豬瘟病毒E2蛋白豬源化單克隆抗體的制備及其中和活性鑒定

李淑紅，劉平黃，孫慧敏，仇華吉，李 素*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150069；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

豬瘟(classical swine fever，CSF)是豬的一種急性、烈性、出血性傳染病，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，該病被世界動物衛(wèi)生組織(world organization of animal health，OIE)列為必須報(bào)告的動物疫病[1-2]。CSF的病原是豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)，為黃病毒科瘟病毒屬成員。CSFV是單股正鏈RNA病毒，其基因組長約12.3 kb，只含1個(gè)大的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼12個(gè)蛋白，其中衣殼蛋白C、囊膜糖蛋白Erns、E1、E2為病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白為病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白[3-4]。

CSFV的囊膜糖蛋白E2的相對分子質(zhì)量為55 kDa，為Ⅰ型跨膜蛋白，其氨基端具有信號肽，羧基端具有跨膜區(qū)，將E2蛋白錨定在病毒囊膜上。E2可以通過二硫鍵形成同源二聚體，也可與E1蛋白形成E1-E2異源二聚體。研究表明，E1-E2異源二聚體對CSFV的侵入至關(guān)重要[5-7]；此外，CSFV的E2蛋白在誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是產(chǎn)生中和抗體的主要糖蛋白[8-9]。

本團(tuán)隊(duì)前期制備了1株針對CSFV E2蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，命名為6E10。該雜交瘤細(xì)胞所分泌的單克隆抗體重鏈為IgG2a型，輕鏈為κ鏈[10]。由于雜交瘤細(xì)胞存在不穩(wěn)定性，且不易保存，所以在本研究中，通過將6E10抗體的輕鏈(LC)、重鏈(HC)的基因擴(kuò)增后與豬源抗體恒定區(qū)基因相融合，克隆至慢病毒表達(dá)載體，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)重組豬源化單克隆抗體6E10(p6E10)的HEK293S懸浮細(xì)胞系。應(yīng)用AKTA蛋白純化系統(tǒng)成功制備了純化的p6E10抗體。通過Western blot、ELISA等試驗(yàn)證實(shí)，p6E10抗體組裝成功，并與CSFV E2蛋白具有良好的反應(yīng)性。中和試驗(yàn)結(jié)果表明，p6E10可以抑制CSFV的感染。因此，本研究制備針對CSFV E2蛋白的豬源化單克隆抗體p6E10可穩(wěn)定、高效表達(dá)，并具有良好的反應(yīng)性，為解析CSFV E2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能以及開發(fā)CSFV新型診斷制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒人胚腎細(xì)胞(HEK293T)、豬腎細(xì)胞(PK-15)和懸浮293細(xì)胞(HEK293S)由本實(shí)驗(yàn)室保存；CSFV石門株(CSFV-SM)由本實(shí)驗(yàn)室在PK-15細(xì)胞中增殖，于-80℃保存。

1.2 主要試劑及質(zhì)粒DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、聚凝胺(polybrene)、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、TMB底物、4′,6-DAPI購自Sigma-Aldrich公司；FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG、DH5α菌株購自Invitrogen公司；X-treme GENE HP轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司；HiTrap Protein A HP 5 mL預(yù)裝柱購自GE Healthcare公司；鼠源抗Strep單克隆抗體、HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG H&L購自Abcam公司；IRDye 800CW山羊抗鼠IgG購自LI-COR Bioscience公司；鼠抗豬IgG購自BD Pharmingen公司；293Pro?CD 293M無血清培養(yǎng)基購自上海源培生物科技股份有限公司；載體pFUGW、pSPAX2、pMD2.G、pCAGGS購自Addgene公司；PrimeSTAR?DNA聚合酶、T4DNA連接酶、QuickCut限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自Beyotime公司；豬源E2抗血清與6E10抗體輕、重鏈基因的重組質(zhì)粒pMD18T-LC和pMD18T-HC由本團(tuán)隊(duì)保存。

1.3 慢病毒重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定以pMD18T-LC和pMD18T-HC質(zhì)粒為模板，用表1中的引物擴(kuò)增出p6E10-LC-Strep和p6E10-HC-Strep基因。將PCR產(chǎn)物以及pFUGW載體應(yīng)用BamHⅠ和EcoRⅠ于37℃酶切2 h，經(jīng)凝膠回收試劑盒回收目的基因與載體后，應(yīng)用T4DNA連接酶于16℃連接12 h；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α，涂布于氨芐青霉素抗性LB固體培養(yǎng)基，挑取單克隆菌落至氨芐青霉素抗性LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h后提取重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒應(yīng)用BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒送吉林庫美生物工程公司進(jìn)行測序；將測序正確的質(zhì)粒分別命名為pFU-p6E10-LC-Strep和pFU-p6E10-HC-Strep。

1.4 重組豬源化p6E10抗體的表達(dá)與純化利用X-treme GENE HP轉(zhuǎn)染試劑將pFU-p6E10-HC-Strep和pFU-p6E10-LC-Strep質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒pSPAX2、包膜質(zhì)粒pMD2.G以21，14，7 μg共轉(zhuǎn)染至生長于10 cm培養(yǎng)皿HEK293T細(xì)胞，48 h后收集上清，將上清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用超濾管濃縮10倍，獲得慢病毒Lenti-p6E10-HC-Strep和Lenti-p6E10-LC-Strep，于-80℃保存?zhèn)溆?。分別將2種濃縮后的慢病毒各1 mL與40 μL聚凝胺混合，加入HEK293S懸浮細(xì)胞，37℃、110 r/min懸浮培養(yǎng)3～5 d后，將該懸浮細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)胞培養(yǎng)物在4℃、8 000×g離心15 min，收集上清經(jīng)HiTrap Protein A HP 5 mL親和層析柱純化：先用Binding Buffer(20 mmol/L Na2HPO4，pH=7.0)洗滌層析柱，再將樣品以5 mL/min的速度流過層析柱，用Binding Buffer洗去非特異性結(jié)合的蛋白，最后用Elution Buffer(0.1 mol/L Glycine-HCl，pH=2.7)洗脫抗體，收集洗脫液，加入1/10洗脫液體積的Neutralizing Buffer(1 mol/L Tris-HCl，pH=9.0)，調(diào)節(jié)pH至7.4，于4℃透析12 h后，應(yīng)用超濾管濃縮，獲得純化的p6E10抗體。應(yīng)用SDS-PAGE與非還原性SDS-PAGE電泳后，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，以檢測抗體組裝情況，并通過Western blot試驗(yàn)以及雙抗體夾心ELISA檢測p6E10是否成功豬源化。

表1 p6E10-LC-Strep和p6E10-HC-Strep特異性引物序列

1.5 考馬斯亮蘭染色與Western blot鑒定純化的p6E10抗體經(jīng)SDS-PAGE和非還原性SDS-PAGE凝膠電泳后用考馬斯亮蘭染色15～30 min，進(jìn)行脫色處理。Western blot用于確認(rèn)純化抗體是否成功豬源化，將p6E10抗體轉(zhuǎn)移至NC膜后，5%脫脂乳常溫封閉2 h，應(yīng)用PBST洗滌3次，用HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG常溫孵育1 h，PBST洗滌后，應(yīng)用DAB顯色。

1.6 雙抗體夾心ELISA在ELISA板中加入100 μL/孔的1∶250稀釋后的鼠抗豬IgG，終質(zhì)量濃度為2 mg/L，4℃包被12 h。用PBST洗滌3次ELISA板，再加入100 μL/孔的5%脫脂乳，37℃封閉2 h。用PBST洗滌2次，加入100 μL/孔的p6E10抗體，37℃孵育1 h，棄掉抗體，用PBST洗滌3次。加入1∶4 000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG 100 μL/孔，于37℃避光繼續(xù)孵育1 h。用PBST洗滌3次后，加入TMB底物避光作用15 min顯色，最后加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測D450 nm值。

1.7 間接ELISA及Western blot檢測p6E10抗體與E2蛋白的反應(yīng)性為檢測p6E10抗體與E2蛋白的反應(yīng)性，將CHO細(xì)胞表達(dá)的CSFV石門株E2蛋白作為包被抗原，包被質(zhì)量濃度為0.04 mg/L，封閉后將純化的p6E10抗體加入孔板中，37℃孵育1 h，PBST洗滌后加入1∶4 000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG，37℃避光孵育1 h，TMB底物顯色后用酶標(biāo)儀檢測D450 nm值。同時(shí)，將懸浮HEK293S細(xì)胞表達(dá)的CSFV-SM E2蛋白和C株E2蛋白應(yīng)用SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至NC膜，5%脫脂乳常溫封閉2 h，分別用p6E10和鼠源抗Strep單克隆抗體4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，用HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG和IRDye 800CW山羊抗鼠IgG常溫孵育1 h，用PBST洗滌后，應(yīng)用DAB顯色。

1.8 病毒中和試驗(yàn)檢測p6E10抗體效價(jià)將純化的p6E10抗體2倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度做4個(gè)重復(fù)，共做6個(gè)梯度。稀釋好的抗體與每孔中100 TCID50的CSFV-SM等體積混合，37℃孵育2 h。孵育完成后加入預(yù)冷無水乙醇于-20℃固定30 min，然后加入1∶100稀釋的CSFV陽性血清100 μL/孔，37℃孵育2 h。用PBST洗滌3次，加入1∶100稀釋的FITC標(biāo)記兔抗豬IgG，37℃避光孵育1.5 h。用PBST洗滌后，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定結(jié)果以質(zhì)粒pMD18T-LC和pMD18T-HC為模板，應(yīng)用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，可見大小約為750，1 500 bp的電泳條帶，分別是p6E10-LC-Strep和p6E10-HC-Strep(圖1A)，與預(yù)期大小相符。將目的基因與pFUGW載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，提取重組質(zhì)粒后進(jìn)行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，在9 900，1 500，750 bp處有特異性條帶(圖1B)，重組質(zhì)粒經(jīng)測序正確，表明pFU-p6E10-LC-Strep和pFU-p6E10-HC-Strep質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A.p6E10輕、重鏈PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(M.DL2000 DNA Marker;1.p6E10-LC-Strep PCR產(chǎn)物；2.p6E10-LC-Strep陰性對照；3.p6E10-HC-Strep PCR產(chǎn)物；4.p6E10-HC-Strep 陰性對照)；B.重組質(zhì)粒pFU-p6E10-HC-Strep 和 pFU-p6E10-LC-Strep 的雙酶切鑒定(M1.DL15000 DNA Marker;M2.DL2000 DNA Marker;1.pFU-p6E10-HC-Strep 酶切產(chǎn)物；2.pFU-p6E10-LC-Strep酶切產(chǎn)物)

2.2 重組豬源化p6E10抗體的表達(dá)、純化與鑒定結(jié)果HEK293S-p6E10細(xì)胞系培養(yǎng)上清應(yīng)用AKTA蛋白純化系統(tǒng)獲得p6E10抗體(圖2A)，將純化后的p6E10抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，以及Western blot鑒定。在SDS-PAGE中，純化的p6E10抗體在30，60 kDa均有條帶，表明該抗體純化成功(圖2B)；而在非還原性SDS-PAGE中，純化p6E10抗體在180 kDa處有條帶(圖2C)，與預(yù)期重組豬源化抗體大小相符，表明含有輕鏈和重鏈的抗體成功組裝。Western blot結(jié)果顯示，重組豬源化p6E10抗體可被兔抗豬IgG所識別(圖2D)，同時(shí)雙抗體夾心ELISA結(jié)果表明，p6E10可以與兔抗豬IgG反應(yīng)(圖2E)，以上結(jié)果表明，該嵌合抗體已成功豬源化。

A.AKTA純化p6E10圖譜(紅色箭頭.p6E10收集峰)；B.p6E10還原性SDS-PAGE(M.蛋白Marker;1.純化的HEK293S細(xì)胞上清;2.制備的p6E10抗體);C.p6E10非還原性SDS-PAGE(M.蛋白Marker;1.純化的 HEK293S細(xì)胞上清;2.制備的p6E10抗體)；D.Western blot檢測p6E10與 兔抗豬 IgG的反應(yīng)性(M.蛋白Marker;1.未純化的HEK293S細(xì)胞上清;2.未純化的HEK293S-p6E10細(xì)胞上清；3.純化的HEK293S細(xì)胞上清；4.制備的p6E10抗體)；E.雙抗體夾心ELISA檢測 p6E10 與 兔抗豬 IgG 的反應(yīng)性(p6E10.制備的p6E10抗體；HEK293S supernatants.純化的HEK293S細(xì)胞上清；Swine anti-E2 serum.豬源E2抗血清)

2.3 重組豬源化p6E10抗體與E2的反應(yīng)性鑒定應(yīng)用間接ELISA檢測p6E10抗體與CSFV E2蛋白的反應(yīng)性，結(jié)果顯示，與對照(純化HEK293S細(xì)胞上清)相比，p6E10與CHO細(xì)胞表達(dá)的CSFV E2(CHO-E2)蛋白具有良好的反應(yīng)性(圖3A)，說明該抗體可用于檢測CSFV E2蛋白。同時(shí)，Western blot檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，p6E10抗體與CSFV強(qiáng)毒石門株和弱毒疫苗C株的E2蛋白均有良好的反應(yīng)性(圖3B)。

2.4 重組豬源化p6E10抗體在CSFV感染中的抗病毒作用為了確定重組豬源化p6E10抗體對CSFV的抗病毒作用及其抗體效價(jià)，將CSFV-SM與2倍系列稀釋的p6E10抗體預(yù)先孵育后感染PK-15細(xì)胞，48 h后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)。結(jié)果顯示，與對照相比，p6E10以1∶2，1∶4和1∶8的稀釋度均可有效地中和100 TCID50的CSFV-SM，且在1∶16的p6E10稀釋孔中，只檢測到少量熒光(圖4)，結(jié)果表明，p6E10抗體對CSFV感染有一定的中和作用，且其抗體效價(jià)為1∶12。

A.間接ELISA檢測 p6E10 與 CSFV E2蛋白的反應(yīng)性(p6E10.制備的p6E10抗體；HEK293S supernatants.純化的HEK293S細(xì)胞上清；Swine anti-E2 serum.豬源E2抗血清；CSFV-negative serum.CSFV陰性血清)；B.Western blot檢測p6E10與 CSFV強(qiáng)毒和弱毒E2蛋白的反應(yīng)性(HEK293S.HEK293S細(xì)胞上清；C-E2.C株E2蛋白；SM-E2.石門株E2蛋白)

3 討論

CSFV的糖蛋白E2和Erns都是可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和性抗體的病毒蛋白，而E2是最重要的免疫原性蛋白，因此應(yīng)用E2蛋白作為免疫原制備識別CSFV的抗體。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中制備了1株識別CSFV石門株E2蛋白的鼠源單克隆抗體6E10，其可以識別CSFV以及E2蛋白，但是傳統(tǒng)制備單抗的方法是從小鼠腹腔抽取腹水，既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。此外，雜交瘤細(xì)胞的長期冷凍保存可能導(dǎo)致分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞活力下降甚至雜交瘤細(xì)胞死亡。近年來，人源重組基因工程抗體已被臨床應(yīng)用于預(yù)防和治療病毒感染[11-14]。然而，關(guān)于重組豬源抗體的報(bào)道較少，單克隆抗體多應(yīng)用于病毒感染的宿主本身，因此將鼠源6E10抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因與豬源IgG恒定區(qū)基因融合，表達(dá)出仍可特異性識別CSFV的重組豬源單克隆抗體p6E10。編碼鼠源IgG恒定區(qū)的基因被豬源IgG替換，這可能導(dǎo)致重組抗體的糖基化、折疊和親和力發(fā)生變化，更接近于豬體產(chǎn)生抗體的蛋白修飾情況。有趣的是，在Western blot結(jié)果中，重組豬源抗體p6E10反而可以更好地識別變性的E2蛋白，表明單克隆抗體豬源化后提高了其對病毒蛋白的敏感性，有助于CSF的診斷和預(yù)防。

目前，大多數(shù)基因工程抗體是通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞而進(jìn)行制備[15-16]。然而，在哺乳動物細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)重組抗體費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而構(gòu)建表達(dá)蛋白的懸浮細(xì)胞系是解決這一問題的有效途徑。為了獲得穩(wěn)定表達(dá)高水平分泌型抗體的細(xì)胞系，本研究利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)p6E10抗體的HEK293S細(xì)胞系，并使用自動化高通量AKTA系統(tǒng)對抗體進(jìn)行了純化[17-18]，且其產(chǎn)量(可達(dá)2 mg/L)和純度均較高(98%以上)。本研究制備的豬源化單克隆抗體6E10可以用于CSFV E2蛋白的結(jié)構(gòu)解析以及檢測方法的建立。

本研究通過真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)穩(wěn)定的豬源重組單克隆抗體p6E10，證明該抗體成功組裝及豬源化，與CSFV E2蛋白具有良好的反應(yīng)性，并對CSFV感染具有抑制作用，為后續(xù)探究CSFV感染機(jī)制以及開發(fā)新型診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。