外源性堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠陰莖肌源性干細(xì)胞增殖的影響

馮娟娟 王正位 張晨 劉媛媛 程廣舟 王磊

1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬滕州市中心人民醫(yī)院泌尿外科，滕州 277500；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬滕州市中心人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，滕州 277500

目前，干細(xì)胞技術(shù)在陰莖勃起功能障礙診治中的研究已成為熱點(diǎn)問題［1］。干細(xì)胞具有多潛能自我復(fù)制能力，能夠分泌組織細(xì)胞所需的細(xì)胞因子甚至分化為相應(yīng)組織細(xì)胞，使得受損細(xì)胞恢復(fù)功能甚至再生［2］。其中，肌源性干細(xì)胞是一種具有增殖分化潛能的、未向任何方向定型的原始成體干細(xì)胞［3-5］，已初步應(yīng)用于基因治療和組織工程等領(lǐng)域［6-7］，而且，Kovanecz等［3］已證實(shí)了陰莖海綿體中存在著內(nèi)源性干細(xì)胞。正源于此，學(xué)者認(rèn)為陰莖海綿體內(nèi)源性干細(xì)胞有望為勃起功能障礙的治療開辟新途徑。但是，肌源性干細(xì)胞的相關(guān)研究仍存在諸多方面難題亟待解決，其中，肌源性干細(xì)胞在體外純化、擴(kuò)增、定向分化等便是關(guān)鍵問題。目前，已有相關(guān)研究證實(shí)某些生物活性因子能夠作用于干細(xì)胞的增殖并產(chǎn)生促進(jìn)增值的作用［8-9］，其中研究比較深入者便是堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），bFGF又稱作FGF-2，屬于FGF1亞家族，bFGF作為一種信號(hào)分泌蛋白幾乎在所有組織中都有表達(dá)［10］。bFGF 與細(xì)胞膜上的酪氨酸激酶成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）結(jié)合產(chǎn)生生物學(xué)活性，促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖、分化，其在傷口愈合、損傷修復(fù)和組織再生中的相關(guān)報(bào)道較多［11-12］，而將其用于肌源性干細(xì)胞的增殖的相關(guān)研究報(bào)道較少［13-15］，為此，本課題以大鼠陰莖肌源性干細(xì)胞作為研究對(duì)象，進(jìn)一步了探討了外源性bFGF對(duì)其體外增殖的作用效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1.一般資料

本試驗(yàn)自2020 年12 月至2021 年6 月在滕州市中心人民醫(yī)院精準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室完成。選取健康雄性Wistar大鼠5只，體質(zhì)量（200±50）g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司［使用許可證號(hào)：SYXK（魯）20180002，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20200003］。主要試劑與儀器：胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、Percoll分層液、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（上海源聚生物科技有限公司，中國(guó)）；Sca-1 及Desmin 免疫組化試劑盒（UCL 公司，美國(guó)）；外源性bFGF（珠海生物制品有新公司，中國(guó)）；CO2培養(yǎng)箱（上海醫(yī)療器械有限公司，中國(guó)）；奧林巴斯Ⅸ51熒光倒置顯微鏡（上海普赫光電科技有限公司，日本）；SW-CJ-1FD超凈臺(tái)（蘇州江東精密儀器有限公司，中國(guó)）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司，中國(guó)）。

本試驗(yàn)動(dòng)物符合3R 原則，試驗(yàn)通過濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020B002）。

2.實(shí)驗(yàn)方法

取大鼠陰莖海綿體組織消化、培養(yǎng)，通過密度梯度離心法進(jìn)行純化［16］。細(xì)胞存活率≥95%時(shí)再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用改良的Preplate 差速貼壁法［16］進(jìn)行傳代培養(yǎng)。通過細(xì)胞玻片、PBS 漂洗細(xì)胞鋪片、細(xì)胞固定、水化、通透、加入滅活酶、一抗、二抗、封片逐步進(jìn)行Sca-1、Desmin 的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定，同步設(shè)定陰性對(duì)照。最后通過熒光顯微鏡觀察拍照，照片采用Image-Pro PLUS 5.0軟件進(jìn)行處理。應(yīng)用蘇木精-伊紅染色觀察肌源性干細(xì)胞的形態(tài)。

MTT比色實(shí)驗(yàn)。加樣：取第2代肌源性干細(xì)胞，先用0.1%胰酶消化后，再用生長(zhǎng)培養(yǎng)基重新懸浮，以1×106/ml 濃度、200 μl/孔接種于96孔板，設(shè)置5塊試驗(yàn)板。A板為實(shí)驗(yàn)組：分別加入終質(zhì)量濃度為10 μg/L、30 μg/L、50 μg/L、70 μg/L、90 μg/L 外源性bFGF；B、C、D、E 板的實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)因子終濃度均為90 μg/L。5 塊板均設(shè)立空白對(duì)照組（每孔加200 μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基）、陰性對(duì)照組（每孔加200 μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基+肌源性干細(xì)胞）。均放于37 ℃、5%的CO2孵箱中培養(yǎng)。呈色：5板分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h呈色。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多重比較采用Tukey 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.體外培養(yǎng)大鼠陰莖肌源性干細(xì)胞的形態(tài)觀察

剛分離的肌源性干細(xì)胞貼壁緩慢，少量細(xì)胞仍處于懸浮狀態(tài)，數(shù)量少且體積小，多呈球形，有一定折光性，綠色箭頭示貼壁的球形細(xì)胞，黃色箭頭示懸浮于培養(yǎng)液中的少量細(xì)胞，見圖1A；原代培養(yǎng)3 d后PP6中懸浮細(xì)胞消失，貼壁后的細(xì)胞特點(diǎn)：體積增大，可見細(xì)長(zhǎng)梭形或紡錘形，見圖1B；培養(yǎng)4 d 時(shí)細(xì)胞特點(diǎn)：向?qū)Ψ缴斐鲂〉耐黄穑示W(wǎng)狀趨于融合，趨于平行排列，此時(shí)肌源性干細(xì)胞已融合形成多核肌管，并可見肌管收縮，見圖1C；培養(yǎng)4 d后，蘇木精-伊紅染色可見肌源性干細(xì)胞呈梭形平行排列，見圖1D。

圖1 體外培養(yǎng)大鼠陰莖肌源性干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察。A 為剛分離的肌源性干細(xì)胞（×100），綠色箭頭示貼壁的球形細(xì)胞，黃色箭頭示懸浮于培養(yǎng)液中的少量細(xì)胞；B 為原代培養(yǎng)3 d 后PP6 中貼壁后的肌源性干細(xì)胞（×100）；C 為培養(yǎng)4 d 時(shí)的肌源性干細(xì)胞（×100）；D 為培養(yǎng)4 d 后經(jīng)蘇木精-伊紅染色的肌源性干細(xì)胞（×200）

2.肌源性干細(xì)胞的鑒定及流式細(xì)胞儀檢測(cè)

通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)PP6 及傳代培養(yǎng)細(xì)胞，肌源性干細(xì)胞標(biāo)記物Sca-1、Desmin 的表達(dá)情況，熒光顯微鏡下見：PP6 及傳代細(xì)胞均能表達(dá)Sca-1、Desmin，且隨著代數(shù)的增加，免疫熒光陽(yáng)性率無明顯降低，見圖2A；PP6 細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Sca-1 表達(dá)量為（79.90±1.82）%，見圖2B；少數(shù)呈Desmin 陽(yáng)性反應(yīng)，表達(dá)量為（68.60±0.72）%，其流式細(xì)胞檢測(cè)見圖2C。

圖2 大鼠陰莖肌源性干細(xì)胞的鑒定及流式細(xì)胞儀檢測(cè)。A為PP6及傳代培養(yǎng)細(xì)胞（×100）；B為肌源性干細(xì)胞中Sca-1檢測(cè)結(jié)果；C為肌源性干細(xì)胞中Desmin檢測(cè)結(jié)果

3.MTT比色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，外源性bFGF對(duì)肌源性干細(xì)胞的促增殖效應(yīng)不同，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，肌源性干細(xì)胞增殖逐漸加強(qiáng)。培養(yǎng)24 h、48 h與72 h，兩組肌源性干細(xì)胞數(shù)量均增多，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)顯著促增殖效應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間為96 h、120 h、144 h（均P＜0.01），且在此時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組的增殖效應(yīng)均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.01）；但培養(yǎng)96 h 之后兩組增殖效應(yīng)均不再繼續(xù)增加，反而呈下降趨勢(shì)。見圖3。

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)大鼠陰莖肌源性干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線示意圖

4.不同終濃度的外源性bFGF 對(duì)肌源性干細(xì)胞的促增殖效應(yīng)

培養(yǎng)96 h 時(shí)MTT 法檢測(cè)兩組肌源性干細(xì)胞增殖效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)不同終濃度的外源性bFGF 對(duì)肌源性干細(xì)胞的促增殖效應(yīng)也不同。與對(duì)照組比較，加入10 μg/L（t=3.657，P=0.022）、30 μg/L（t=7.483，P=0.002）、50 μg/L（t=4.821，P=0.009）、70 μg/L（t=7.7461，P=0.001）及90 μg/L（t=7.839，P=0.001）bFGF 實(shí)驗(yàn)組均明顯高于對(duì)照組的增殖效應(yīng)；實(shí)驗(yàn)組中肌源性干細(xì)胞的增殖作用在10～70 μg/L 區(qū)間內(nèi)隨終濃度升高而顯著增強(qiáng)（均P＜0.01）；但是從70 μg/L 到90 μg/L時(shí)其促增殖作用不再繼續(xù)增強(qiáng)，其間增值效應(yīng)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.374）。見圖4。

圖4 不同終濃度的外源性堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠陰莖肌源性干細(xì)胞的促增殖效應(yīng)

討論

向多細(xì)胞系分化和自我更新潛能是肌源性干細(xì)胞的獨(dú)特之處，有研究發(fā)現(xiàn)即便是在無誘導(dǎo)因素作用下，其也可定向分化為肌細(xì)胞和肌組織［17］。要研究肌源性干細(xì)胞的增值，首先要精確地對(duì)其進(jìn)行鑒定，Sca-1 是目前最常用于鑒定干細(xì)胞的標(biāo)志物，而Desmin 是最常用于鑒定肌源性干細(xì)胞的標(biāo)志物，可用于篩選肌肉來源與非肌肉來源的組織［18］。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了大鼠陰莖海綿體中Sca-1 和Desmin 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示少量存在Sca-1 和Desmin 同時(shí)表達(dá)的雙陽(yáng)性細(xì)胞，即同一個(gè)細(xì)胞既具有干細(xì)胞特異性，又具有肌源性細(xì)胞的特異性，因此我們發(fā)現(xiàn)了海綿體組織中有肌源性干細(xì)胞存在的證據(jù)。但是，肌肉組織中肌源性干細(xì)胞的數(shù)量較少，因此，如何使得肌源性干細(xì)胞能夠在體外有效地得到純化、擴(kuò)增、定向分化，成為目前研究肌源性干細(xì)胞增殖的熱點(diǎn)問題。

近期，bFGF 被廣泛用于細(xì)胞的體外培養(yǎng)增殖、誘導(dǎo)分化以及體外組織再生領(lǐng)域，是一種極具應(yīng)用潛力的生長(zhǎng)因子之一［10-12］。目前，諸多學(xué)者進(jìn)行了利用bFGF 擴(kuò)增的方法促進(jìn)干細(xì)胞的增殖的研究，如李娜等［19］利用bFGF集落胚胎干細(xì)胞，促進(jìn)其高效增從而獲得了豐富的造血干細(xì)胞；巴云濤等［20］對(duì)人臍帶Wharton's jelly 源的組織塊進(jìn)行分離培養(yǎng)，應(yīng)用bFGF對(duì)其增殖過程進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)出了可觀的具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性的細(xì)胞；呂丹等［21］已將外源性bFGF用于大鼠肌源性干細(xì)胞增殖研究，并取得了良好效果；王童等［22］將bFGF 作用于腦創(chuàng)傷SD 大鼠大腦側(cè)室中，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化明顯提高。以上研究均充分證明bFGF 能促進(jìn)細(xì)胞從組織塊的分離，且有助于促使細(xì)胞貼壁，而且一定程度上維持細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定性，提高了細(xì)胞的增殖能力，并且未改變細(xì)胞的表面標(biāo)志物表達(dá)，以便于進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞特性的鑒定。

結(jié)合以上研究，目前認(rèn)為bFGF可促進(jìn)肌源性干細(xì)胞的增殖與分化的作用機(jī)制可能為：（1）bFGF 保守性較強(qiáng)，在各種生物體內(nèi)有著很高的同源性［12］，楊竣等［23］檢測(cè)出了大鼠血清及陰莖組中bFGF 的含量高達(dá)（10.53±0.42）μg/L 和（985.8±76.8）pg/mg protein，并發(fā)現(xiàn)其與陰莖海綿體肌的含量變化有著密切關(guān)系。（2）肌細(xì)胞中可能有bFGF 特異性受體存在［22］。生長(zhǎng)因子通過與肌細(xì)胞上相應(yīng)受體結(jié)合啟動(dòng)肌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，或者與可溶性的相應(yīng)受體結(jié)合，進(jìn)而作用于其他具有bFGF 受體或類似受體的非神經(jīng)元和非肌細(xì)胞，從而改變肌源性干細(xì)胞生存的微環(huán)境而發(fā)揮作用［24-27］。例如Xie等［28］以高脂血癥大白兔為研究對(duì)象，向其海綿體肌內(nèi)注射bFGF 后發(fā)現(xiàn)其海綿肌含量及血管活性藥物的舒張程度明顯增加，并進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陰莖海綿體肌內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）的蛋白表達(dá)水平明顯升高，發(fā)現(xiàn)bFGF 主要是通過促進(jìn)VEGF 蛋白表達(dá)，導(dǎo)致其下游的蛋白激酶B 和eNOS 磷酸化，最終提高陰莖組織對(duì)血管活性藥物的敏感度。（3）bFGF 與受體結(jié)合后形成受體配體復(fù)合物，定位于細(xì)胞核后，作為一種細(xì)胞分裂原，在有絲分裂G2M期，其受體FGFR 是酪氨酸激酶型受體，與配體結(jié)合后激活c/Frs-Raf/MAPKKK-MAPKK-MAPK 通路，作用于RNA 聚合酶Ⅰ并影響其活性，導(dǎo)致核蛋白體基因的轉(zhuǎn)錄加強(qiáng)，加快了細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換，通過刺激引物合成刺激了細(xì)胞的DNA 合成增強(qiáng)，通過縮短細(xì)胞周期，從而促進(jìn)細(xì)胞的分裂與增殖［29-30］。胡文龍等［31］發(fā)現(xiàn)bFGF 能夠調(diào)節(jié)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期；（4）bFGF 作為一種信號(hào)蛋白，通過靶向作用于相關(guān)miRNA 影響干細(xì)胞分裂和分化，如miR-138 和miR-23b 受bFGF 影響在干細(xì)胞成骨和成軟骨的增值、分化過程中發(fā)揮更顯著的作用［32］。

本研究中發(fā)現(xiàn)，bFGF 不僅可促進(jìn)大鼠陰莖肌源性干細(xì)胞的增殖，而且其促進(jìn)增值效應(yīng)與培養(yǎng)時(shí)間、終濃度密切相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)：（1）bFGF 的促增殖效應(yīng)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，但并非隨時(shí)間延長(zhǎng)而無限增加，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到96 h時(shí)，增殖效應(yīng)將不再繼續(xù)增加，這與bFGF 作為細(xì)胞分裂源的機(jī)制相一致。（2）肌源性干細(xì)胞的增殖效應(yīng)與bFGF 終濃度呈正相關(guān)性，即增殖效應(yīng)隨終濃度增大而一定限度內(nèi)逐步提高。白燕等［33］在研究bFGF 對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)bFGF 質(zhì)量濃度達(dá)到10 μg/L 時(shí)會(huì)達(dá)到飽和狀態(tài)，產(chǎn)生結(jié)節(jié)的數(shù)量不會(huì)再隨質(zhì)量濃度升高而增加，反而出現(xiàn)抑制作用。同樣，我們也發(fā)現(xiàn)肌源性干細(xì)胞的增殖效應(yīng)隨著終濃度從10 μg/L～70 μg/L 升高的區(qū)間內(nèi)也隨之增強(qiáng)，當(dāng)終濃度達(dá)到70 μg/L時(shí)，其增殖效應(yīng)達(dá)到巔峰，且不再繼續(xù)增加，反而有下降趨勢(shì)。即過高的終濃度不僅不會(huì)再對(duì)細(xì)胞分化產(chǎn)生促進(jìn)作用，反而會(huì)產(chǎn)生抑制作用，這種現(xiàn)象與bFGF 受體具有特異性、飽和性的特點(diǎn)相一致，因此選擇合適的培養(yǎng)終濃度也至關(guān)重要。另外，因?yàn)閎FGF 有著不穩(wěn)定性的特點(diǎn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，bFGF 的濃度也會(huì)隨之下降，便會(huì)減緩肌源性干細(xì)胞的增值、分化效率，所以在細(xì)胞培養(yǎng)基中需要持續(xù)補(bǔ)充bFGF 以維持其濃度，這也是十分重要的。

本研究初步探討了bFGF 對(duì)肌源性干細(xì)胞的促增殖作用，對(duì)肌源性干細(xì)胞培養(yǎng)方案優(yōu)化的研究提供了些許經(jīng)驗(yàn)。但是，其增值作用是否具有靶向性，是否與其他物質(zhì)具有聯(lián)合作用，且作用機(jī)制與效果如何，作用可控性等問題仍需進(jìn)一步深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突