預(yù)酶解對瑪咖蛋白胃腸消化及免疫調(diào)節(jié)活性的影響

潘蕾蔓，張祎，賀萍，張藝哲，林政立，楊錦熹，張麗娜，吳暉，張猛猛

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

瑪咖（Lepidium meyeniiWalp.）是一種十字花科獨(dú)行菜屬的一年生草本植物，原產(chǎn)于秘魯安第斯高原，亦被稱為“秘魯人參”[1]。上世紀(jì)末，瑪咖受到聯(lián)合國糧農(nóng)組織的推薦種植[2]。瑪咖于2000年首次被引入國內(nèi)；瑪咖粉在2011年獲批為新資源食品[3,4]。研究表明瑪咖具有多種生物活性，如提高生育力與性欲、抗疲勞、提高免疫力、抗氧化、提高記憶力、抗腫瘤以及降血糖等功能[5-7]。目前的研究認(rèn)為瑪咖的這些活性主要與其中的多糖、瑪咖烯和瑪咖酰胺等物質(zhì)有關(guān)。事實(shí)上，瑪咖還含有豐富的蛋白質(zhì)（9.56%~21.90%），而蛋白質(zhì)經(jīng)胃腸消化后可產(chǎn)生各種活性肽，因此蛋白質(zhì)可能在瑪咖的功能活性中也發(fā)揮了一定作用。然而，據(jù)報(bào)道，瑪咖蛋白經(jīng)模擬胃腸消化的水解度[8]明顯低于一些常見的植物蛋白，如大豆蛋白、玉米蛋白等，這意味著瑪咖蛋白較難被胃腸道消化，直接食用的利用率不高。目前有很多研究利用外源蛋白酶，如堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶等，通過預(yù)酶解的方法處理各種難消化蛋白的酶解物，以達(dá)到充分利用蛋白質(zhì)的目的，但尚未有研究探究這種方法對瑪咖蛋白可消化性的影響。此外，實(shí)驗(yàn)室前期研究表明瑪咖蛋白經(jīng)胃腸消化后產(chǎn)生的肽具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性[8]，而預(yù)酶解的加工處理方式對瑪咖蛋白胃腸消化產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)活性的影響尚不明確。

本研究采用單酶酶解與模擬胃腸道消化相結(jié)合的方式，研究經(jīng)不同蛋白酶預(yù)酶解后的瑪咖蛋白可消化性的變化，并以小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7為模型探究預(yù)酶解對瑪咖蛋白胃腸消化后的免疫調(diào)節(jié)活性的影響，解析活性最強(qiáng)的消化產(chǎn)物中肽的序列，然后對其中免疫活性較強(qiáng)的肽進(jìn)行活性驗(yàn)證和構(gòu)效分析。本研究在為瑪咖蛋白的深加工利用方式提供技術(shù)支撐的同時(shí)，也將深化人們對瑪咖蛋白免疫調(diào)節(jié)活性的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瑪咖根莖粉末（黃瑪咖），購于云南種植基地；中性蛋白酶（100 U/mg）、堿性蛋白酶（100 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、菠蘿蛋白酶（300 U/mg）、復(fù)合蛋白酶（120 U/mg），上海源葉生物科技有限公司；胃蛋白酶（≥250 units/mg）、胰酶（8×USP），美國Sigma公司；5% TNBS水溶液，美國Sigma公司；福林酚，北京索萊寶科技有限公司；小鼠TNF-αELISA試劑盒，欣博盛生物科技有限公司；細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒（CCK-8），大連美侖生物科技有限公司；胎牛血清，上海吉泰依科賽生物科技有限公司；其它試劑均為市售分析純；小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7，實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要儀器與設(shè)備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；低速離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司；冷凍干燥機(jī)，上海繼譜電子科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；紫外可見光分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；多微孔板檢測儀，新加坡PerkinElmer公司；Q Exactive質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher科技有限公司；Dionex Ultimate 3000 RSLCnano液相色譜，美國Thermo Fisher科技有限公司；全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本HITACHI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 瑪咖蛋白的制備

在Wu等[9]的方法基礎(chǔ)上改進(jìn)，具體為：取瑪咖根莖粉末為原料，以Tris-HCl溶液（0.05 mol/L，pH值9.0）為提取液，料液比1:30（g/mL），超聲（60 ℃，250 W，20 min），提取時(shí)間30 min，提取溫度60 ℃。離心（4 000 r/min，5 min）、過濾（500目濾布）取上清液，加入1 mol/L HCl溶液至上清液pH值達(dá)到3.75，靜置30 min后再次離心（4 000 r/min，10 min），用 0.6 mol/L NaOH溶液復(fù)溶沉淀，透析脫鹽（5 000 u），凍干得瑪咖蛋白，蛋白含量為87.02%±1.58%。

1.3.2 瑪咖蛋白消化產(chǎn)物的制備

1.3.2.1 瑪咖蛋白消化產(chǎn)物制備流程圖

瑪咖蛋白經(jīng)模擬胃腸消化、單酶預(yù)酶解與模擬胃腸消化結(jié)合制備消化產(chǎn)物的工藝如圖1所示。

圖1 瑪咖蛋白消化產(chǎn)物制備流程Fig.1 Flow chart of preparation of maca protein digestion products

1.3.2.2 單酶預(yù)酶解

取0.5 g瑪咖蛋白配成1%（m/V）的蛋白溶液，加酶至總酶活為2.0×104U，酶解3 h。沸水浴加熱10 min，使瑪咖蛋白中蛋白酶抑制劑失活。將溫度和pH值調(diào)至表1各值，預(yù)熱10 min。在酶解過程中，前30 min，每5 min調(diào)節(jié)一次pH值，隨后每20 min調(diào)節(jié)一次pH值，使其保持恒定。反應(yīng)結(jié)束后，將酶解液置于沸水浴中10 min以終止反應(yīng)。

表1 七種酶的最適酶解條件Table 1 Optimal hydrolysis conditions of the seven enzymes

各酶的活力測定方法為：中性蛋白酶及堿性蛋白酶酶活的測定方法參照GB/T 23527-2009[10]紫外分光光度法；木瓜、菠蘿及復(fù)合蛋白酶酶活的測定方法參照T/CCCMHPIE 1.18-2016[11]；胃蛋白酶及胰酶酶活的測定方法參照《中華人民共和國藥典》[12]。

1.3.2.3 體外模擬胃腸消化

參照Brodkorb等[13]的方法：①模擬胃消化階段：滴加1 mol/L的HCl溶液使pH值達(dá)到3.0，在溫度達(dá)到37 ℃后加入胃蛋白酶，磁力攪拌反應(yīng)2 h；②模擬腸消化階段：滴加1 mol/L的NaOH溶液使pH值達(dá)到7.0終止模擬胃消化，加入胰酶，37 ℃磁力攪拌反應(yīng)2 h。隨后將溶液pH值調(diào)至7.0，煮沸10 min使反應(yīng)完全結(jié)束，冷卻后離心（4 000 r/min，20 min），取上清液透析（截留量100 u），再冷凍干燥得體外模擬胃腸消化產(chǎn)物，并將所得各組消化產(chǎn)物按表1次序命名為B1、B2、B3、B4及B5。

1.3.3 消化產(chǎn)物得率的測定

體外模擬消化產(chǎn)物及預(yù)酶解后體外模擬消化產(chǎn)物的得率計(jì)算如下：

式中：

D——模擬胃腸消化產(chǎn)物得率，%；

m1——模擬胃腸消化產(chǎn)物干粉質(zhì)量，g；

m0——所用瑪咖蛋白質(zhì)量，g。

式中：

D1——預(yù)酶解后模擬胃腸消化產(chǎn)物得率，%；

m2——預(yù)酶解后模擬胃腸消化產(chǎn)物干粉質(zhì)量，g；

m——所用瑪咖蛋白質(zhì)量，g。

1.3.4 水解度（DH）的測定

1.3.4.1 瑪咖蛋白的酸水解

參照Bandyopadhyay等[14]的方法，取10 mg瑪咖蛋白，加入4.00 mL的HCl溶液（6 mol/L），混勻后密封于安瓿瓶中，在110 ℃下水解24 h，得瑪咖蛋白完全水解液。

1.3.4.2 水解度（DH）的測定

采用J.Adler-Nissen[15]的方法（TNBS法）測定水解度，即取含有0.25×10-3~2.5×10-3amino equiv/L的酶解液（用1% SDS溶液稀釋），加入2.00 mL磷酸緩沖液（pH值8.2），加入2.00 mL的0.1% TNBS溶液，振蕩搖勻，水浴60 min（50±1 ℃），鋁箔避光；最后加入4.00 mL的0.10 mol/L的HCl溶液終止反應(yīng)，并于室溫下靜置30 min后在波長340 nm下完成吸光值的測定。

水解度的計(jì)算公式[16]如下：

式中：

DH——水解度，%；

hs——瑪咖蛋白的氨基酸含量，mmol/L;

h0——消化產(chǎn)物的氨基酸含量，mmol/L；

ht——瑪咖蛋白經(jīng)過酸水解后的氨基酸含量，mmol/L，為1.55 mmol/L。

以L-亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，用1% SDS溶液配制濃度為0~2.0 mmol/L[17]的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述方法測定，并以在波長340 nm下測定的吸光值為縱坐標(biāo)，以L-亮氨酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 可溶性肽得率（YSP）的測定

采用福林酚法測定可溶性肽含量，按照說明書方法進(jìn)行測定：

稱取2.0 mg預(yù)酶解消化產(chǎn)物配制濃度為 200 μg/mL的樣品溶液，加入5.0 mL試劑甲，混勻后靜置10 min，再加入0.5 mL試劑乙，立即搖勻，保溫30 min，最后于波長500 nm比色。整個(gè)反應(yīng)過程溫度應(yīng)控制在20~25 ℃。

可溶性肽得率的計(jì)算公式為：

式中：

YSP——可溶性肽得率，%；

Ts——可溶性肽含量，μg/mL；

Tp——底物中的蛋白含量，為153.55 μg/mL。

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，配制1.0 mL濃度為0~250 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，按上述方法測定，并以波長500 nm下吸光值為縱坐標(biāo)，以牛血清白蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 游離氨基酸含量的測定

測定方法參照GB/T 30987-2020[18]全自動(dòng)氨基酸分析儀法。色譜條件：色譜柱為磺酸型陽離子交換柱；按標(biāo)準(zhǔn)配制流動(dòng)相B1~B6，分離流動(dòng)相流量為 0.35 mL/min，檢測流動(dòng)相流量為0.30 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；檢測波長為570 nm和440 nm。分別吸取不同濃度的系列混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液得到21種氨基酸的峰面積，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并通過保留時(shí)間識別各氨基酸出峰順序。將樣品中各氨基酸色譜峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算含量，以水為空白樣品，得各樣品中氨基酸凈含量。

1.3.7 分子量分布測定

測定方法參照GB/T 22729-2008[19]：采用Waters 1525高效液相色譜系統(tǒng)測定各瑪咖蛋白消化產(chǎn)物的分子量。稱取100 mg樣品于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，經(jīng)0.22 μm微孔過濾膜過濾后進(jìn)樣。色譜柱：TSKgel 2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈/水/三氟乙酸（45/55/0.1，V/V/V）；檢測波長：UV 220 nm；流速：0.5 mL/min。

稱取細(xì)胞色素C（Mw 12 400 u）、桿菌酶（Mw 1 450 u）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（Mw 451 u）和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（Mw 189 u）標(biāo)準(zhǔn)品用流動(dòng)相溶解配制成0.2 mg/mL左右的標(biāo)準(zhǔn)分子量溶液。以標(biāo)準(zhǔn)品的logMw及洗脫時(shí)間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：

1.3.8 免疫調(diào)節(jié)活性的評價(jià)

1.3.8.1 消化產(chǎn)物及肽對RAW 264.7細(xì)胞的毒性

取對數(shù)生長期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7，以每孔1.0×105個(gè)的數(shù)量接種于96孔板，用DMEM培養(yǎng)液（含1%雙抗，10%胎牛血清，V/V）在5% CO2、37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h后棄去上清液，加入100 μL含不同濃度樣品的新鮮培養(yǎng)液（瑪咖蛋白消化產(chǎn)物所用濃度為500 μg/mL，瑪咖肽所用濃度為250 μg/mL），以正常培養(yǎng)液為陰性對照，培養(yǎng)24 h。棄去上清液，加入100 μL含10% CCK-8試劑的培養(yǎng)液，培養(yǎng)1 h后于波長450 nm處測定吸光值。

細(xì)胞存活率的計(jì)算公式為：

式中：

X——細(xì)胞存活率，%；

As——樣品吸光值；

Ac——陰性對照組吸光值。

1.3.8.2 細(xì)胞因子TNF-α的測定

取對數(shù)生長期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7，以每孔1.0×105個(gè)的數(shù)量接種于96孔板，用DMEM培養(yǎng)液（含1%雙抗，10%胎牛血清，V/V）在5% CO2、37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h后棄去上清液，加入100 μL含不同濃度樣品的新鮮培養(yǎng)液，以正常培養(yǎng)液為陰性對照，培養(yǎng)24 h。收集上清液，用小鼠TNF-αELISA試劑盒測定細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)量，具體操作按說明書進(jìn)行。

1.3.9 消化產(chǎn)物中肽序列的測定

1.3.9.1 消化產(chǎn)物的超濾分組

稱取25 mg免疫調(diào)節(jié)活性最高的瑪咖消化產(chǎn)物，配制濃度為0.25 mg/mL的溶液，并超濾（5 000 r/min離心，60 min）取分子量小于3 ku的部分。為盡量避免截留量為3 ku的超濾膜被堵塞，在進(jìn)行3 ku超濾分組前先將樣品溶液經(jīng)過截留量為10 ku（5 000 r/min離心，30 min）的超濾管分組。最后經(jīng)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥得分子量小于3 ku部分消化產(chǎn)物。

1.3.9.2 消化產(chǎn)物中肽序列的測定

用樣品溶解液（含φ=0.1%甲酸、φ=2%乙腈）溶解1.3.9.1所得消化產(chǎn)物，離心（4 ℃，13 200 r/min，20 min），取上清，進(jìn)入液相色譜分離，分離后的肽段直接進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行在線檢測。質(zhì)譜原始文件經(jīng)過MM File Conversion軟件處理轉(zhuǎn)換，得到MGF格式文件，然后用MASCOT檢索UniProt數(shù)據(jù)庫（Mascot：http://www.matrixscience.com/）。

1.3.10 免疫調(diào)節(jié)肽的篩選

1.3.10.1 預(yù)篩選

根據(jù)免疫調(diào)節(jié)活性肽具有肽鏈短、一般由2~10個(gè)氨基酸組成的特點(diǎn)[20,21]，對1.3.9.2所得肽段進(jìn)行篩選。

1.3.10.2 生物活性評估

將1.3.10.1篩選所得肽段導(dǎo)入Bioware網(wǎng)站的PeptideRanker程 序[22]（ http://distilldeep.ucd.ie/ PeptideRanker/）預(yù)測肽段具有生物活性的可能性，并選擇可能性評分大于0.5的肽段。

1.3.11 HPEPDOCK分子對接篩選

將1.3.10.2篩選得到的肽段導(dǎo)入HPEPDOCK網(wǎng)站[23]，與模式識別受體TLR2（PDB ID:1FYW）及TLR4（PDB ID:5IJD）進(jìn)行分子對接，篩選分子對接親和力最強(qiáng)的10個(gè)肽段進(jìn)行合成。

1.3.12 肽段合成

采用Fmoc固相合成法合成1.3.10.2篩選得到的10個(gè)肽段，該步驟委托吉爾生化（上海）有限公司完成。

1.3.13 AutoDock分子對接分析

利用軟件 ChemBio3D Ultra 14.0及AutoDockTools-1.5.6對1.3.11篩選所得肽段經(jīng)進(jìn)行設(shè)計(jì)及處理。根據(jù)受體蛋白的ID從PDB數(shù)據(jù)庫下載蛋白結(jié)構(gòu)，利用PyMOL 2.3.0 AutoDockTools-1.5.6處理受體蛋白。最后，利用PyMOL 2.3.0和LIGPLOT V 2.2.4分析對接結(jié)果的相互作用模式。

1.3.14 HOMO分析

使用GaussView 5.0以及Gaussian 09進(jìn)行密度泛函數(shù)理論計(jì)算；使用Gaussian 09以B3LYP/6-31制圖并分析活性位點(diǎn)。

1.3.15 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析，將P＜0.05視為差異顯著；使用Origin 2021進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)酶解對瑪咖蛋白可消化性的影響

以L-亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品測定的水解度標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.286 1x-0.000 3（R2=0.999 6）；根據(jù)牛血清蛋白測定的可溶性肽得率標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.000 6x+0.000 9（R2=0.999 7）。

以僅經(jīng)過體外模擬胃腸消化所得的消化產(chǎn)物MCPH為陰性對照，消化產(chǎn)物B1~B5的得率、水解度（DH）及可溶性肽得率（YSP）如表2。

表2 六組消化產(chǎn)物的得率、水解度及可溶性肽得率Table 2 Yields, DHs, YSPs of the six digestion products

水解度是用于監(jiān)控及描述蛋白水解程度的重要指標(biāo)。瑪咖蛋白經(jīng)模擬胃腸消化后所得MCPH的水解度為22.91%，低于一些常見食物蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物的水解度，如小麥胚芽蛋白的為40.25%[24]，豌豆蛋白的為53.62%[25]，非洲核桃蛋白的為73.47%[26]。其原因可能是瑪咖蛋白為堿溶蛋白，水溶性較差，在腸液中的分散性較低，難以與蛋白酶發(fā)生相互作用[27]。與MCPH相比，B1~B5的消化產(chǎn)物得率及水解度得到了顯著的提高（P＜0.05），其中消化產(chǎn)物得率的提高幅度為10%~ 30%，水解度提高約35%。蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后會(huì)產(chǎn)生分子量不同的肽以及游離氨基酸；酶解程度越高，產(chǎn)生的可溶性肽和游離氨基酸的含量也越高。因此，可溶性肽和游離氨基酸的得率也可用于評價(jià)蛋白質(zhì)的可消化性。MCPH的可溶性肽得率為17.20%，低于常見食物蛋白的數(shù)值，如小麥胚芽蛋白的為40.25%[24]，大豆蛋白的為88%[28]以及卵清蛋白的為99%[29]，而B1~B5的可溶性肽得率皆明顯高于MCPH，增長幅度為5%~16%。由此可見，預(yù)酶解能顯著提高瑪咖蛋白經(jīng)胃腸消化后產(chǎn)生的可溶性肽的含量。從表3可知，五組經(jīng)預(yù)酶解處理所得產(chǎn)物的游離氨基酸總量皆明顯高于MCPH的，增長幅度為37%~92%；其中B5的增長幅度最大，游離氨基酸總量的增長率約為92%，說明預(yù)酶解處理能提高瑪咖蛋白胃腸消化產(chǎn)生的游離氨基酸含量。

表3 六組消化產(chǎn)物的游離氨基酸含量（mg/100 g瑪咖蛋白）Table 3 Free amino contents of the six digestion products (mg/100 g maca proteins)

續(xù)表3

綜上，經(jīng)過預(yù)酶解處理后，瑪咖蛋白胃腸消化產(chǎn)物的水解度、可溶性肽得率及游離氨基酸含量皆得到了顯著的提高（P＜0.05），意味著預(yù)酶解處理能使瑪咖蛋白具有更高的消化率和生物可及性[30]，更易被人體所吸收利用。

2.2 各組消化產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)活性

巨噬細(xì)胞是先天性免疫的重要組成部分，其發(fā)揮免疫功能的途徑包括吞噬病原體、分泌細(xì)胞毒性分子（如NO）以及分泌細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-6等）[21]。小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7是評價(jià)天然產(chǎn)物免疫調(diào)節(jié)活性最常用的細(xì)胞模型，故本研究采用該模型探究MCPH及B1~B5各組消化產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)活性，具體為各組消化產(chǎn)物對小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7的存活率和TNF-α分泌情況的影響。由圖2可見，500 μg/mL的各組消化產(chǎn)物對小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7無明顯毒性作用。在該濃度下，六組消化產(chǎn)物皆能提高TNF-α的分泌量。相比于MCPH，經(jīng)相同質(zhì)量濃度的B1~B5刺激的RAW 264.7細(xì)胞的TNF-α表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化或略有降低，但由于B1~B5各組的消化產(chǎn)物得率比MCPH高10%~30%，即經(jīng)預(yù)酶解后，瑪咖蛋白通過胃腸消化所產(chǎn)生的具有免疫活性的消化產(chǎn)物更多。因此，預(yù)酶解實(shí)際上增強(qiáng)了瑪咖蛋白的免疫活性，這與Cian等[31]的發(fā)現(xiàn)相同。

圖2 瑪咖蛋白消化產(chǎn)物對RAW 264.7細(xì)胞的存活率及TNF-α分泌量的影響Fig.2 Effects of maca digestion products on the viability and secretion of TNF-αof cell line RAW 264.7

蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物中的主要活性物質(zhì)為小分子肽。一般認(rèn)為，生物活性肽多為含2~10個(gè)氨基酸殘基的短肽。在對食源免疫調(diào)節(jié)肽的研究中，Ahn等[32]發(fā)現(xiàn)鮭魚副產(chǎn)物中的免疫調(diào)節(jié)肽分子量集中在1 000~ 2 000 u，Ndiaye等[33]發(fā)現(xiàn)黃豌豆種子免疫調(diào)節(jié)肽為小分子肽（1 000 u），而Wu等[34]從小麥胚芽蛋白中獲得的免疫調(diào)節(jié)肽的分子量范圍為300~1 450 u。由表4可知，經(jīng)過預(yù)酶解處理后，瑪咖蛋白模擬胃腸消化產(chǎn)物中分子量為500~2 000 u的小分子肽含量略有提高，其中B4中分子量處于500~2 000 u范圍的小分子肽占比最大，這可能是B4活性更高的原因。

表4 六組消化產(chǎn)物的分子量分布Table 4 Molecular weight distributions of the six digestion products

2.3 預(yù)酶解消化產(chǎn)物B4中肽段的序列及免疫調(diào)節(jié)活性

由于B4展現(xiàn)出的免疫調(diào)節(jié)活性最高，因此后續(xù)選擇預(yù)酶解消化產(chǎn)物B4進(jìn)行肽段序列測定及免疫調(diào)節(jié)活性肽的篩選。多項(xiàng)研究表明，免疫調(diào)節(jié)肽為分子量在3 000 u以下的小分子肽[35]，故本實(shí)驗(yàn)選擇超濾后分子量小于3 000 u的組分進(jìn)行肽段的測序，而該超濾組分凍干物的得率為65.10%。經(jīng)鑒定，B4中分子量小于3 000 u的組分中共含有15 154個(gè)肽，其中符合免疫活性肽組成氨基酸數(shù)量一般規(guī)律（2~10個(gè)）[20,21]的有2 546個(gè)肽段。將符合條件的肽段導(dǎo)入Peptide Ranker程序評分，其中分?jǐn)?shù)＞0.5（具有生物活性的可能性＞50%，一般可被認(rèn)為具有生物活性）的肽段數(shù)量為437，占比為17.17%。另外，實(shí)驗(yàn)室前期從MCPH中經(jīng)超濾小于3 000 u活性組分經(jīng)測定含有3 345條肽，數(shù)量較B4的少。有研究指出，免疫活性肽激活巨噬細(xì)胞的機(jī)制包括了激活其細(xì)胞膜表面的toll-like受體（TLRs）[31]，其中TLR2和TLR4是免疫活性肽最為常見的受體。HPEPDOCK能預(yù)測蛋白質(zhì)-肽段的相互作用力，并給出結(jié)合模型的評分，分?jǐn)?shù)的負(fù)值越大，表明該肽段與蛋白質(zhì)受體的親和力越強(qiáng)[23]。因此，肽段最后被導(dǎo)入HPEPDOCK網(wǎng)站分別與模式識別受體TLR2、TLR4進(jìn)行分子對接，而評分在前10名的肽段如表5所示。免疫調(diào)節(jié)肽往往是富含疏水性氨基酸、芳香族氨基酸及帶電荷[20]的小分子肽。由表5可知，10個(gè)最終篩選得到的肽段分子量集中在900~1 300 u，皆帶有電荷，并都富含疏水性氨基酸及芳香族氨基酸，其中，疏水性的芳香族氨基酸（苯丙氨酸及色氨酸）占各肽段氨基酸個(gè)數(shù)的12.50%~33.33%，這可能暗示著10個(gè)肽段具有較強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)活性。

表5 十個(gè)篩選肽段的基本信息Table 5 Basic informations of the ten selected peptides

為進(jìn)一步驗(yàn)證這10個(gè)肽段的免疫活性，本研究隨后對其進(jìn)行了合成，并利用RAW 264.7細(xì)胞探究了其免疫調(diào)節(jié)活性。由圖3結(jié)果可知，在250 μg/mL的濃度下，10條肽段皆對小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7無毒性，且皆能不同程度地促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞分泌TNF-α。其中No.1肽NPYPFFGFSI展現(xiàn)出的免疫調(diào)節(jié)活性最強(qiáng)，這與分子對接評分的結(jié)果一致，但其他肽段活性的高低與分子對接的結(jié)果之間存在一定的差異；很多其他研究[36,37]也發(fā)現(xiàn)分子對接的結(jié)果與活性肽實(shí)際驗(yàn)證的結(jié)果并不完全一致。事實(shí)上，分子對接是利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行的一種理想化實(shí)驗(yàn)，化合物的活性在實(shí)際環(huán)境中還會(huì)受溶解度、溶液中離子強(qiáng)度和pH值等多種因素的影響，因此會(huì)與實(shí)際結(jié)果有一定的出入。

圖3 瑪咖肽對RAW 264.7細(xì)胞的存活率及TNF-α分泌量的影響Fig.3 Effects of maca peptides on the viability and secretion of TNF-α of cell line RAW 264.7

2.4 瑪咖免疫調(diào)節(jié)肽的構(gòu)效關(guān)系

2.4.1 瑪咖免疫調(diào)節(jié)肽與受體的相互作用模式

在分子相互作用的研究中，如AutoDock的分子模擬軟件常備用于模擬、分析配體-蛋白的結(jié)合情況。由于篩選打分結(jié)果僅反映肽段與受體結(jié)合程度的相對排名情況，并未體現(xiàn)活性肽與受體的相互作用模式，故通過AutoDock探究No.1肽NPYPFFGFSI與TLR2和TLR4的相互作用模式。由表6可知，No.1肽NPYPFFGFS與TLR2、TLR4的結(jié)合親和力皆小于 -5.0 kcal/mol，說明其能與兩個(gè)受體發(fā)生相互作用[8]；本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)瑪咖胃腸消化產(chǎn)物中活性最強(qiáng)的肽段為RNPFLP，而No.1肽與TLR2的親和結(jié)合力強(qiáng)于RNPFLP的-6.9 kcal/mol，與TLR4的親和結(jié)合力則不及RNPFLP的-10.7 kcal/mol[8]。由圖4可知，No.1肽與TLR2、TLR4之間的作用力主要為氫鍵及疏水作用力：與TLR2之間共存在3個(gè)氫鍵和22個(gè)疏水位點(diǎn)，與TLR4之間共存在8個(gè)氫鍵與12個(gè)疏水位點(diǎn)。另外，No.1肽與TLR2的結(jié)合親和力更高，則其傾向于通過激活TLR2來刺激RAW 264.7細(xì)胞分泌更多的TNF-α。

表6 No.1肽與TLR2、TLR4的結(jié)合親和力Table 6 Binding affinities between peptide No.1 and TLR2, TLR4

圖4 No.1肽與TLR2（a，c）、TLR4（b，d）的相互作用模式Fig.4 Interaction patterns between peptide No.1 and TLR2 (a, c)/TLR4 (b, d)

2.4.2 瑪咖免疫調(diào)節(jié)肽的活性位點(diǎn)判斷

根據(jù)前線軌道理論，分子的反應(yīng)活性隨HOMO（最高占據(jù)分子軌道）能量的升高而增強(qiáng)，即位于HOMO的基團(tuán)更有可能發(fā)生親核反應(yīng)，活性更高[38]。No.1肽NPYPFFGFSI中對HOMO貢獻(xiàn)最大的原子是C28（表7），貢獻(xiàn)比例為19.314%，則No.1肽的活性位點(diǎn)最有可能位于C28，HOMO主要分布在酪氨酸上（圖5），酪氨酸與TLR2之間存在疏水作用，與TLR4之間形成了氫鍵（圖4）；另外，酪氨酸也被認(rèn)為與肽的抗氧化[39]、抗癌[20]活性有關(guān)。No.1肽的HOMO都主要分布在芳香族氨基酸上，與免疫調(diào)節(jié)肽一般都含有芳香族氨基酸的規(guī)律[20,21]相符。另外，No.1肽的可能活性位點(diǎn)還包括O22-H105、C25、C24-H107和C26-H108。

表7 No.1肽中各原子對HOMO的貢獻(xiàn)比例Table 7 Contribution rates of atoms of peptide No.1

圖5 No.1肽的HOMO軌道分布圖（a）及分子結(jié)構(gòu)式（b）Fig.5 HOMO distribution (a) and molecular formula (b) of peptide No.1

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)預(yù)酶解的加工處理方式能有效增強(qiáng)瑪咖蛋白的可消化性，以及提高瑪咖蛋白經(jīng)胃腸消化后產(chǎn)生的活性肽和游離氨基酸的含量。其中，經(jīng)菠蘿蛋白酶預(yù)酶解處理得到的消化產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)活性最強(qiáng)；該消化產(chǎn)物中活性最強(qiáng)的肽段為NPYPFFGFSI，而該肽段的免疫調(diào)節(jié)活性與所含的酪氨酸密切相關(guān)。本研究的結(jié)果表明預(yù)酶解的處理方式能夠改善瑪咖蛋白的可食用性，提高其營養(yǎng)學(xué)價(jià)值。