趙慧博,鄧健康,路敏,,齊兵,戴勝興,吳彥兵,王影,王雅寧,夏君霞,*
(1.河北養(yǎng)元智匯飲品股份有限公司,河北衡水 053000)
(2.河北省核桃營養(yǎng)功能與加工技術(shù)重點實驗室,河北衡水 053000)
核桃(Jugians regiaL.)屬胡桃科,是世界四大干果之一。核桃是我國重要的木本油料資源,種植面積和產(chǎn)量均位居世界第一[1]。核桃仁中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪酸(尤其是不飽和脂肪酸)、糖類和維生素等物質(zhì),具有抗氧化、抗衰老、改善記憶和改善消化等功能[2-5],成為近期的研究熱點。
食用核桃的有益作用已被公認(rèn),特別是核桃中富含不飽和脂肪酸,對促進(jìn)健康發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。核桃仁豐富的多不飽和脂肪酸引起了人們極大興趣。核桃油脂肪酸主要包括棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亞油酸(C18:2)和亞麻酸(C18:3)等脂肪酸,據(jù)報道,核桃油中還有棕櫚油酸和花生酸等微量脂肪酸的存在[6]。亞油酸是人體必需脂肪酸,能有效地降低血脂、血壓,享有“血管清道夫”的美譽[7]。核桃油還含有具有生理活性的微量伴隨物[8]。王瑞元等[9]提出在植物油生產(chǎn)過程中,依據(jù)精準(zhǔn)適度加工原則,以最大程度保留營養(yǎng)、提高核桃油質(zhì)量。提高核桃油、油脂伴隨物和核桃蛋白的綜合利用率成為未來發(fā)展趨勢。
常見的核桃油的生產(chǎn)方式有壓榨法、溶劑提取法和水酶法等[10]。壓榨法是目前最普遍的提油方法,但壓榨法熱處理時間長。溶劑浸出法出油率高,但需要多種精煉過程。高溫和溶劑等不利條件會導(dǎo)致不飽和脂肪酸和伴隨物的損失。隨著人們對綠色加工和食品安全的重視,發(fā)展更加環(huán)保高效的核桃油提取方法迫在眉睫。近年來,水酶法在酶解[11]、破除乳狀液[12]、油與乳狀液分離等理論、技術(shù)和裝備均有了很大突破。
在水酶法提取過程中,需要將物料破碎至細(xì)胞大小水平[13]。因此如何實現(xiàn)滿足水酶法提油要求的有效破碎,是亟需解決的科學(xué)技術(shù)問題和商業(yè)化應(yīng)用問 題[14]。含水量高的植物原料在濕磨過程中,容易形成大量穩(wěn)定乳狀液,不利于酶解破乳。鋸片式破碎機(jī)和錘式研磨機(jī)的連續(xù)生產(chǎn)能力差,難以滿足中試規(guī)模生產(chǎn)要求。無水膠體磨和輥式破碎機(jī)[13]可以用于多種植物原料連續(xù)破碎,有望用于高含油原料的預(yù)處理。然而,目前缺乏對水酶法生產(chǎn)核桃油的不同破碎方式的系統(tǒng)研究。因此,本文采用不同破碎方式處理核桃仁,水酶法提取核桃油,研究了不同破碎方式對水酶法工藝、核桃油品質(zhì)(酸價、過氧化值、脂肪酸組成和揮發(fā)性成分組成等)的影響。本研究將為水酶法提取核桃油破碎方式選擇提供依據(jù),以期為核桃油水酶法優(yōu)化和精準(zhǔn)適度加工奠定基礎(chǔ)。
核桃仁,河北養(yǎng)元智匯飲品股份有限公司;石油醚(30~60 ℃),硫酸銅,硫酸鉀,硫酸,硼酸,甲基紅指示劑,溴甲酚綠指示劑,亞甲基藍(lán)指示劑,氫氧化鈉,無水乙醇,乙醚,異丙醇,酚酞指示劑,三氯甲烷,冰乙酸,硫代硫酸鈉,氫氧化鉀,上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇(色譜純),北京迪科馬科技有限公司;三氟化硼甲醇溶液,梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;無水硫酸鈉,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;Veron L木瓜蛋白酶(800 UHb/g),德國AB酶制劑公司;Alcalase 2.4L堿性蛋白酶 (2.4 AU/g),諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司。除特殊標(biāo)注外,試劑均為分析純。
FE 28型pH計,梅特勒-托利多儀器上海有限公司;BSA224S型電子分析天平,德國賽多利斯公司;GZX-9030MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海博訊實業(yè)有限公司;SOX406型索氏提取儀,山東海能科學(xué)儀器有限公司;JMS-130A型無水膠體磨,廊坊市惠友機(jī)械有限公司;GYB-60-6S型高壓均質(zhì)機(jī),上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠;105型三輥研磨機(jī),蚌埠市綠源精細(xì)研磨設(shè)備有限公司;TGL-20000 CR型高速臺式冷凍離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;SHHW21-420型水浴鍋,天津市泰斯特儀器有限公司;JM-80A型有水膠體磨,廊坊市惠友機(jī)械有限公司;Master sizer 3000型激光粒度分析儀,英國馬爾文儀器有限公司;7820A型氣相色譜儀配備氫火焰離子檢測器,安捷倫中國公司;8860-5977B型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,安捷倫中國公司;WSC-2B型色差儀,上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司。
1.3.1 核桃仁破碎和水酶法制油
核桃仁經(jīng)浸泡、高壓水槍去皮,采用六種方式進(jìn)行破碎,A:將核桃仁加入中藥粉碎機(jī)破碎,研磨1 min,靜置降溫2 min,重復(fù)6次。B:將核桃仁加入無水膠體磨破碎一次。C:將核桃仁加入無水膠體磨破碎一次,得到的醬狀物加入三輥研磨機(jī)研磨一次。D:將核桃仁加入無水膠體磨破碎一次,得到的醬狀物加入三輥研磨機(jī)研磨兩次。E:將核桃仁和水按照1:2的比例混合,有水膠體磨破碎一次。F:將核桃仁加入無水膠體磨破碎一次,得到的醬狀物和水按照1:2的比例混合,20 MPa高壓均質(zhì)一次。
分別取500 g破碎后的A、B、C、D四個樣品按照料液比1:2加水(E和F樣品不加水)。酶解條件:木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶的用量均為核桃仁質(zhì)量的1‰,加入氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值至7.0,置于50 ℃水浴鍋中酶解2 h。酶解產(chǎn)物8 000 r/min離心10 min。
用移液管和藥匙分別收集核桃油、乳狀液、水相以及沉淀等四種組分,于分析天平分別準(zhǔn)確稱重, -20 ℃保存,待用。
1.3.2 粒徑分析
取2 g不同破碎方式的樣品,加入20 mL水,旋渦混合2 min,室溫靜置30 min取上層溶液,用激光粒度分析儀進(jìn)行粒徑分析。
1.3.3 出油率
收集核桃油后稱重,按照公式(1)計算出油率:
式中:
C——出油率,%;
m1——核桃仁中脂肪質(zhì)量,g;
m2——清油質(zhì)量,g。
核桃仁中脂肪質(zhì)量,參考GB 5009.6-2016索氏抽提法,稱取10 g樣品,與20 g石英砂在蒸發(fā)皿中混合后,沸水浴蒸干,置于鼓風(fēng)干燥箱100 ℃烘干30 min,充分研磨后進(jìn)行索氏抽提,稱重,即為脂肪質(zhì)量。
1.3.4 顏色測定
取核桃油加入比色杯中,使用CIELab表示色度空間,測定樣品的L*、a*和b*。ΔE按照公式(2)計算。
式中:
L*——亮度指數(shù),在0~100之間表示黑色至白色;
a*——從紅色(正值)到綠色;
b*——從黃色(正值)到藍(lán)色。
1.3.5 理化指標(biāo)
(1)蛋白質(zhì)含量:參考GB 5009.5-2016凱氏定氮法,稱取2 g沉淀或10 g乳狀液、水相,經(jīng)消化后,采用自動凱氏定氮儀進(jìn)行測定。
(2)脂肪含量:參照1.3.3測定。
(3)水分含量:參考GB 5009.3-2016直接干燥法。5 g樣品與10 g干燥至恒重的海砂混勻后,置于105 ℃烘箱中,干燥至恒重,計算水分含量。
(4)酸價:參考GB 5009.229-2016冷溶劑指示劑滴定法,取20 g核桃油,加入乙醚-異丙醇混合液50 mL和3~4滴的酚酞指示劑,充分溶解后滴定至終點。計算酸價。
(5)過氧化值:參考GB 5009.227-2016滴定法,稱取3 g核桃油,加入30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液混合,加入1 mL飽和碘化鉀溶液暗處反應(yīng)3 min。加入100 mL水搖勻后立即用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。
1.3.6 脂肪酸
核桃油脂肪酸組成采用氣相色譜法測定。參考Zheng等[15]的方法,并稍作修改。取0.1 g核桃油與 5 mL 2%氫氧化鉀-甲醇溶液冷凝回流至油滴消失,加入7 mL 15%三氟化硼甲醇溶液,繼續(xù)回流2 min。經(jīng)正庚烷提取,無水硫酸鈉除水,取上層溶液待測。色譜條件:色譜柱DB-WAX(30 m×0.32 mm,0.25 μm),進(jìn)樣口溫度270 ℃,氫火焰離子檢測器溫度280 ℃。程序升溫:初始溫度100 ℃,持續(xù)13 min;100 ~180℃ ℃,升溫速率10 /min℃ ,保持6 min;180 ~200℃ ℃,升溫速率1 /min℃ ,保持20 min;200 ~230℃ ℃,升溫速率4 /min℃ ,保持10.5 min。采用面積歸一化法進(jìn)行定量。
1.3.7 揮發(fā)性組分
核桃油的揮發(fā)性組分分析參考Natasa等[16]的方法,并稍許修改。HS-SPME條件:稱取2 g核桃油樣品,加入至15 mL頂空瓶中40 ℃平衡20 min(磁力攪拌轉(zhuǎn)速180 r/min),50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭在40 ℃吸附20 min。GC-MS條件:HP-5MS色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。載氣:高純氦氣(99.999%),流速1.2 mL/min,不分流模式。進(jìn)樣口溫度270 ℃。程序升溫:初始溫度35 ℃,保持4 min;35 ~100℃ ℃,升溫速率3 /min℃ ,保持4 min;100 ~250℃ ℃,升溫速率5 /min℃ ,保持3 min。離子源溫度250 ℃,四級桿溫度130 ℃,質(zhì)量掃描范圍m/z35~350。檢索NIST17數(shù)據(jù)庫定性分析,篩選匹配度大于70%的化合物,面積歸一化法計算相對含量。
所有的實驗均重復(fù)三次,取結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行分析。采用Origin 2021對分析結(jié)果進(jìn)行作圖和聚類分析,通過SPSS 22.0進(jìn)行顯著性差異分析。
水酶法商業(yè)化生產(chǎn)的難題之一是出油率低,主要是由于破碎細(xì)胞壁效率低、脂肪不能完全從植物細(xì)胞中釋放[13]。本研究中,我們研究了6種不同破碎方式處理核桃仁后的粒徑分布。圖1為核桃仁在不同破碎方式下的粒徑分布。6種破碎方式得到的核桃仁粒徑呈現(xiàn)多峰型分布。發(fā)現(xiàn)經(jīng)無水膠體磨(B)和有水膠體磨研磨(E)后,粒徑分布范圍最大,分別為1.05~ 934.20 μm和1.05~1 057.54 μm。中藥粉碎機(jī)(A)破碎6 min后,粒徑范圍為0.33~377.74 μm,說明中藥粉碎機(jī)破碎能夠?qū)⒉糠趾颂胰势扑槌奢^小的顆粒,但是中藥粉碎機(jī)破碎不均勻,仍然存在少量不適合進(jìn)行粒徑分析的顆粒。無水膠體磨處理后經(jīng)三輥研磨機(jī)研磨一次(C),發(fā)現(xiàn)Dv50明顯降低(由63.86 μm降低至47.51 μm),而Dv90無顯著差異。然而,經(jīng)過三輥研磨機(jī)研磨兩次(D)后,Dv50顯著升高,由 47.51 μm增加至105.57 μm,說明部分小顆粒經(jīng)過兩次三輥研磨機(jī)的輥壓后有一定程度的聚合。與無水膠體磨處理相比,有水膠體磨處理后的粒徑較大,可能是因為在大量水存在時,降低了膠體磨對核桃細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞,膠體磨的強(qiáng)剪切力也會使乳化程度增加。無水膠體磨和高壓均質(zhì)(F)共同處理后,粒徑明顯降低,Dv50為11.62 μm,說明高壓作用對核桃細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破碎能力更強(qiáng)。
圖1 破碎方式對核桃仁粒徑分布的影響Fig.1 Effect of comminution types on the range of particle size distribution of walnut
經(jīng)過6種破碎方式后,采用本研究團(tuán)隊優(yōu)化的水酶法工藝提取核桃油。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2)經(jīng)過無水膠體磨和兩次三輥研磨機(jī)的出油率最高(D),為54%。在經(jīng)無水膠體磨處理基礎(chǔ)上進(jìn)行三輥研磨處理可以顯著提高出油率。經(jīng)過有水膠體磨(E)或無水膠體磨和高壓均質(zhì)處理(F),出油率大大降低,接近零出 油率,這可能歸因于在高剪切力作用下,大量水存在時和脂肪發(fā)生強(qiáng)烈乳化作用。前人的研究發(fā)現(xiàn),物料破碎后的粒徑越小,越有利于提高出油率[17]。但這忽略了水分含量對破碎過程中乳化的影響。因此為提高出油率,需要同時降低破碎過程中的乳化作用。采用高溫烘烤[13]或者酸化水溶液處理[18]都能有效改善破碎過程中的乳化作用。高油原料的粒徑越小,導(dǎo)致出現(xiàn)粘黏,為連續(xù)破碎設(shè)備提出挑戰(zhàn)。
圖2 破碎方式對水酶法出油率的影響Fig.2 Effect of comminution types on the oil yield of aqueous enzymatic extraction process
如圖3所示,我們考察了水酶法后核桃油、乳狀液、水相和沉淀的含量,發(fā)現(xiàn)中藥粉碎機(jī)(A)破碎后的出油率較高,但是乳狀液含量最高,沉淀量較少,且沉淀中含有大顆粒,這會增加的二次破乳和沉淀綜合利用的難度。無水膠體磨和三輥研磨結(jié)合能夠顯著降低乳狀液產(chǎn)生量,同時降低乳狀液中的脂肪殘留量,提高沉淀中的蛋白質(zhì)含量(圖4),這有助于降低二次破乳難度和提高沉淀中蛋白質(zhì)的利用度。經(jīng)有水膠體磨或無水膠體磨和均質(zhì)后,乳狀液中脂肪含量和蛋白質(zhì)含量都有所增加,而相對水分含量顯著低于其他幾種處理方式(圖4)。
圖3 水酶法后油相、乳狀液、水相和沉淀的含量Fig.3 Content of free oil, cream emulsion, aqueous solution and precipitate after the aqueous enzymatic extraction process
圖4 乳狀液、水相和沉淀中脂肪、蛋白質(zhì)和水分含量Fig.4 Content of oil, protein and water in cream emulsion, aqueous solution and precipitate
2.3.1 色度
顏色是評價核桃油質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一。本研究利用CIELab系統(tǒng),對核桃油的色度進(jìn)行測定。根據(jù)國際照明委員會的規(guī)定,L*定義亮度指數(shù),在0~100之間表示黑色至白色;a*值表示紅色(正值)和綠色(負(fù)值)之間;b*表示黃色(正值)和藍(lán)色(負(fù)值)之間的位置[19]。提取得到的四種核桃油呈現(xiàn)淺黃色。由表1可知,核桃油的L*值在28.80~31.72之間,a*值在4.57~5.55之間,b*值在8.12~11.69之間。L*值低于文獻(xiàn)報道[20],這可能歸因于品種差異和工藝條件不同。本研究中水酶法核桃油的a*值顯著高于文獻(xiàn)報道的冷榨核桃油[21]。通過計算ΔE,我們發(fā)現(xiàn)核桃油A(中藥粉碎機(jī))和核桃油C(無水膠體磨和三輥研磨一次)的ΔE為4.6,核桃油A(中藥粉碎機(jī))和核桃油D(無水膠體磨和三輥研磨兩次)的ΔE為3.7,說明這兩組樣品的顏色存在較大差異,而其他核桃油間的ΔE小于3,顏色差異較小。在無水膠體磨(核桃油B)的基礎(chǔ)上進(jìn)行三輥研磨(核桃油C和D),對核桃油的顏色影響很小。
表1 不同核桃油的色度比較Table 1 Comparison of color parameters of different walnut oils
2.3.2 酸價、過氧化值和脂肪酸組成
表2列出了四種核桃油的酸價和過氧化值。酸價在0.19~0.34 mg KOH/g之間。過氧化值在0.028~ 0.063 g/100 g,酸價和過氧化值均遠(yuǎn)低于GB 2716- 2018食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)植物油的規(guī)定限值,同時也低于文獻(xiàn)報道[22,23]。油脂的過氧化值是決定植物油質(zhì)量的重要指標(biāo),高溫或長時間焙烤可以使過氧化值明顯升高[23]。由表2,我們發(fā)現(xiàn)隨著破碎時間的延長,過氧化值升高,但低于標(biāo)準(zhǔn)限制。本研究中,破碎工藝和水酶法過程都在較低溫度下進(jìn)行,而且和氧氣接觸時間短,產(chǎn)生的過氧化物較少,有效降低了核桃油過氧化值[24]。
由表2可知,核桃油的主要脂肪酸為棕櫚(C16:0,6.34%~11.07%)、硬脂酸(C18:0,2.76%~5.33%)、油酸(C18:1n-9,18.70%~19.41%)、亞油酸(C18:2n-6,52.83%~59.68%)和亞麻酸(C18:3n-3,10.52%~ 11.17%)。其中在采取中藥粉碎機(jī)破碎(A)、無水膠體磨(B)、無水膠體磨和一次三輥研磨(C)處理時,脂肪酸組成與含量文獻(xiàn)報道基本一致[22,24-27]。油酸和亞油酸分別是核桃油中最主要的單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸[22,24,28-30]。油酸和亞麻酸含量受不同破碎工藝的影響較小。而經(jīng)過無水膠體磨和兩次三輥研磨后(D),亞油酸的含量明顯降低,而棕櫚酸和硬脂酸等飽和脂肪酸的含量明顯升高,這可能是由于三輥研磨機(jī)在研磨過程中局部過熱,熱量散失速度較慢,使得物料溫度明顯提高,亞油酸出現(xiàn)了明顯的氧化降解。棕櫚酸和硬脂酸等飽和脂肪酸受工藝條件影響較大[25],因此為提高核桃油品質(zhì),選擇合適的破碎方式以達(dá)到控制破碎的溫度至關(guān)重要。
表2 不同核桃油的酸價、過氧化值和脂肪酸組成Table 2 Comparison of acid values, peroxide values and lipid composition of different walnut oils
2.3.3 揮發(fā)性組分
我們通過HS-SPME-GC-MS分析了核桃油的揮發(fā)性組分。以揮發(fā)性組分的相對含量做聚類熱圖(圖5)。其中醛類、烴類和酯類相對含量占比較高,醇類、酸類和含氧雜環(huán)類占比較低,這與前人報道基本一致[16,31-33]。
圖5 揮發(fā)性物質(zhì)聚類熱圖 Fig.5 Clustering heat map of volatile substances in walnut oil
圖4顯示不同破碎方式對核桃油揮發(fā)性成分影響較大。醛類物質(zhì)的香氣閾值較低,是核桃油特征香味的主要來源。醛類物質(zhì)主要來源于美拉德反應(yīng)和Strecker氧化降解[32]。正己醛為亞油酸的氧化產(chǎn)物之一[34]。正己醛具有青草香、果香和脂肪香氣的特征[35]。ABC三個核桃油樣品中的主要的醛類物質(zhì)是正己醛,核桃油D中正己醛含量明顯降低,可能是因為亞油酸氧化生成1-辛烯-3-醇等產(chǎn)物[31,36],1-辛烯-3醇在核桃油D中含量較高,也間接印證了這一推測。核桃油D中反-2-庚烯醛(脂肪香和肥皂香[34])相對含量較高,而核桃油A中戊醛(咖啡、堅果香味)較高[16]。
醇類也是核桃油香氣特征組成的關(guān)鍵物質(zhì)[37],主要來源于脂肪酸分解。正己醇具有草本香味[16],在核桃或者核桃加工產(chǎn)品中,正己醇是主要的醇類物質(zhì)之一[34]。1-辛烯-3-醇可以作為核桃油質(zhì)量標(biāo)志物之 一[34,38]。由圖5可以得知,核桃油B的1-辛烯-3-醇含量最低,這可能是因為無水膠體磨破碎速度快,升溫不明顯。在經(jīng)過兩次三輥研磨后,1-辛烯-3-醇含量明顯增加。
在四種核桃油中,檢測到了多種烴類物質(zhì),通常多數(shù)烴類物質(zhì)對核桃油風(fēng)味的貢獻(xiàn)不顯著。其中D-檸檬烯(檸檬香)是多種食物的重要風(fēng)味物質(zhì)[39],在Hao等[32]的研究中,隨著熱風(fēng)干燥和烘烤之后,D-檸檬烯含量降低。在我們的研究中,核桃經(jīng)過兩次三輥研磨后,核桃油中D-檸檬烯含量升高,這可能是因為破碎程度高,導(dǎo)致D-檸檬烯更多的釋放。1-辛烯-3-酮具有獨特的油香[31],在不同破碎處理后,相對含量變化小。2-庚酮[38]只在核桃油A中發(fā)現(xiàn)。與前人報道不同的是,在四種核桃油中檢測到了多種酯類物質(zhì)。在本實驗的核桃油中共檢測到8種酸類物質(zhì),含量均較低,說明核桃油提取和分離過程中發(fā)生的氧化作用不明顯。通常烘烤有利于植物油香氣品質(zhì)提高[40]。水酶法與壓榨法相比,植物油香氣品質(zhì)有所降低[41],有必要在水酶法前對原料進(jìn)行適度烘烤以提升香氣品質(zhì)。同時為了減少核桃油氧化,需要減少破碎時間和隔絕氧氣。
本文采取6種不同破碎方式處理核桃仁,采用水酶法提取核桃油。結(jié)果表明水酶法提取核桃油,需要降低物料粒徑,同時減少破碎過程中的乳化作用。核桃油出油率最高為54%。水酶法核桃油酸價和過氧化值均遠(yuǎn)低于GB 2716-2018食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-植物油的規(guī)定限值。核桃油D(無水研磨和兩次三輥研磨)飽和脂肪酸相對含量升高,而不飽和脂肪酸含量降低。通過頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用分析核桃油揮發(fā)性組分,共檢測到56種揮發(fā)性組分。通過聚類熱圖得知醛類、酯類和烴類相對占比高。綜合來看,無水膠體磨和一次三輥研磨結(jié)合,得到的核桃油品質(zhì)較好。本研究結(jié)果可為水酶法提取核桃油提供支撐,為核桃油水酶法優(yōu)化和精準(zhǔn)適度加工奠定一定基礎(chǔ)。