口腔微生態(tài)作為微生態(tài)學(xué)的一個(gè)重要分支，主要由宿主固有口腔環(huán)境和口腔微生物構(gòu)成?？谇皇且粋€(gè)復(fù)雜而完整的微生態(tài)系統(tǒng)?？谇还逃协h(huán)境主要包括口腔的物理化學(xué)特征，如口腔溫度、濕度、pH值等，以及口腔各部位的解剖形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)。定植于口腔的微生物主要包括細(xì)菌、真菌、螺旋體、支原體、病毒及原蟲等，這些微生物在口腔的不同部位共棲、競(jìng)爭(zhēng)和拮抗，與口腔固有環(huán)境共同構(gòu)成了口腔微生態(tài)系統(tǒng)，形成一種動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系。

1.1.1 固有口腔環(huán)境

1.1.1.1 物理化學(xué)特征

口腔環(huán)境的物理化學(xué)特征包括：口腔溫度、濕度、pH值、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝等?？谇粶囟燃s為37℃，口腔細(xì)菌大多屬嗜溫微生物，這為細(xì)菌的生長(zhǎng)提供了適宜的溫度條件?？谇画h(huán)境潮濕，這可能是口腔微生物復(fù)雜的條件之一。大多數(shù)口腔細(xì)菌都生長(zhǎng)在pH值為7的中性環(huán)境中，而口腔可提供一個(gè)相對(duì)恒定的中性pH值環(huán)境，這為口腔中細(xì)菌的定植生長(zhǎng)提供了良好的基礎(chǔ)，但口腔與外環(huán)境相通，其pH值易受到外源性物質(zhì)干擾而改變, 從而對(duì)口腔微生態(tài)產(chǎn)生影響。此外，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝產(chǎn)酸，在某些口腔疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也起重要作用。

1.1.1.2 口腔各部位的解剖形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)

口腔的特殊解剖形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)參與了口腔微生態(tài)的組成?？谇恢写嬖谥鞣N不同的表面，并且各有特征，如黏膜表面就有舌、牙齦上皮、齦溝上皮、頰上皮和腭上皮等幾種不同類型；硬組織有牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)和用于修復(fù)的各種不同的材料等幾種不同的類型。由于結(jié)構(gòu)不同，造成口腔不同部位的氧含量有很大差異，如舌背和頰黏膜主要為有氧環(huán)境，牙周袋內(nèi)為乏氧環(huán)境，這導(dǎo)致了口腔不同部位菌群分布的差異。同時(shí)口腔分泌唾液，會(huì)影響口腔pH值，唾液中含有的酶和抗體等，也構(gòu)成口腔微生態(tài)的一部分。這些部位的局部解剖、組織結(jié)構(gòu)和表面化學(xué)對(duì)于細(xì)菌在口腔中的定植選擇起著很大的作用。

1.1.2 口腔微生物

美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)啟動(dòng)了人類微生物組計(jì)劃(HMP)，以表征人類微生物組更完整并確定關(guān)聯(lián)微生物組變化與健康/疾病之間的關(guān)系?？谇晃⑸锸侨祟愇⑸锝M的重要組成部分之一，尤其是人類口腔中的微生物。口腔被認(rèn)為是人體中第二大復(fù)雜的微生物群，僅次于結(jié)腸[2]?？谇晃⑸锝M高度多樣化，研究發(fā)現(xiàn)，定植于口腔的微生物，主要以細(xì)菌為主，目前從口腔中分離和鑒定的細(xì)菌種類已經(jīng)超過(guò)700多種(AaS，2005)，分屬11個(gè)不同的菌屬，是人體最復(fù)雜的微生物集群之一[3]。其中，大約有54%的菌株已經(jīng)被培養(yǎng)和命名，有14%的菌株被培養(yǎng)但未命名，還有32%的菌株被稱為未培養(yǎng)的系統(tǒng)型(來(lái)自人類口腔微生物組數(shù)據(jù)庫(kù))。越來(lái)越多的研究表明，口腔微生物群在許多口腔和全身性疾病的發(fā)病和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。

Miller首次提出關(guān)于齲齒發(fā)生的“化學(xué)細(xì)菌學(xué)說(shuō)”，他認(rèn)為牙菌斑生物膜由微生物組成。根據(jù)發(fā)生部位與齦緣的關(guān)系，牙菌斑可分為齦上菌斑和齦下菌斑，齦上菌斑以革蘭陽(yáng)性鏈球菌為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，構(gòu)成了牙齒平滑面的微生物群落。齦下菌斑以革蘭陰性厭氧菌為優(yōu)勢(shì)菌，它們?cè)谘乐艽鼉?nèi)形成群落并可導(dǎo)致牙周病[4]。

口腔微生態(tài)系的平衡和失調(diào)與口腔的健康和疾病密切相關(guān)[5]。一般正常菌群對(duì)機(jī)體也具有雙重作用，在一定環(huán)境中，當(dāng)機(jī)體與正常菌叢之間保持著相互平衡的狀態(tài)時(shí)，正常菌叢顯示對(duì)宿主起著有益的作用；但當(dāng)環(huán)境中的某些因素干擾了這個(gè)平衡狀態(tài)時(shí)，如放射線照射、過(guò)量激素的應(yīng)用、抗生素的長(zhǎng)期使用等而導(dǎo)致菌群失調(diào)，這就為正常菌群提供了顯示其有害作用的機(jī)會(huì)，這些原來(lái)無(wú)致病性的或毒力很弱的細(xì)菌，遂成為機(jī)會(huì)致病菌而引起內(nèi)源性感染疾病，如長(zhǎng)期服用抗生素所致的葡萄球菌假膜腸炎、口腔中的念珠菌病。

2 口腔微生態(tài)與疾病

2.1 齲齒

齲齒是最常見的口腔疾病之一，是導(dǎo)致口腔疼痛和牙齒脫落的主要原因。齲齒是由產(chǎn)酸細(xì)菌和可發(fā)酵碳水化合物之間的復(fù)雜相互作用引起的。通常情況下，大量碳水化合物的攝入會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)酸增加，唾液緩沖能力降低和低pH值的口腔環(huán)境。環(huán)境酸化是齲齒發(fā)展過(guò)程中微生物菌群表型和基因型變化的主要原因[6]。其中變形鏈球菌和乳桿菌經(jīng)深入研究，被認(rèn)為是齲齒中的特定病原體。然而，最近的研究表明，變形鏈球菌不僅在齲齒的早期以高水平存在，而且在一些健康的個(gè)體中也存在[7,8]。而且在一些患者中，變形鏈球菌和乳桿菌在一些齲齒樣本中含量低或不存在[9]。這些結(jié)果表明，齲齒病變的發(fā)生和發(fā)展不能完全歸因于這些微生物，齲齒是一種細(xì)菌性疾病，是由復(fù)雜的群落而不是單一的病原體引起的。Aas等報(bào)道了維永氏菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、丙酸桿菌屬、變形鏈球菌、放線菌屬和擬南芥屬在齲齒進(jìn)展中也起著關(guān)鍵作用[10]。除產(chǎn)酸細(xì)菌外，某些細(xì)菌還可以從精氨酸和尿素中產(chǎn)生氨，從而提高pH值，從而影響口腔生物膜的pH穩(wěn)態(tài)，并可能減緩齲齒的發(fā)生和發(fā)展[11]。

2.2 牙周疾病

牙齦炎是成年人中最常見和最普遍的牙周疾病，是由牙齦邊緣形成的細(xì)菌菌斑引起的可逆性炎癥疾病。如果不加以控制，牙齦炎將發(fā)展為牙周炎。牙周炎是一種慢性、不可逆的炎癥性疾病，在此過(guò)程中，免疫細(xì)胞的慢性浸潤(rùn)導(dǎo)致結(jié)締組織破壞，血管增生和肺泡骨破壞[12]。微生物群落組成的變化導(dǎo)致宿主-微生物相互作用發(fā)生變化，從而引發(fā)破壞性炎癥和骨質(zhì)流失。牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)，牙垢螺旋體(T. denticola)和連翹坦氏菌(T. forsythia)在歷史上被定義為“紅色復(fù)合物”，盡管這些細(xì)菌在健康個(gè)體中可能很少見，但它們被認(rèn)為與牙周炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

2.3 復(fù)發(fā)性口瘡性口炎

復(fù)發(fā)性口瘡性口炎(RAS)是最常見的口腔粘膜疾病，約占總?cè)丝诘?0%[13]。該疾病的特征是極度疼痛的復(fù)發(fā)性口腔潰瘍。越來(lái)越多的證據(jù)表明，RAS與粘膜和唾液微生物群的營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)。 Marchini等[14]發(fā)現(xiàn)普雷沃氏菌僅存在于RAS患者的粘膜微生物群中，而不存在于健康受試者中。Seoudi等對(duì)黏膜微生物群的研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，RAS患者中放線菌屬，尤其是羅思氏菌屬的水平更高[15]。

2.4 口腔腫瘤

越來(lái)越多的證據(jù)表明口腔微生物群可能在口腔腫瘤的發(fā)展中起作用?？谇击[狀細(xì)胞癌(OSCC)是口腔表皮的最常見的惡性腫瘤。 Nagy等用培養(yǎng)依賴性法檢查了同一患者的口腔腫瘤和健康粘膜表面，發(fā)現(xiàn)口腔腫瘤表面具有大量的需氧和厭氧菌[16]?？谇晃⑸锝M中的這些可觀察到的差異可能具有作為監(jiān)測(cè)口腔腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物的潛力?？谇晃⑸锶涸诳谇话┌l(fā)病機(jī)理中的作用尚不明確，專家們目前推測(cè)了幾種機(jī)制。首先，細(xì)菌可以引起慢性炎癥反應(yīng)，在該過(guò)程中產(chǎn)生的慢性炎性介質(zhì)引起或促進(jìn)細(xì)胞增殖、誘變、致癌基因激活和血管生成；其次，細(xì)菌可能通過(guò)使用3型或4型分泌系統(tǒng)(T3SS / T4SS)分泌細(xì)菌效應(yīng)蛋白而直接影響癌癥的發(fā)病機(jī)制，這可能會(huì)影響細(xì)胞增殖、細(xì)胞骨架重排、NF-KB的活化以及對(duì)細(xì)胞的抑制細(xì)胞凋亡；第三，細(xì)菌可能產(chǎn)生某些致癌物質(zhì)，例如細(xì)菌將乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛(一種公認(rèn)的致癌物)。

3 口腔微生物群和系統(tǒng)疾病

3.1 糖尿病

糖尿病和牙周炎之間存在雙向關(guān)系。牙周炎被認(rèn)為是糖尿病控制不力的并發(fā)癥之一。已有多項(xiàng)研究探索了糖尿病對(duì)口腔微生物群的影響。 Hintao等[17]報(bào)道指出，與非糖尿病受試者相比，糖尿病受試者的齦上菌斑具有較高的齒垢密螺旋體、尼古拉斯暴食桿菌、血鏈球菌、口頭鏈球菌和中間鏈球菌水平。在另一項(xiàng)研究中，糖尿病患者和非糖尿病患者的齦下微生物群存在顯著差異[18]。另外，牙周炎相關(guān)細(xì)菌增加了血糖控制的難度。牙齦卟啉單胞菌(一種主要的牙周炎病原體)產(chǎn)生的脂多糖(LPS)可以通過(guò)刺激某些炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)介導(dǎo)胰島素抵抗并損害胰島素活性[19]。

3.2 心血管疾病

微生物感染是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，與牙周病原體密切相關(guān)。 Koren等人的研究結(jié)果表明，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中韋榮菌和鏈球菌的豐度與其在口腔中的豐度有關(guān)[20]。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中還檢出了一些口腔微生物，包括牙齦卟啉單胞菌、放線桿菌集合桿菌、連翹腸桿菌、核小腸彎曲桿菌和直彎曲菌[21,22]。近年來(lái)已經(jīng)有專家提出了幾種可能的機(jī)制來(lái)解釋牙周炎和心血管疾病之間的關(guān)系。通常，宿主長(zhǎng)時(shí)間接觸牙周病原體是主要原因。微生物通過(guò)口腔組織進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，并進(jìn)入動(dòng)脈分泌LPS和炎性介質(zhì)，從而導(dǎo)致心血管并發(fā)癥，如血管內(nèi)皮損傷、血小板聚集、平滑肌增殖和脂質(zhì)沉積[23]。

3.3 遠(yuǎn)處器官的腫瘤

口腔微生物也參與其他器官腫瘤的發(fā)生?？谇晃⑸镆鸬募?xì)胞因子和其他炎性介質(zhì)的增加可能與癌癥發(fā)展的免疫相關(guān)機(jī)制有關(guān)。 Shiga等有報(bào)道稱，鏈球菌(S. anginosus)感染可能與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[24]。 Narikiyo等。用與培養(yǎng)無(wú)關(guān)的分子方法檢查了唾液，發(fā)現(xiàn)口腔牙周病螺旋體T. denticola，鏈霉菌和鏈球菌與食管癌有關(guān)[25]。此外，胰腺癌患者和健康對(duì)照者之間的長(zhǎng)條狀奈瑟氏球菌和鏈霉菌比例明顯不同[26]。

4 口腔微生物群調(diào)節(jié)

考慮到口腔微生物在口腔和全身性疾病的病因和發(fā)病機(jī)制中的作用，其關(guān)鍵是改善口腔對(duì)病原體的保護(hù)并維持口腔微生態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡。研究微生物群落之間的相互作用是對(duì)抗口腔病原體的關(guān)鍵。如果在營(yíng)養(yǎng)利用或環(huán)境管理中沒有粘附受體并且沒有合適的伴侶細(xì)菌進(jìn)行代謝合作，則可能會(huì)排除掉潛在的病原體。另一方面，某些特定的微生物，例如牙齦卟啉單胞菌，被定義為關(guān)鍵病原體，可以改變環(huán)境，改變生態(tài)內(nèi)其他微生物的比例。

4.1 機(jī)械清創(chuàng)術(shù)

當(dāng)前的療法主要旨在通過(guò)機(jī)械方法減少病原微生物的數(shù)量。自行清除牙菌斑，例如刷牙，可以改善牙菌斑的控制水平。專業(yè)去除斑塊，包括洗牙、根部計(jì)劃和牙周手術(shù)，可以減少病原細(xì)菌的數(shù)量和比例，并重新建立口腔菌群的生態(tài)平衡。通常，在牙周治療后，與深度大于4mm的囊袋相關(guān)的微生物會(huì)降低到非常低的水平，甚至無(wú)法檢測(cè)到。機(jī)械清創(chuàng)后，牙周炎患者的牙周病原體，如牙齦卟啉單胞菌，連翹坦氏菌(T. forsythensis)，齒狀坦索菌和密螺旋體也明顯減少了[27]。但是，牙齒解剖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和手術(shù)區(qū)域的局限性為徹底清除牙菌斑帶來(lái)了挑戰(zhàn)和困難。機(jī)械手段是非特異性的，因此也可以去除有益細(xì)菌。更重要的是，機(jī)械清創(chuàng)后微生物豐富度和生物多樣性顯著降低，從某種意義上說(shuō)，這對(duì)口腔健康是不利的。

4.2 抗生素使用

抗生素旨在針對(duì)動(dòng)物和人類中的特定病原細(xì)菌。在牙科領(lǐng)域使用抗生素的適應(yīng)癥是有限的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)口腔疾病可以通過(guò)手術(shù)干預(yù)和口腔衛(wèi)生措施得到最佳控制。在牙科領(lǐng)域中，局部使用抗生素通常比全身使用更可取，因?yàn)樗梢源蟠笤黾雍统掷m(xù)增加溝液中的藥液濃度，并減少全身性不良副作用。抗生素常被用作機(jī)械治療牙周炎的輔助手段，特別是在常規(guī)治療失敗和治療發(fā)病較快的疾病的情況下。但是，應(yīng)該注意的是，牙科實(shí)踐中使用抗生素的特征是基于臨床和細(xì)菌流行病學(xué)因素的經(jīng)驗(yàn)處方，導(dǎo)致短期內(nèi)僅使用非常窄范圍的廣譜抗生素，這種方法導(dǎo)致了多種微生物的抗藥性的發(fā)展，并導(dǎo)致了常用抗生素的無(wú)效。據(jù)報(bào)道，在使用阿莫西林的幼兒中，對(duì)阿莫西林耐藥的口腔細(xì)菌的數(shù)量明顯高于未使用阿莫西林的兒童。有效使用抗生素可能需要對(duì)患者口腔微生物組進(jìn)行基因組分析，以鑒定目前的微生物并確定它們是否會(huì)對(duì)特定治療產(chǎn)生反應(yīng)。

4.3 益生菌和益生元

為了克服這些傳統(tǒng)干預(yù)方法的局限性，目前已經(jīng)有了新的口腔微生物群調(diào)節(jié)方案，例如益生菌和益生元。益生菌在促進(jìn)健康方面是眾所周知的，并已得到廣泛研究。國(guó)際科學(xué)協(xié)會(huì)已將“益生菌”一詞定義為“當(dāng)以適當(dāng)量施用時(shí)，對(duì)宿主具有健康益處的活微生物”[28]。關(guān)于益生菌的作用機(jī)制，主要有以下幾種觀點(diǎn)：益生菌能夠分泌有機(jī)酸、過(guò)氧化氫和細(xì)菌素等多種抗菌物質(zhì)，從而抑制致病菌的生長(zhǎng)；它還能夠與致病菌競(jìng)爭(zhēng)黏膜表面的結(jié)合位點(diǎn)，減少致病菌的定植；可通過(guò)調(diào)整pH值和氧化-還原反應(yīng)電位，改變微生態(tài)環(huán)境，使之維持在適宜的范圍內(nèi)；還有可能通過(guò)刺激非特異性的免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)體液免疫與細(xì)胞免疫，來(lái)發(fā)揮其益生作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，除鼠李糖乳桿菌外，唾液乳桿菌、雙歧桿菌、羅伊氏乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌已被證實(shí)能夠減少致齲菌的數(shù)量，從而預(yù)防齲齒。

越來(lái)越多的研究支持益生菌療法預(yù)防或治療牙齦炎和牙周炎。Krasse等有報(bào)道稱食用含羅伊氏乳桿菌的口香糖可以減少牙齦出血并減少牙齦炎；Iniesta等人進(jìn)一步評(píng)估了羅伊氏乳桿菌。在患牙齦炎的情況下，發(fā)現(xiàn)齦下微生物群中的牙齦卟啉單胞菌數(shù)減少；對(duì)于牙周炎，羅伊氏乳桿菌可降低牙齦指數(shù)、牙菌斑指數(shù)、探查囊袋深度和臨床附著水平，并降低牙周病原體(A.放線菌，中間媒介和齒齦假單胞菌)的水平[29]。另外，干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、唾液乳桿菌和某些芽孢桿菌屬菌種也被評(píng)估為牙周病的益生菌。

益生元是不易消化的低聚糖，并已被證明可以輔助益生菌治療口腔疾病。益生元可以刺激有益細(xì)菌的生長(zhǎng)和活性，同時(shí)抑制潛在有害細(xì)菌的生長(zhǎng)和活性。它們還可以改善粘膜屏障功能、宿主免疫力并增強(qiáng)短鏈脂肪酸的產(chǎn)生。乳糖、菊粉、低聚果糖、半乳糖低聚糖和木糖均是腸道中廣泛使用的常見益生元，而口腔中使用的益生元的研究卻非常有限。糖和膳食纖維被認(rèn)為是腸道乳酸菌的益生元，不適合口腔環(huán)境。一些潛在的口服益生元，如木糖醇和阿拉伯糖可以抑制變形鏈球菌的生長(zhǎng)，但也被用于某些乳酸菌菌株的生長(zhǎng)。鑒于缺乏一些完美的口服益生元，越來(lái)越多的研究試圖鑒定新的益生元。一些口腔微生物，例如加氏乳桿菌、唾液乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和雙歧桿菌在健康的口腔生態(tài)系統(tǒng)中更為流行。因此，被認(rèn)為促進(jìn)這些微生物生長(zhǎng)的益生元方法也可以促進(jìn)牙周健康。益生菌和益生元可能是預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病的更好方法，因?yàn)樗鼈兛梢栽谠缙陔A段恢復(fù)生態(tài)平衡或恢復(fù)口腔微生物群的生物多樣性[30]。但是，重要的是要了解口服微生物組與益生菌之間的相互作用，以及口服益生菌的確切作用方式。此外，需要進(jìn)行更多的研究來(lái)評(píng)估益生菌在口腔中的功效和安全性。

4.4 其他調(diào)節(jié)方式

除上述方法外，還有其他一些口腔微生物群調(diào)節(jié)方案的研究?；蚬こ坍a(chǎn)生的無(wú)毒變形鏈球菌已在體外進(jìn)行了研究，并被認(rèn)為可用于控制齲齒。在最近的研究中，Ren等人描述了一種靶向葡糖基轉(zhuǎn)移酶的化合物，葡糖轉(zhuǎn)移酶是變形鏈球菌的主要毒力因子，在體外和體內(nèi)均可抑制生物膜的形成和變形鏈球菌的致齲性[29]。噬菌體是一種病毒，可以通過(guò)侵染細(xì)菌細(xì)胞，破壞其新陳代謝并引起裂解來(lái)特異性靶向并破壞引起疾病的細(xì)菌。目前已有研究提出使用噬菌體來(lái)控制產(chǎn)酸細(xì)菌，例如嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)，以抵抗齲齒的發(fā)展。此外，已經(jīng)設(shè)計(jì)和開發(fā)了許多靶向治療系統(tǒng)來(lái)治療口腔疾病，例如纖維、條、薄膜和納米顆粒。結(jié)合這些新型藥物的治療方法，對(duì)口腔微生物群的調(diào)節(jié)將是非常有希望更有效地治療口腔疾病。

總體而言，口腔微生態(tài)作為人體微生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，在維持人類健康方面起著至關(guān)重要的作用。口腔微生物群的改變可能與口腔疾病和全身性疾病密切相關(guān)。目前對(duì)口腔微生態(tài)的研究還處在萌芽狀態(tài)，關(guān)于口腔微生物群在疾病發(fā)生和發(fā)展中的作用的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。未來(lái)準(zhǔn)確確定健康和疾病中關(guān)鍵口腔微生物群的研究將有助于更好地開發(fā)有效的口腔微生物群調(diào)節(jié)工具。雖然已經(jīng)探索和開發(fā)了許多用于調(diào)節(jié)口腔微生物群的新興策略。即使這樣，仍需要進(jìn)行更多的研究來(lái)評(píng)估這些方法的有效性和安全性。

5 益生菌在口腔護(hù)理中的應(yīng)用研究

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，益生菌不僅可以調(diào)節(jié)腸道菌群，而且還能夠改善口腔菌群，從而在口腔健康的維護(hù)、口腔疾病的預(yù)防和治療方面都發(fā)揮積極的作用。1985 年，Ishihara 等發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌、唾液乳桿菌等乳酸菌的胞外水溶性成分能夠在體外有效抑制口腔致病菌變異鏈球菌的生長(zhǎng)[31]。隨后的研究證實(shí)，包括乳酸乳球菌、唾液鏈球菌、雙歧桿菌在內(nèi)的多株乳酸菌都具有類似的口腔菌群調(diào)節(jié)功能。這些研究均為益生菌在口腔健康維護(hù)上發(fā)揮更重要作用提供了可能。目前研究已經(jīng)證明，益生菌通過(guò)對(duì)致病菌的抑制可預(yù)防牙周炎、齲齒、口臭等多種疾病。

5.1 人體口腔益生菌篩選

5.1.1 口腔益生菌種類

目前，口腔中的益生菌主要有乳酸桿菌(Lactobacillus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)和腸球菌(Enterococcus)，其中雙歧桿菌為專性厭氧菌在口腔中的應(yīng)用研究相對(duì)較少。乳酸桿菌多為兼性厭氧菌，適合在口腔中存活定植也是被研究得最多的益生菌種類，主要有植物乳桿菌(L. lantarum)、唾液桿菌(L. salivarius)、發(fā)酵乳桿菌(L. fermentum)、鼠李糖乳桿菌(L. rhamnosus)、嗜酸乳桿菌(L. acidophilus)、副干酪乳桿菌(L. paracasei)和羅伊氏乳桿菌(L. reuteri)。此外，屎腸球菌在口腔中也有相關(guān)研究。

5.1.2 口腔益生菌選擇條件

目前，國(guó)內(nèi)外的益生菌制品種類繁多并形成了產(chǎn)業(yè)規(guī)模，尤其是日本和歐盟，在中國(guó)的發(fā)展也是日新月異。應(yīng)用方面，在食品、保健品、藥品等領(lǐng)域已有多種益生菌制劑問世，其中在食物中的應(yīng)用更為廣泛，利用益生菌防治口腔疾病的研究正逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。理想的口腔用益生菌需具備特定的性能，如圖1所示，根據(jù)這些特點(diǎn)可在眾多益生菌制劑中選擇適宜的益生菌，用于口腔護(hù)理產(chǎn)品研究開發(fā)。

圖1 理想口腔益生菌應(yīng)具備特性

隨著對(duì)益生菌制劑的深入研究，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)活菌制劑存在一些潛在的安全隱患，如：菌體突變，菌體可能因變異而產(chǎn)生一定的毒性;非正常部位轉(zhuǎn)移，菌體可能離開腸道、口腔等正常的定植部位，進(jìn)入機(jī)體的其它部位進(jìn)行繁殖(血液、胸腔等)，引起病變；抗藥性基因轉(zhuǎn)移，可能會(huì)增加致病菌杭藥性的危險(xiǎn)。尤其對(duì)一些免疫力低下的病人而言，服用活茵制劑很容易引起病理反應(yīng)。國(guó)際微生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)(IUMS)通過(guò)臨床資料解釋和推斷，乳桿菌及其相關(guān)微生物依然存在一定的危險(xiǎn)性，見表1[32]。與此同時(shí)，由于需要維持一定數(shù)量的活菌，活茵制劑的生產(chǎn)保存均較為困難，質(zhì)量穩(wěn)定性不高。為此，本文在后續(xù)的功效評(píng)價(jià)模型和產(chǎn)品開發(fā)中所采用的益生菌均為滅活的益生菌凍干粉。

表1 益生菌的安全性

5.2 益生菌對(duì)口腔致病菌生長(zhǎng)抑制作用評(píng)價(jià)模型建立

益生菌的作用機(jī)制主要有①黏附機(jī)制：益生菌通過(guò)黏附占據(jù)口腔黏膜上的結(jié)合點(diǎn)，從而減少口腔致病菌在口腔環(huán)境中的定植；②聚集和生物膜的形成機(jī)制：益生菌通過(guò)自聚集、共聚集與形成生物膜從而抑制致病菌的生長(zhǎng)、形成阻止致病菌定植和感染的屏障；③免疫調(diào)節(jié)機(jī)制：益生菌的產(chǎn)物及其菌體成分能夠激活免疫應(yīng)答，當(dāng)益生菌進(jìn)入宿主中，宿主免疫系統(tǒng)的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種效應(yīng)細(xì)胞被激活，使其釋放出多種細(xì)胞因子，從而提高機(jī)體自身等防御功能。

5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料

①滅活的益生菌凍干粉；

②口腔厭氧致病菌：牙齦卟啉單胞菌、變異鏈球菌以及具核梭桿菌。

5.2.2 口腔厭氧致病菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

①口腔厭氧致病菌活化：牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、變異鏈球菌-20℃菌種(10mL西林瓶)→4℃溶解(約30min可融化)→2mL一次性無(wú)菌注射器吸取少量菌液(幾滴)滴在BHIA平板， 37℃厭氧培養(yǎng)48h。

②吸光度測(cè)量：挑取平板上單菌落接種到10mL BHI試管中，37℃厭氧培養(yǎng)一定時(shí)間段，取樣，于紫外可見分光光度計(jì)600nm波長(zhǎng)條件下測(cè)量吸光度；

③生長(zhǎng)曲線繪制：以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，以對(duì)應(yīng)吸光度值為縱軸繪制曲線。

5.2.3 益生菌對(duì)口腔致病菌生長(zhǎng)抑制作用測(cè)定

①益生菌吸光度調(diào)整：益生菌液滅活后，取10mL菌液經(jīng)4000rpm，15min離心分離收集菌體，用2mL PBS洗滌兩次后于10mL PBS中重懸；適當(dāng)稀釋調(diào)整菌懸液吸光度A600為0.20～0.30范圍內(nèi)。

②將已調(diào)整吸光度的益生菌液與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的致病菌液等量混合，分別在0h、2h、4h、6h、20h、24h，使用吸光度法測(cè)定致病菌的生長(zhǎng)曲線，以△OD表示?！鱋D增長(zhǎng)越慢，抑制作用越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)以沒有添加益生菌的致病菌的為對(duì)照組。

5.2.4 益生菌A和益生菌B對(duì)口腔致病菌生長(zhǎng)抑制作用

圖2 滅活益生菌對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)抑制作用

圖3 滅活益生菌對(duì)牙齦卟啉單胞菌生長(zhǎng)抑制作用

從圖2及圖3可以看出，益生菌A和B對(duì)兩種致病菌的生長(zhǎng)均有明顯抑制作用。

5.3 口腔益生菌對(duì)口腔致病菌凝集作用評(píng)價(jià)方法建立

5.3.1 實(shí)驗(yàn)材料

①滅活益生菌；

②口腔厭氧致病菌：牙齦卟啉單胞菌、變異鏈球菌以及具核梭桿菌。

5.3.2 口腔厭氧致病菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

①口腔厭氧致病菌活化：牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、變異鏈球菌-20℃菌種(10mL西林瓶)→4℃溶解(約30min可融化)→2mL一次性無(wú)菌注射器吸取少量菌液(幾滴)滴在BHIA平板，37℃厭氧培養(yǎng)48h。

②吸光度測(cè)量：挑取平板上單菌落接種到10mL BHI試管中，37℃厭氧培養(yǎng)一定時(shí)間段，取樣，于紫外可見分光光度計(jì)600nm波長(zhǎng)條件下測(cè)量吸光度；

③生長(zhǎng)曲線繪制：以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，以對(duì)應(yīng)吸光度值為縱軸繪制曲線。

5.3.3 益生菌對(duì)口腔致病菌凝集作用測(cè)定

①益生菌吸光度調(diào)整：益生菌液滅活后，取10mL菌液經(jīng)4000rpm，15min離心分離收集菌體，用2mLPBS洗滌兩次后于10mLPBS中重懸；適當(dāng)稀釋調(diào)整菌懸液吸光度A600為0.20～0.30范圍內(nèi)。

②將已調(diào)整吸光度的益生菌液與處于平臺(tái)期的致病菌液等量混合，分別在4h和24h，使用吸光度法測(cè)定致病菌的上清液濁度變化，以△OD表示。

△OD為負(fù)值，表示細(xì)胞發(fā)生了聚集，△OD數(shù)值越小，表示共聚集作用越強(qiáng)。

益生菌存在自凝集作用，測(cè)定益生菌自凝集數(shù)據(jù)用于校正。實(shí)驗(yàn)以沒有添加益生菌的致病菌的為對(duì)照組。

5.3.4 唾液乳桿菌A和B對(duì)口腔致病菌凝集作用

圖4 滅活益生菌對(duì)變異鏈球菌的共聚集作用

圖5 滅活益生菌對(duì)牙齦卟啉單胞菌的共聚集作用

選取滅活的益生菌A和B兩種益生菌，采用上述凝集作用測(cè)試方法，測(cè)試其與牙齦卟啉單胞菌以及變異鏈球菌的共聚集作用，結(jié)果如圖4、圖5所示。

從圖4、圖5看出，靜置4小時(shí)后致病菌上清液濁度增加，而添加益生菌的致病菌中，上清液濁度明顯下降，即發(fā)生了共聚集作用。靜置24小時(shí)后，致病菌上清液的濁度下降，而添加益生菌的致病菌上清液濁度下降程度更大。說(shuō)明滅活益生菌對(duì)兩種致病菌均有較強(qiáng)的凝集作用。

5.4 益生菌牙膏抑菌作用評(píng)價(jià)方法

5.4.1 實(shí)驗(yàn)材料

①菌種：牙齦卟啉單胞菌(ATCC 33277)和變異鏈球菌(ATCC25175)。

②培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)，胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基(TSB)。

③儀器耗材：生物安全柜(HR-II-A2)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(LT-CPS38D)、微量移液器(NPX-1000、NPX-100)、漩渦混合器(XW-80A)、一次性塑料培養(yǎng)皿(9×1.5 cm)、恒溫培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z)、牛津杯(10×8×6 mm)、玻璃試管(15×150 mm)、玻璃推棒等；

④益生菌牙膏(采用二氧化硅體系的牙膏配方制備的牙膏)。

5.4.2 菌懸液的準(zhǔn)備

①將細(xì)菌接種在TSA斜面培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接2次；

②用1mL滅菌生理鹽水(0.85%)將上述斜面洗脫，裝于10mL滅菌離心管中，作為初始菌液(100)，4℃保藏備用。

③用微量移液器吸取菌懸液1mL于9mL無(wú)菌生理鹽水中，振蕩混勻，此稀釋倍數(shù)為1∶10。用移液器吸取10倍稀釋菌液1mL于9mL無(wú)菌生理鹽水中，此即100倍稀釋。其余以此類推，稀釋到10～12梯度；

④選取合適的梯度，按照《化妝品衛(wèi)生規(guī)范(2007版)》分別進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

5.4.3 牛津杯的準(zhǔn)備

①牛津杯若干個(gè)，置于100mL血清瓶中，于121℃，滅菌20min，烘干；

②使用前，將牛津杯置于玻璃皿中，加入少許無(wú)水乙醇，進(jìn)行灼燒，冷卻，備用。

5.4.4 樣品的制備

①牙膏樣品按照牙膏∶水=1∶4的比例稀釋混勻。

②益生菌粉均配置成不同濃度的水溶液。

5.4.5 試驗(yàn)菌接種及加樣

①將約15mL 50℃左右的TSA培養(yǎng)基倒入平皿中，冷卻；用微量移液器吸取0.1mL合適濃度(107～108 CFU/mL)的菌懸液于冷卻的平板中央，用無(wú)菌推棒小心涂布均勻，重復(fù)3次，蓋好皿蓋，置室溫干燥。

②用無(wú)菌鑷子取牛津杯放于平板表面，作好起點(diǎn)標(biāo)記，逆時(shí)針放置4個(gè)牛津杯，各牛津杯中心之間相距25 mm以上，與平板的周緣相距15 mm 以上；在平板上用杜氏小管打孔，控制好中心距離。

③向每個(gè)牛津杯中加入200 μL制備好的樣品；向每個(gè)孔中滴加2～3滴樣品，使樣液表面與培養(yǎng)基表面平齊。

④小心移動(dòng)上述平板，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16～18h。

5.4.6 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑并記錄，抑菌圈直徑大于8mm判為有抑菌作用，直徑越大，抑菌效果越強(qiáng)。

5.5 益生菌定量檢測(cè)方法開發(fā)

5.5.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作流程

由于市場(chǎng)上益生菌制品的質(zhì)量監(jiān)管和認(rèn)證，尤其實(shí)在定性、定量檢測(cè)和鑒定方面缺乏科學(xué)、合理、快速的方法，菌種濫用、魚目混珠的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量。因此，開發(fā)一種快速高效的益生菌定性及定量檢測(cè)方法對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量保證具有重要意義。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR定性技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)，可利用該技術(shù)對(duì)牙膏樣品中益生菌進(jìn)行定性及定量分析，有效支撐產(chǎn)品功效及宣稱。具體操作流程如圖6所示。

圖6 熒光定量PCR操作流程

5.5.2 牙膏中益生菌含量檢測(cè)

牙膏產(chǎn)品一般由磨擦劑、保濕劑、膠黏劑、發(fā)泡劑、香料、調(diào)味劑、功效成分等組成，牙膏發(fā)泡劑目前廣泛使用的以陰離子表面活性劑月桂醇硫酸鈉為主，也有添加一些輔助表面活性劑如月桂醇肌氨酸鈉、CAB等。發(fā)泡劑的存在可能對(duì)牙膏中益生菌含量檢測(cè)造成一定干擾，分別對(duì)以下三組牙膏進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，考察表活對(duì)定量結(jié)果影響，結(jié)果如下表2所示。

表2 Q-PCR檢測(cè)牙膏中益生菌C含量結(jié)果

從表2中可以看出，Q-PCR方法檢測(cè)益生菌數(shù)量與理論添加益生菌數(shù)差異無(wú)顯著差異，該方法可較準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)益生菌定量檢測(cè)。牙膏體系中表活的存在對(duì)定量結(jié)果影響較小，在允許誤差范圍內(nèi)。

6 討論及展望

當(dāng)前，益生菌作為一種新的健康維護(hù)的概念引發(fā)越來(lái)越多的關(guān)注，益生菌對(duì)人類口腔健康的促進(jìn)及調(diào)節(jié)作用也已逐漸被認(rèn)知。采用益生菌調(diào)節(jié)口腔生態(tài)，制約口腔致病菌的生長(zhǎng)，為各種口腔疾病的防治提供了一個(gè)新的思路，已成為非常有前景的生物干預(yù)手段。大量研究證實(shí)，大多數(shù)情況下益生菌對(duì)人體是安全的，其致病的可能性非常低。盡管如此，益生菌潛在的風(fēng)險(xiǎn)也不容忽視。為了保證益生菌的安全使用，仍需對(duì)益生菌的有效性和安全性進(jìn)行長(zhǎng)期深入研究。

本研究概述口腔的微生態(tài)研究進(jìn)展，并對(duì)益生菌的典型功效模型進(jìn)行了基礎(chǔ)研究。目前益生菌對(duì)口腔微生態(tài)的研究還處在萌芽狀態(tài)，雖然已經(jīng)有一些新技術(shù)新方法開始應(yīng)用于益生菌對(duì)口腔微生態(tài)的研究，但這些技術(shù)方法仍然存在許多不足，不能完全滿足對(duì)口腔微生態(tài)的研究。相信，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，不久的將來(lái)將會(huì)有更多更好的技術(shù)方法應(yīng)用于口腔微生態(tài)的研究。