鹽制巴戟天多糖結(jié)構(gòu)表征及其免疫活性

賴嵐玉，羅志鋒，朱思陽，陶倩，黎攀，杜冰*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642）（2.無限極（中國）有限公司，廣東廣州 510623） （3.花安堂生物科技集團有限公司，廣東廣州 511500）

巴戟天為茜草科植物巴戟天（Morinda officinalisnHow.）的干燥根，全年均可采挖，其產(chǎn)地主要分布于廣東、廣西、福建、海南等地。近幾年巴戟天作為保健食品原料，其功能活性物質(zhì)備受大家關(guān)注。在中醫(yī)理論中認為巴戟天味辛、甘，性微溫，歸腎、肝經(jīng)，具祛風濕、強筋骨等功效[1]。現(xiàn)代科學也證明巴戟天具有廣泛的藥理和保健功能，其具有免疫調(diào)節(jié)[2]、抗骨質(zhì)疏松[3,4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]和抗抑郁[7]等多種生物活性，其中主要活性成分有多糖[3,4,6]、寡糖[7]、 蒽醌[8]和環(huán)烯醚萜[9]等，多糖作為巴戟天中活性成分之一[10]，是一類具有功能活性的大分子物質(zhì)。多糖是植物中一種功能活性物質(zhì)，具有副作用小，安全性較高等特點，是功能性食品及保健食品開發(fā)的熱點，近年來備受專家學者們的關(guān)注。

鹽制巴戟天作為傳統(tǒng)炮制加工的一種方式，早在宋代的《太平惠民和劑局方》中有提及“巴戟鹽揚浸”?，F(xiàn)在鹽制仍然是巴戟天炮制的主要方式，《中華人民共和國藥典（2020）》亦收載有鹽制巴戟天[1]。關(guān)于鹽制巴戟天多糖的研究還處于提取工藝以及含量測定階 段[11]?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)證實，多糖結(jié)構(gòu)與其功能活性密切相關(guān)[12]。因此對鹽制巴戟天多糖結(jié)構(gòu)表征是研究其功能活性的重要一步。雖然已有人對巴戟天多糖進行結(jié)構(gòu)鑒定[4,6,13,14]，但是炮制前后得到多糖會有所不同。在萬曉瑩[15]的研究中酒制前后黃精多糖有所不同。因此對鹽制巴戟天多糖進行結(jié)構(gòu)表征，對巴戟天多糖結(jié)構(gòu)的研究具有重要意義。

鑒于此，本研究中采用離子交換纖維素DEAE-52和葡聚糖凝膠Sephadex G100柱分離純化得到鹽制巴戟天多糖（Salt-processedMorinda officinalisnPolysaccharides，SMP）得到多糖SMP-4，測定其分子量，單糖組成和結(jié)構(gòu)等并研究其免疫活性。探究SMP的結(jié)構(gòu)并評價其免疫活性，為鹽制巴戟天多糖的研究奠定理論基礎(chǔ)。同時，巴戟天作為國家衛(wèi)健委規(guī)定可用于保健食品的原料，對于其活性成分的研究，為巴戟天在功能性食品方面的進一步開發(fā)利用指明方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

抽芯巴戟天，廣東省云浮市郁南縣大方鎮(zhèn)巴戟天市場；RAW264.7巨噬細胞，中山大學細胞庫；離子交換纖維素DEAE-52（DE-52）、葡聚糖凝膠Sephadex G100等為國產(chǎn)分析純；小鼠白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和CCK-8 ELISA試劑盒，欣博盛生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Vertex 70傅立葉變換紅外光譜儀，美國布魯克·道爾頓公司；LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；Heratherm?高端微生物培養(yǎng)箱、Evolution 300紫外可見分光光度計、Multiskan? FC酶標儀、Thermo Scientific? ISQ? 7000 GC-MS單四極桿，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Hei-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph公司；SHZ-III循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 鹽制巴戟天制備

將巴戟天去除泥土，用清水洗凈，瀝干待用。洗凈瀝干水分的巴戟天按料液比1:1（g/mL）加入2%（m/V）鹽水煮60 min，撈出瀝干。60 ℃熱風干燥24 h，干燥后粉碎過24目篩，得干燥的鹽制巴戟天粉末。

1.3.2 鹽制巴戟天粗多糖提取

準確稱取鹽制巴戟天粉末，按料液比1:60（g/mL）加入φ=80%乙醇，80 ℃回流兩次，每次2 h，過濾后取濾渣。再按料液比1:100（g/mL）加入蒸餾水，100 ℃回流提取、過濾、減壓濃縮，加入4倍體積的φ=95%乙醇，4 ℃靜置12 h。取沉淀加少量φ=75%乙醇溶解后，在4 000 r/min離心10 min，得到的沉淀用少量水溶解后，采用Sevage法脫蛋白質(zhì)，再裝入透析袋中，透析至透析液電導率≤1.5 μs/cm。透析后的多糖溶液真空冷凍干燥48 h，得到鹽制巴戟天粗多糖。

1.3.3 鹽制巴戟天粗多糖純化

將鹽制巴戟天粗多糖樣品配制成濃度為10 mg/mL的溶液，用0.22 μm濾膜過膜處理后，上樣到DE-52交換柱（Φ1.5×40.0 cm），流速為2.0 mL/min，用0.00、0.02、0.10、0.30 mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，自動收集器收集分離組分（5 mL/管）。共收集到4個不同組分：SP-1、SP-2、SP-3、SP-4，苯酚-硫酸法測定收集組分的多糖含量。再使用Sephadex G100柱對含量較高的組分SP-4（Φ1.5×40 cm）進一步純化，最后通過減壓濃縮、透析脫鹽和真空冷凍干燥得到純化多糖（SMP-4）。

1.3.4 多糖結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.4.1 傅里葉變換紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)T-IR）檢測

在無水的條件下，將1 mg的SMP-4粉末與100 mg KBr粉末混合，充分磨成1 mm微球，用壓片機壓片，用Vertex 70傅立葉變換紅外光譜儀在4 000~400 cm-1范圍內(nèi)進行掃描分析SMP-4。

1.3.4.2 單糖組成檢測

參考黃曉蘭等[16]的方法。精確稱取100 mg SMP-4，加入8 mL的2 mol/L H2SO4，加熱回流6 h，冷卻后加入飽和Ba(OH)2溶液中和至中性，過濾，將濾液旋干，加入14 mg鹽酸羥胺和1 mL吡啶置于90 ℃水浴加熱1 h，取出冷卻至室溫，加入5 mL乙酸酐，再于90 ℃水浴加熱1 h，冷卻至室溫，加入10 mL蒸餾水破壞乙酸酐。用氯仿對乙酰化產(chǎn)物進行萃取，經(jīng)蒸餾水洗滌后，用無水硫酸鈉脫水后氮吹濃縮至 1 mL，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析，得到SMP-4的圖譜。采用核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的標準品進行GC-MS分析，得到單糖標準品圖譜。SMP-4通過與單糖標準品色譜圖的保留時間，確定單糖組成。

GC-MS條件：色譜柱為SE-30，柱溫初溫100 ℃，以10 /min℃ 升溫至280 ℃，載氣為氦氣，柱前壓為70.0 kPa，分流比為10:1，進樣量為1 μL。

1.3.4.3 相對分子量測定

參考黃曉蘭等[16]的方法。采用高效凝膠滲透色譜（HPGPC）分析SMP-4的分子量。準確稱取10 mg SMP-4用0.050 mol/L含0.05% NaN3的NaH2PO4- Na2HPO4緩沖液溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過后進行HPGPC分析。根據(jù)峰面積歸一化求得該多糖的相對質(zhì)量分數(shù)。

HPGPC條件：流動相為0.1 mol/L磷酸緩沖溶液，流速為0.5 mL/min，進樣量為20 μL溶液（質(zhì)量濃度為1 g/L），色譜柱和RID的溫度均保持在35.0 ℃。 1.3.4.4 甲基化檢測

參考鄭恒光等[17]方法，稍作修改。準確稱取10 mg SMP-4加入5 mL無水二甲基亞砜溶解，再加入100 mg NaOH粉末，超聲處理下直至完全溶解，冷卻至室溫，緩慢加入2 mL碘甲烷溶液啟動甲基化反應，避光反應24 h后加入2 mL蒸餾水終止甲基化反應。再加入3 mL氯仿進行萃取，重復三次，合并萃取液，60 ℃減壓旋干。加入10 mL 4 mol/L三氟乙酸，100 ℃水解2 h，再在60 ℃減壓旋干，加入5 mL乙醇，減壓旋干，加入2 mL蒸餾水溶解，用1% NaOH溶液將pH值調(diào)至10，加入10 mg NaBH4，再室溫反應6 h。加入冰乙酸溶液將pH值調(diào)至5.5，再60 ℃減壓濃縮，加入 1 mL吡啶和1 mL乙酸酐100 ℃反應1 h后加入1 mL蒸餾水終止反應。加入2 mL二氯甲烷萃取，重復三次，合并萃取液加入無水硫酸鈉干燥過膜備用。

GC-MS條件：色譜柱為HP-5石英毛細管柱，柱溫初溫150 ℃，以10 /min℃ 升溫至280 ℃，載氣為氦氣，分流比為50:1，進樣量為1 μL。

1.3.4.5 核磁共振波譜（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMR）檢測

準確稱取10 mg SMP-4溶解于600 μL D2O， 3 000 r/min離心10 min，取上清液于核磁管中，用500 Hz核磁共振波譜儀檢測1H-NMR信號和13C-NMR信號。

1.3.5 巴戟天多糖免疫活性研究

1.3.5.1 細胞培養(yǎng)

參考于弋涵等[18]方法，稍作修改。RAW264.7巨噬細胞采用添加了10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基（含0.5%青鏈霉素和鏈霉素）的中進行培養(yǎng)，置于5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育。當細胞鋪板率達到培養(yǎng)瓶底面積的80%以上時，用移液槍吸凈原培養(yǎng)基并吸取3 mL PBS對漂浮的死細胞進行洗滌，重復3次。然后用2 mL培養(yǎng)基將細胞吹打至完全脫落，將細胞懸液濃度為每毫升1.0×104個，按每孔加入l00 μL的細胞懸浮液接種至96孔板中，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.3.5.2 細胞增殖活性以及細胞因子分泌水平測定

按1.3.5.1節(jié)對細胞培養(yǎng)完成后，吸盡培養(yǎng)液并用PBS進行洗滌。對照組（Control組）每孔加入200 μL完全培養(yǎng)基；陽性對照組（LPS組）每孔加入200 μL含10 μg/mL LPS溶液的完全培養(yǎng)基；實驗組每孔加入200 μL含不同質(zhì)量濃度（15.625、31.25、62.5、125、250和500 μg/mL）的SMP-4溶液完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個平行，孵育24 h。干預完成后，采用CCK-8 ELISA試劑盒測定巨噬細胞RAW264.7增殖活性，采用ELISA試劑盒測定TNF-α和IL-1β的分泌水平。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每項實驗進行三次以上重復實驗，收集所有結(jié)果，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示。采用SPSS 26.0版本的單因素方差分析（ANOVA）分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學意義。P值小于0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽制巴戟天多糖純化

圖1a為采用DEAE-52柱純化鹽制巴戟天粗多糖得到的洗脫曲線，共得到了4個不同的多糖組分，其中SP-4組分含量明顯高于其他組分，收集SP-4組分用于后續(xù)的實驗。圖1b為采用Sephadex G100柱純化SMP-4得到的洗脫曲線，結(jié)果顯示得到無拖尾單一峰，說明組分純度較高，利于后面的實驗。SMP-4得率為0.085%，純度為91.46%。

圖1 鹽制巴戟天多糖洗脫曲線Fig.1 Elution curve of polysaccharide from salt-processed Morinda officinalis

2.2 SMP-4結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 SMP-4的FT-IR譜圖分析

SMP-4的FT-IR檢測圖如圖2所示，SMP-4在 4 000~400 cm-1范圍內(nèi)具有多糖特征峰。如在3 403 cm-1處為多糖特征峰，峰型又強又寬是由O-H的拉伸振動形成；在2 932 cm-1處的吸收峰是由C-H的拉伸和彎曲振動形成的[19]。在1 240 cm-1處的吸收峰是吡喃糖的C-O-H伸縮振動引起的。1 093 cm-1和537 cm-1處的吸收峰是吡喃糖苷上的C=O伸縮振動引起，SMP-4具有吡喃環(huán)糖殘基[20,21]。1 044 cm-1出現(xiàn)的吸收峰，是由呋喃環(huán)C-O-C伸縮震動引起的，說明SMP-4含有呋喃糖[22]。SMP-4同時包含有吡喃糖和呋喃糖。在639 cm-1處的吸收峰可能是羰基的C=O扭曲振動形成的[23]。在 1 613 cm-1吸收峰是由N-H彎曲振動引起的[24]。在1 750~ 1 700 cm-1無吸收峰，表示SMP-4中不含有糖醛酸[25]。

圖2 SMP-4的FT-IR檢測圖Fig.2 FT-IR detection figure of SMP-4

2.2.2 SMP-4的單糖組成分析

多糖是由單糖殘基通過糖苷鍵連接而成的，因此在分析多糖結(jié)構(gòu)中，分析單糖組成是關(guān)鍵性步驟。采用GC-MS分析得到單糖標準品和SMP-4的結(jié)果見圖3。

圖3 SMP-4(a)和單糖標準品(b)的GC-MS譜圖Fig.3 GC-MS profile of SMP-4 (a) and monosaccharide standard (b)

對色譜圖分析得到結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明SMP-4由核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其中阿拉伯糖含量最高，達到了54.74%。其次為半乳糖，含量達到了22.58%。這與之前的研究中，單糖的種類較為一致，相對摩爾比具有較大的差異。如Zhang等[6]從巴戟天中分離具有抗氧化活性酸性多糖APMO由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，相對摩爾比為1:48.58:0.86:1.67:0.74:14.92。何傳波等[13]從巴戟天分離出的一種多糖主要有葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖構(gòu)成，摩爾比為5.08:2.91:1。何傳波等[14]關(guān)于分離純化巴戟天多糖的研究中，得到兩種多糖MOHP-Ⅰ和MOHP-Ⅲ其單糖組成分別為葡萄糖、果糖和阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖以及半乳糖。

表1 SMP-4的單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of SMP-4

2.2.3 SMP-4的相對分子量分析

多糖的分子量與其免疫活性有著密切的關(guān)系。HPGPC的檢測結(jié)果如表2，SMP-4的相對分子量為1.32×105u。分布列（Mw/Mn）為1.41＜2，說明SMP-4的有良好的均一性和溶解性，在水中具有較小的粘度，能夠增大多糖與細胞特定基團的接觸面積[26]。

表2 SMP-4分子量Table 2 Molecular weight of SMP-4

2.2.4 SMP-4的甲基化分析

在多糖的研究中，常采用甲基化分析多糖中單糖殘基連接的方式。SMP-4經(jīng)GC-MS分析，得到了SMP-4的單糖殘基組成、單糖殘基結(jié)構(gòu)、連接和分支，對SMP-4甲基化分析結(jié)果見表3。SMP-4主要由→3)-D-Araf-(1→、→6)-D-Galp-(1→、和→2)-D-Rhap-(1→殘基組成，摩爾比分別為58.35%、23.11%和12.54%。SMP-4是以(1→3)糖苷鍵為主要糖苷鍵，→3)-D-Araf-(1→、→6)-D-Galp-(1→為主要構(gòu)成的大分子多糖。這與FT-IR數(shù)據(jù)和單糖組成分析的結(jié)果一致。

表3 SMP-4甲基化分析結(jié)果Table 3 Methylation analysis results of SMP-4

2.2.5 SMP-4的NMR圖譜分析

SMP-4的1H-NMR圖譜和13C-NMR圖譜如圖4、圖 5所示。多糖的特征峰[27]大多集中在δH3.0×10-6~5.5×10-6和δC60.0×10-6~100.0×10-6，本實驗結(jié)果中氫譜和碳譜圖都符合這一特征。在δH4.700×10-6處出現(xiàn)的強烈信號是D2O中的HDO所導致的。一般認為δH＞5.000×10-6是α構(gòu)型糖苷鍵氫信號，δH＜5.00×10-6是β構(gòu)型糖苷鍵信號[28]。SMP-4存在有δH5.040×10-6、5.133×10-6、5.692×10-6異位質(zhì)子信號表明其存在α構(gòu)型糖苷鍵。SMP-4存在有δH4.688×10-6、4.947×10-6異位質(zhì)子信號表明其存在β構(gòu)型糖苷鍵。在δH3.200×10-6~4.500×10-6環(huán)質(zhì)子區(qū)域的信號對應于糖環(huán)中從C-2到C-6的質(zhì)子，而SMP-4的1H-NMR圖譜中δ值為3.200×10-6~4.500×10-6的信號被堆疊，表明多糖分子量較大，聚合程度高，結(jié)構(gòu)復雜導致信號重疊，較難分辨。在δH5.500×10-6~5.843×10-6（δH5.545×10-6、5.685×10-6、5.692×10-6）范圍內(nèi)出現(xiàn)信號峰中說明 SMP-4 存在α-呋喃糖，在δH5.000×10-6~5.500×10-6（δH5.040×10-6、5.067×10-6、5.133×10-6、5.307×10-6、5.452×10-6）范圍內(nèi)出現(xiàn)信號說明SMP-4存在α-吡喃糖[29]。在δC60×10-6~84×10-6（δC76.412×10-6、δC81.229×10-6）范圍內(nèi)出現(xiàn)的信號峰說明SMP-4中存在吡喃糖構(gòu)型[30]。這與FT-IR分析的結(jié)果相一致。

圖4 SMP-4核磁共振氫譜圖Fig.4 NMR hydrogen diagram of SMP-4

圖5 SMP-4核磁共振碳譜圖Fig.5 NMR carbon diagram of SMP-4

綜上分析，SMP-4是以→3)-D-Araf-(1→和→6)-D-Galp-(1→為主要構(gòu)成的大分子多糖結(jié)構(gòu)。多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[12]。Yan等[3]從巴戟天中分離出能夠調(diào)節(jié)靶基因的表達從而改善骨質(zhì)疏松的多糖，其主要以(2→1)-β-D-Fruf為主鏈，以(1→)-α- D-Galp和(2→)-β-D-Frup為側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)。Zhang等[4]從巴戟天中分離抗骨質(zhì)疏松活性多糖MOP50-2，主要由α-D-Glcp-(1→、→1)-β-D-Fruf-(2→和β-D-Fruf-(2→殘基的構(gòu)成。在Yan等[3]和Zhang等[4]的研究中是采用巴戟天干燥處理后直接提取多糖，對比發(fā)現(xiàn)與本研究中分離出SMP-4有所不同，屬于不同的多糖。

2.3 SMP-4免疫活性研究

2.3.1 SMP-4對細胞增殖活性影響分析

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，在特異性免疫和非特異免疫中都發(fā)揮著重要的作用[31]。本實驗中的SMP-4對于RAW264.7細胞增殖活性實驗數(shù)據(jù)如圖6所示，與Control組相比，不同濃度SMP-4對巨噬細胞RAW264.7不存在顯著差異（P＞0.5），說明15.625~500.000 μg/mL SMP-4不影響巨噬細胞RAW264.7增殖活性。在15.625~500.000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，進行SMP-4對RAW264.7細胞免疫細胞因子分泌水平實驗，不受細胞增殖活性的影響。

圖6 RAW264.7細胞的增殖活性Fig.6 Proliferative activity of RAW264.7 macrophages

2.3.2 SMP-4對小鼠RAW264.7巨噬細胞TNF-α和IL-1β分泌水平影響分析

TNF-α和IL-1β是由巨噬細胞分泌與機體的特異性免疫相關(guān)的細胞因子，對于研究各種炎癥性和免疫性疾病具有重要意義[32]。細胞因子在機體內(nèi)的平衡具有重要意義，現(xiàn)有的研究已證實，雖然機體內(nèi)炎癥因子的升高有利于細胞修復，但是過高的炎癥因子水平又會導致炎癥損傷。因此炎癥相關(guān)因子要保持在正常分泌水平以發(fā)揮最適合作用。圖7為不同濃度SMP-4對RAW264.7巨噬細胞分泌免疫細胞因子的影響。與LPS組相比，Control組的RAW264.7巨噬細胞相關(guān)因子分泌水平顯著低于LPS組（P＜0.05或P＜0.01），說明RAW264.7巨噬細胞炎癥造模成功。

TNF-α是由巨噬細胞分泌的免疫細胞因子，在機體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[33]。SMP-4對RAW264.7巨噬細胞分泌細胞因子TNF-α的影響如圖7a所示。與Control組相比，在15.625~500.000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)SMP-4能顯著增加TNF-α的分泌，并隨著SMP-4濃度的增大TNF-α分泌水平也隨之增高，呈濃度依賴性。尤其是在250 μg/mL質(zhì)量濃度下，TNF-α達到了2 100 pg/mL，差異極顯著（P＜0.001）。但在15.625~500.000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)SMP-4促進TNF-α分泌水平均低于LPS組。這表明在15.625~500.000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能夠提高RAW264.7細胞的TNF-α分泌水平，同時又可以避免過高的分泌水平所導致的炎癥。在趙文俊等[26]從美藤果粕中分離出的植物多糖SISDF在質(zhì)量濃度為 62.5~1 000.0 μg/mL范圍內(nèi)能夠使得RAW264.7巨噬細胞分泌的TNF-α質(zhì)量濃度達到1 400~1 500 pg/mL，相比之下，62.5~500.0 μg/mL質(zhì)量濃度下SMP-4也能達到相近的效果且能避免過高分泌水平。

IL-1β是由活化的單核巨噬細胞分泌的免疫細胞因子，在介導T、B細胞活化、增殖和分化中起重要作用。SMP-4對RAW264.7巨噬細胞分泌細胞因子IL-1β的影響如圖7b所示。在15.625~500.000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)SMP-4促進IL-1β分泌水平均低于LPS組。與Control組相比，15.625~31.250 μg/mL質(zhì)量濃度下SMP-4能提高IL-1β的分泌水平（P＜0.05）。在31.25 μg/mL下IL-1β質(zhì)量濃度最高，達到了 14.5 pg/mL，未呈現(xiàn)濃度依賴性。這可能是不同濃度SMP-4對RAW264.7巨噬細胞的某一通路的刺激程度不一，導致細胞的IL-1β分泌水平有所不同。關(guān)于SMP-4刺激RAW264.7細胞中潛在的信號通路的研究有待進一步探討。對比Zhang等[34]從羅望子中提取的具有良好免疫活性的植物多糖TKP-2-1，不同濃度的TKP-2-1能夠使得RAW264.7巨噬細胞分泌的IL-1β質(zhì)量濃度達到10~15 pg/mL，而SMP-4質(zhì)量濃度為31.25 μg/mL時，能達到與之相近的分泌水平且不具有計量濃度依賴性。實驗結(jié)果表明SMP-4能夠平衡特異性免疫相關(guān)因子的分泌水平，能夠促進分泌水平升高的同時避免過高的分泌水平，說明SMP-4在免疫活性方面的開發(fā)具有較大的潛力。

圖7 不同濃度SMP-4對RAW264.7巨噬細胞分泌細胞因子的影響Fig.7 RAW264.7 macrophage secretion level of related factors

SMP-4具有良好的免疫活性可能與其多糖結(jié)構(gòu)中存在有一定的聯(lián)系。SMP-4是以→3)-D-Araf-(1→和→6)-D-Galp-(1→為主要構(gòu)成的大分子多糖結(jié)構(gòu)。多糖以(1→3)糖苷鍵為主鏈的連接方式與其免疫活性有關(guān)[35]。如Shen等[36]，從玫瑰茄中分離出的多糖主要的由(1→3)糖苷鍵相連的HSP-II，具有良好的免疫活性。在以半乳糖和阿拉伯糖為主要單糖組成的多糖已被證實具有較高的免疫活性[37]。

3 結(jié)論

本研究分析的鹽制巴戟天多糖SMP-4是以→3)-D-Araf-(1→和→6)-D-Galp-(1→為主要糖殘基，分子量在1.32×105Da的大分子多糖。在免疫活性評價實驗中，SMP-4不影響RAW264.7巨噬細胞的增殖，同時能夠提高RAW264.7巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β的水平且避免過高分泌水平導致炎癥。SMP-4可作為一種良好的功能性食品免疫調(diào)節(jié)劑，應用于保健食品產(chǎn)品開發(fā)中。本研究為鹽制巴戟天多糖在功能性食品方面的開發(fā)提供了理論支撐，這將對巴戟天作為保健食品原料的開發(fā)具有積極的意義。