基于低拷貝質(zhì)粒的高產(chǎn)紫色桿菌素谷氨酸棒桿菌的構(gòu)建和發(fā)酵

盧丹妮，洪沛雄，張國(guó)超，葉燕銳

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

紫色桿菌素（Violacein）是一種含有雙吲哚的紫色天然色素[1]，具有抗腫瘤、抗致病菌、抗病毒、抗氧化等活性[2,3]，在食品、印染、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)都有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值[4]。紫色桿菌素來(lái)源于紫色色桿菌（Chromobacterium violaceum）、藍(lán)黑紫色桿菌（Janthinobacterium lividum）等革蘭氏陰性細(xì)菌，其生物合成從L-色氨酸開(kāi)始，先后通過(guò)vioABCDE操縱子編碼的5個(gè)酶（VioA、VioB、VioE、VioD和VioC）催化合成。紫色色桿菌、藍(lán)黑紫色桿菌[5]等天然菌種為條件致病菌，使紫色桿菌素的發(fā)酵生產(chǎn)與在食品領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。Pemberton等[6]首次將紫色桿菌素操縱子克隆至大腸桿菌（Escherichia coli）中，但僅獲得淺紫色的菌落，未測(cè)定紫色桿菌素的產(chǎn)量。Rodrigues等[7]通過(guò)敲除trpR、tnaA、sdaA基因，過(guò)表達(dá)莽草酸途徑中aroFBL和tktA等多步遺傳操作，提高大腸桿菌內(nèi)的L-色氨酸含量，使脫氧紫色桿菌素的產(chǎn)量提高到了277 mg/L。蔣培霞等[8]選用來(lái)源Duganellasp.B2菌株的紫色桿菌素基因，并在大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）和弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）等革蘭氏陰性細(xì)菌中進(jìn)行紫色桿菌素的異源合成，結(jié)果顯示在弗氏檸檬酸桿菌工程菌的產(chǎn)量最高，經(jīng)優(yōu)化后可達(dá)到1.68 g/L，但該宿主是一種條件致病菌，不適合用于食品行業(yè)產(chǎn)品的工業(yè)發(fā)酵。谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）是氨基酸的主要生產(chǎn)菌，作為公認(rèn)的食品安全菌株（Generally Recognized as Safe，GRAS），在食品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用和研究。孫宏年等[9,10]將來(lái)源于藍(lán)黑紫色桿菌的紫色桿菌素操縱子重疊基因進(jìn)行解耦，并在每個(gè)開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）上游添加核糖體結(jié)合位點(diǎn)（Ribosome Binding Site，RBS），然后克隆到中高拷貝的pEC-XK99E質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032和ATCC 21850等菌株中，在LBHIS培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，ATCC 13032的紫色桿菌素產(chǎn)量達(dá)到約200 mg/L，而在發(fā)酵培養(yǎng)基中，ATCC 21850的紫色桿菌素產(chǎn)量約180 mg/L。本研究首先從谷氨酸棒狀桿菌天然大質(zhì)粒的復(fù)制與分配元件，構(gòu)建了新的大腸桿菌-谷氨酸棒狀桿菌低拷貝穿梭質(zhì)粒，并基于該低拷貝質(zhì)粒，初步以谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032為宿主合成紫色桿菌素，發(fā)現(xiàn)了基于低拷貝質(zhì)粒的紫色桿菌素比基于中高拷貝質(zhì)粒的紫色桿菌素產(chǎn)量更高。此外，考慮到谷氨酸棒狀桿菌基因組中存在許多可表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的插入序列（Insertion Sequence，IS）元件，會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)座作用破壞外源引入的DNA，不僅限制菌種的遺傳操作，在工業(yè)生產(chǎn)中還會(huì)導(dǎo)致菌株生產(chǎn)力下降和退化的情況[11,12]，本研究也比較了基于低拷貝質(zhì)粒的紫色桿菌素操縱子在IS序列刪除的谷氨酸棒狀桿菌株中的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)IS序列的刪除可提高紫色桿菌素的產(chǎn)量。本研究進(jìn)一步對(duì)其中產(chǎn)量最高的重組菌株進(jìn)行紫色桿菌素的發(fā)酵條件優(yōu)化。本研究的結(jié)果為低拷貝質(zhì)粒用于紫色桿菌素的高效合成提供了新的角度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SpeI、EcoRI、EcoRV、DpnI等DNA限制性?xún)?nèi)切酶，賽默飛科技有限公司；DNA marker和Primer STAR Max DNA聚合酶，日本TaKaRa公司；KOD FX聚合酶，東洋紡（上海）生物科技有限公司；硫酸卡那霉素、氯霉素、IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷），北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；DNA純化回收試劑盒，南京諾唯贊公司。

實(shí)驗(yàn)所用的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1和表2。

表1 本研究所用的菌株Table 1 Strains used in this study

表2 本研究所用的質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this study

1.2 培養(yǎng)基的配制

LBHIS培養(yǎng)基（1 L）[13]：由LB和BHIS分別配制，使用前等比例混合而成。

LB培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉5 g。

BHIS培養(yǎng)基（1 L）：腦心浸液肉湯粉末37 g，山梨醇91 g。

1.3 儀器與設(shè)備

聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購(gòu)自寧波新芝生物科技責(zé)任有限公司。

T100PCR擴(kuò)增儀和Gene Pulser Xcell電穿孔儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Tanon-5200 Multi凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司；微量紫外分光光度計(jì)NP80購(gòu)自德國(guó)Implen公司；TECAN infinite M200 Pro多功能光柵酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)TECAN公司；JY92-Ⅱ超

1.4 方法

1.4.1 谷氨酸棒狀桿菌低拷貝質(zhì)粒復(fù)制子的獲取

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的低拷貝質(zhì)粒所需的復(fù)制子序列來(lái)源于谷氨酸棒狀桿菌的pTET3[14]，包括repA、parA和parB基因，以及兩個(gè)22 bp-box序列，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并克隆至pOK12載體中，命名為pOK12CG1。參考文獻(xiàn)[13]的方法將pOK12CG1質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至ATCC13032，得到ATCC13032/pOK12CG1菌株。電轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：將0.5 μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至ATCC13032后，取適量轉(zhuǎn)化液涂布在對(duì)應(yīng)抗性的BHIS平板上，30 ℃孵育2 d，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按公式（1）計(jì)算菌落個(gè)數(shù)并得出轉(zhuǎn)化效率。

式中：

a——電轉(zhuǎn)化效率；

b——菌落總數(shù)；

c——DNA總量；

n——稀釋倍數(shù)。

1.4.2 質(zhì)粒相容性分析

將pXMJ19、pEC-XK99E質(zhì)粒同時(shí)電轉(zhuǎn)至ATCC 13032/pCGBACT1谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)，涂布至含有卡那霉素（Kanamycin，Km）和氯霉素（Chloramphenicol，Cm）的BHIS（Km質(zhì)量濃度 25 μg/mL，Cm質(zhì)量濃度17 μg/mL）平板培養(yǎng)，通過(guò)菌落PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證。

1.4.3 質(zhì)粒穩(wěn)定性分析

傳代實(shí)驗(yàn)步驟[15]：取ATCC 13032/pOK12CG1、ATCC 13032/pXMJ19、ATCC 13032/pEC-XK99菌株進(jìn)行平板劃線活化，然后分別挑取3種單菌落至含對(duì)應(yīng)抗生素（Km質(zhì)量濃度25 μg/mL或Cm質(zhì)量濃度 17 μg/mL）的BHIS培養(yǎng)基中于30 ℃過(guò)夜生長(zhǎng)；將其接種至10 mL無(wú)抗生素的液體BHIS培養(yǎng)基（保證初始OD600≈0.05）；將細(xì)胞在30 ℃，250 r/min培養(yǎng)24 h，每隔24 h將細(xì)胞重復(fù)轉(zhuǎn)移到新鮮的無(wú)抗培養(yǎng)基中，同時(shí)，在稀釋106倍后均勻涂布在添加或不添加抗生素的BHIS平板上，30 ℃培養(yǎng)2~3 d，每組設(shè)3個(gè)平行；通過(guò)公式（2）計(jì)算兩種平板的菌落數(shù)來(lái)計(jì)算丟失率。

式中：

d——質(zhì)粒丟失率，%；

e——無(wú)抗性平板上的菌落總數(shù)；

f——抗性平板上的菌落總數(shù)。

1.4.4 質(zhì)?？截悢?shù)測(cè)定

按參考文獻(xiàn)[16]的方法，采用定量PCR測(cè)定質(zhì)粒的拷貝數(shù)。計(jì)算拷貝數(shù)的公式如下：

式中：

g——質(zhì)粒與基因組的相對(duì)拷貝數(shù)；

h——基因組大小，bp；

i——質(zhì)粒DNA的量，pg；

j——質(zhì)粒DNA的大小，bp；

k——基因組DNA的量，pg。

近年來(lái)，中央及各地政府機(jī)構(gòu)加大財(cái)政投入，加強(qiáng)資源整合，在農(nóng)村地區(qū)開(kāi)展衛(wèi)生治理、村莊環(huán)境建設(shè)、道路修建等一系列基礎(chǔ)建設(shè)工作，使得鄉(xiāng)村呈現(xiàn)出天藍(lán)、水綠、村民安居樂(lè)業(yè)的美好景象。

1.4.5 紫色桿菌素重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

采用Takara的Primer STAR Max DNA聚合酶，以pOK12CG1質(zhì)粒和pECvio質(zhì)粒為模板，分別擴(kuò)增線性pOK12CG1載體片段、ID1以及ID2片段，DpnI消化過(guò)夜后，進(jìn)行DNA凝膠回收，通過(guò)Gibson assembly進(jìn)行組裝并電轉(zhuǎn)E.coliDH5α；提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，使用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRV進(jìn)行單酶雙酶切驗(yàn)證正確后進(jìn)行測(cè)序。

1.4.6 紫色桿菌素重組菌的構(gòu)建

先將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pCGvio電轉(zhuǎn)化至C.glutamicumATCC 13032和7株敲除不同IS序列的ATCC 13032菌株（見(jiàn)表1）中，涂布在無(wú)抗生素或者含有卡那霉素抗性BHIS平板上，同時(shí)將C.glutamicumATCC13032/pECvio菌株劃線活化，9組平板均置于30 ℃培養(yǎng)24 h；從BHIS平板中挑選出線紫色單克隆于對(duì)應(yīng)抗性的BHIS液體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)并保存。

1.4.7 紫色桿菌素重組菌的發(fā)酵

在超凈工作臺(tái)中，將1.4.6中得到的8個(gè)重組菌株的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子以及對(duì)照組C.glutamicumATCC13032、C.glutamicumATCC13032/pECvio菌株單菌落接種至裝有5 mL含相應(yīng)抗生素的液體BHIS培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，再以1%（m/V）接種量轉(zhuǎn)接至含50 mL LBHIS培養(yǎng)基的100 mL三角搖瓶中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h后加入1 mmol/L IPTG試劑，以20 ℃、220 r/min條件培養(yǎng)72 h，獲得發(fā)酵液。

1.4.8 紫色桿菌素的檢測(cè)

圖1 紫色桿菌素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard Curve of violacein

（2）發(fā)酵體系中紫色桿菌素的測(cè)定：按文獻(xiàn)方 法[9,16]獲取紫色桿菌素的粗提乙醇溶液，使用微量紫外線分光光度計(jì)測(cè)定OD570值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線算出紫色桿菌素的濃度值，求出紫色桿菌素的產(chǎn)量。

1.4.9 正交法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件

本研究采用LBHIS豐富培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，以誘導(dǎo)劑添加時(shí)間、誘導(dǎo)劑（IPTG）濃度及培養(yǎng)基（LB:BHIS）比例為考察因素，按照正交設(shè)計(jì)表L9（34）設(shè)計(jì)3個(gè)因素3個(gè)水平的正交試驗(yàn)，比較不同發(fā)酵條件組合對(duì)紫色桿菌素產(chǎn)量的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平見(jiàn)表3。

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化因素表Table 3 Optimization factors of fermentation conditions

1.4.10 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 19.0在線軟件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)的單因素和多因素方差分析[17]，采用Graphpad prism 8.0軟件進(jìn)行圖表的繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 低拷貝載體pOK12CG1的構(gòu)建

典型的低拷貝質(zhì)粒含有編碼分配相關(guān)蛋白的parA和parB基因、類(lèi)著絲粒元件parS和編碼復(fù)制蛋白的repA基因[18,19]。谷氨酸棒狀桿菌的天然大質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒（一般5~10拷貝/基因組）[15]，因此可以將其復(fù)制和分配的關(guān)鍵元件用于構(gòu)建低拷貝的大腸桿菌-谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體。由于谷氨酸棒狀桿菌大多數(shù)天然大質(zhì)粒的基因缺乏注釋?zhuān)x擇注釋相對(duì)清楚的pTET3（27.8 kb）[14]作為出發(fā)質(zhì)粒。pTET3來(lái)源于谷氨酸棒狀桿菌LP-6，屬于pCG1家族，其中編碼分配相關(guān)蛋白的parA和parB基因、編碼復(fù)制蛋白的repA基因、以及pCG1家族特有的與低拷貝質(zhì)粒的復(fù)制和維持有關(guān)的22 bp-box等[20]關(guān)鍵基因/元件有明確的注釋?zhuān)曳植急容^集中（圖2），但其類(lèi)著絲粒元件parS的序列未知。本研究選擇從repA上游300 bp到parA下游300 bp的3.7 kb序列，進(jìn)行基因合成，并克隆至pOK12中，構(gòu)建得到pOK12CG1（圖3）。為了測(cè)試pOK12CG1是否可在大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中穿梭，將其電轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032中，并以pOK12和兩個(gè)常見(jiàn)的大腸桿菌-谷氨酸棒狀桿菌穿梭質(zhì)粒pXMJ19和pEC-XK99E作為對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pOK12CG1的轉(zhuǎn)化效率約為104CFU/μg，與pXMJ19和pEC-XK99E的轉(zhuǎn)化效率接近，而pOK12無(wú)法轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌（圖4），說(shuō)明3.7 kb序列與pOK12組成的pOK12CG1為大腸桿菌-谷氨酸棒狀桿菌穿梭質(zhì)粒。谷氨酸棒狀桿菌pCG1家族質(zhì)粒的 22 bp-box序列對(duì)于質(zhì)粒的復(fù)制和維持有重要的作 用[20,21]，而3.7 kb中含有2個(gè)22 bp-box，為證明其作用，決定從pOK12CG1載體中刪除了含有該2個(gè) 22 bp-box區(qū)域的104 bp序列，得到pOK12CG2。電轉(zhuǎn)化的結(jié)果表明，pOK12CG2比pOK12CG1載體低90倍（圖4），說(shuō)明了這兩個(gè)22 bp-box序列對(duì)pOK12CG1在谷氨酸棒狀桿菌中的自主復(fù)制具有重要的作用。

圖2 pTET3復(fù)制和分配序列示意圖Fig.2 Schematic diagram of the replication and distribution sequence of pTET3

圖3 pOK12CG1質(zhì)粒圖譜Fig.3 Schematic diagram of pCG12CG1 plasmid

圖4 pOK12CG1質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化效率Fig.4 Electroporation efficiency of pOK12CG1 plasmid

2.2 pOK12CG1質(zhì)粒復(fù)制穩(wěn)定性、拷貝數(shù)與相容性分析

為評(píng)估連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中質(zhì)粒在谷氨酸棒狀桿菌宿主中的穩(wěn)定性，我們將ATCC 13032/pOK12CG1菌株接種于無(wú)抗生素的BHIS液體培養(yǎng)基中并連續(xù)傳代12 d，結(jié)果顯示，在連續(xù)傳代12 d后，pOK12CG1的平均丟失率約為56%，與谷氨酸棒狀桿菌常用的pXMJ19（~74%）和pEC-XK99E（~56%）相近（圖5），表明pOK12CG1在無(wú)抗性的培養(yǎng)基中完全仍然可以相對(duì)穩(wěn)定地復(fù)制。

圖5 pOK12CG1載體復(fù)制能力驗(yàn)證Fig.5 Verification of replication ability of pOK12CG1 vector

表4 pOK12CG1載體的質(zhì)粒拷貝數(shù)Table 4 Plasmid copy number of pOK12CG1 vector

采用qPCR法測(cè)定了pOK12CG1、pXMJ19與pEC-XK99E質(zhì)粒的拷貝數(shù)，結(jié)果表明，中等拷貝的pXMJ19和高拷貝的pEC-XK99E的拷貝數(shù)分別為約40~90拷貝/基因組和約290~430拷貝/基因組，與文獻(xiàn)報(bào)道接近[22,23]，而pOK12CG1的拷貝數(shù)為3~9拷貝/基因組，與文獻(xiàn)報(bào)道的pTET3質(zhì)粒的拷貝數(shù)（5~10拷貝/基因組）[14]相當(dāng)，屬于低拷貝質(zhì)粒[13,24]。為研究谷氨酸棒狀桿菌低拷貝載體pOK12CG1的相容性，選擇分別基于pBL1/colE和rep/colE復(fù)制子的pXMJ19和pEC-XK99E穿梭載體作為相容性測(cè)試的質(zhì)粒，把pXMJ19（pBL1/colE復(fù)制子）、pEC-XK99E（rep/colE復(fù)制子）、pOK12CG1（pTET3/p15A復(fù)制子）依次電轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032中，并對(duì)含有3種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行連續(xù)7 d的傳代培養(yǎng)，菌落PCR的結(jié)果表明，說(shuō)明pOK12CG1載體能與含pBL1/colE復(fù)制子和含rep/colE復(fù)制子系列質(zhì)粒相容（圖6）。

圖6 ATCC 13032菌株的轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗(yàn)證Fig.6 PCR verification of transformant colonies of ATCC 13032

2.3 紫色桿菌素低拷貝質(zhì)粒與重組菌株的構(gòu)建

通過(guò)將文獻(xiàn)報(bào)道的紫色桿菌素操縱子[10]克隆至低拷貝pOK12CG1中獲得pCGvio質(zhì)粒。其中紫色桿菌素操縱子由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Ptrc控制，紫色桿菌操縱子中的每個(gè)基因上游加入了RBS序列[10]。構(gòu)建的結(jié)果如圖7a所示，構(gòu)建pCGvio質(zhì)粒所需的線性載體pOK12CG1為5 869 bp，ID1片段4 235 bp，ID2片段為4 690 bp（圖7a）。將3個(gè)片段進(jìn)行Gibson assembly并電轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，在37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，LB抗性平板長(zhǎng)出紫色菌落，將平板放置20 ℃以下過(guò)夜后紫色變深（圖7c），說(shuō)明質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌并生成紫色桿菌素。酶切（圖7b）、菌落PCR（圖7d）和測(cè)序的結(jié)果證明pCGvio質(zhì)粒構(gòu)建成功，質(zhì)粒圖譜如圖8所示。

圖7 pCGvio質(zhì)粒構(gòu)建Fig.7 Construction of pCGvio plasmid

圖8 pCGvio質(zhì)粒圖譜Fig.8 Schematic diagram of pCGvio plasmid

將低拷貝的pCGvio質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至8株谷氨酸棒狀桿菌菌株（ATCC 13032、ISDM023、ISDM024、ISDM02、ISDM026、ISDM027、ISDM028和ISDM029）中（菌株信息見(jiàn)表1），得到基于低拷貝質(zhì)粒的紫色桿菌素重組菌株ATCC 13032/pCGvio、ISDM023/pCGvio、ISDM024/pCGvio、ISDM025/pCGvio、ISDM026/pCGvio、ISDM027/pCGvio、ISDM028/pCGvio和ISDM029/pCGvio，同時(shí)將高拷貝的pECvio質(zhì)粒（與孫宏年等[9,10]報(bào)道的pEC-C-vio1質(zhì)粒相同）轉(zhuǎn)化ATCC 13032，得到基于高拷貝質(zhì)粒的紫色桿菌素重組菌株ATCC 13032/pECvio。我們將紫色桿菌素重組菌株在搖瓶中，30 ℃培養(yǎng)12 h后添加1 mmol/L IPTG，20 ℃培養(yǎng)72 h后提取紫色桿菌素，使用圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線估算各重組菌株的紫色桿菌素產(chǎn)量（圖9）?？瞻讓?duì)照菌株C.glutamicumATCC 13032在發(fā)酵過(guò)程中未檢測(cè)到紫色桿菌素；紫色桿菌素重組菌株在發(fā)酵過(guò)程中可觀察到發(fā)酵液顏色變?yōu)樽仙?，其中基于高拷貝質(zhì)粒的重組菌株ATCC 13032/pECvio紫色桿菌素產(chǎn)量約為376 mg/L，比張宏年等[10]使用相同菌株和質(zhì)粒的紫色桿菌素產(chǎn)量（約200 mg/L）高88%，這一差異可能是由于我們的發(fā)酵時(shí)間（90 h）比張宏年等[10]更長(zhǎng)（70 h）所致。有趣的是，基于低拷貝質(zhì)粒的重組菌株ATCC 13032/pCGvio紫色桿菌素產(chǎn)量 （500 mg/L）比高拷貝質(zhì)粒的重組菌株ATCC 13032/pECvio（376 mg/L）高33%。而在IS刪除的大部分重組菌株紫色桿菌素產(chǎn)量＞500 mg/L，其中ISDM023/pCGvio菌株產(chǎn)量達(dá)到了610 mg/L，比ATCC 13032/pCGvio高22%。

圖9 不同宿主中紫色桿菌素的產(chǎn)量Fig.9 The yield of violacein in different hosts

上述結(jié)果表明，基于低拷貝質(zhì)粒的谷氨酸棒狀桿菌重組菌株紫色桿菌素產(chǎn)量高于高拷貝質(zhì)粒，類(lèi)似的現(xiàn)象在其它物種與其它產(chǎn)物也有報(bào)道，在E.coli中使用低拷貝質(zhì)粒合成番茄紅素的產(chǎn)量是高拷貝質(zhì)粒的2~3倍[25]，說(shuō)明了在某些代謝工程中，低拷貝質(zhì)?？赡軠p輕了代謝符合，更利于提高細(xì)胞的生產(chǎn)能力。需提出的是谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032不是色氨酸高產(chǎn)菌株，僅在豐富培養(yǎng)基（如LBHIS）中可以高效合成紫色桿菌素，而在發(fā)酵培養(yǎng)基中的產(chǎn)量很 低[9,10]，可改用色氨酸高產(chǎn)菌株（如CICC 20192、ATCC 21850等）作為宿主，構(gòu)建高產(chǎn)紫色桿菌素的重組菌株。

2.4 紫色桿菌素的發(fā)酵條件優(yōu)化

誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)劑添加時(shí)間和培養(yǎng)溫度對(duì)紫色桿菌素的在谷氨酸棒桿菌ATCC 21850中的產(chǎn)量有直接影響[9,10]，本實(shí)驗(yàn)使用的宿主為ATCC 13032，需用豐富培養(yǎng)基LBHIS進(jìn)行發(fā)酵，因此選取三個(gè)主要因素：誘導(dǎo)劑添加時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度及培養(yǎng)基比例（VLB:VBHIS），通過(guò)設(shè)計(jì)3個(gè)因素3個(gè)水平的正交試驗(yàn)來(lái)篩選合適的發(fā)酵條件[26]，結(jié)果如表5、圖10所示。

圖10 正交試驗(yàn)中紫色桿菌素產(chǎn)量Fig.10 The yield of violacein in orthogonal test

表5 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Experimental results of orthogonal design

通過(guò)表5直觀地分析得知，攜帶pCGvio質(zhì)粒的ISDM023菌株經(jīng)采用不同發(fā)酵條件進(jìn)行紫色桿菌素的表達(dá)，其含量最高可達(dá)到1 007.47 mg/L；此外，由各因素的極差值大小可判斷對(duì)紫色桿菌素表達(dá)量的影響大小分別為：培養(yǎng)基比例（VLB:VBHIS）＞誘導(dǎo)劑添加時(shí)間＞IPTG濃度。

從表6的多因素方差分析結(jié)果可知IPTG濃度、誘導(dǎo)劑添加時(shí)間、培養(yǎng)基比例（VLB:VBHIS）這3個(gè)因素對(duì)于Viol產(chǎn)量的差異關(guān)系：IPTG濃度、誘導(dǎo)劑添加時(shí)間并不會(huì)對(duì)產(chǎn)量產(chǎn)生差異關(guān)系，只有培養(yǎng)基比例（VLB:VBHIS）會(huì)對(duì)產(chǎn)量產(chǎn)生顯著性差異關(guān)系（P＜0.05），進(jìn)一步使用單因素方差研究該因素發(fā)現(xiàn)（表7）培養(yǎng)基比例（VLB:VBHIS）中的兩兩水平間也存在顯著性差異，說(shuō)明LB與BHIS培養(yǎng)基的比例確實(shí)對(duì)紫色桿菌素的產(chǎn)量有較大影響。在最優(yōu)發(fā)酵條件下，重組菌株ISDM023/pCGvio的紫色桿菌素產(chǎn)量為1 007.47 mg/L。本研究主要采用搖瓶發(fā)酵的方法，對(duì)于補(bǔ)糖、溶氧、pH值等因素均無(wú)法有效控制，未充分挖掘重組菌株發(fā)酵合成紫色桿菌素的潛力，后續(xù)和進(jìn)一步通過(guò)微型或小型發(fā)酵罐，對(duì)上述因素開(kāi)展更為全面的發(fā)酵優(yōu)化。

表6 正交試驗(yàn)的多因素方差分析結(jié)果Table 6 Results of multivariate analysis of variance of orthogonal test

表7 培養(yǎng)基比例（VLB:VBHIS）因素的方差分析結(jié)果Table 7 Results of ANOVA for the scale factor of medium (VLB:VBHIS)

3 結(jié)論

在本研究中，我們構(gòu)建的低拷貝質(zhì)粒pOK12CG1能與常用的pXMJ19和pEC-XK99E具有相容性，為谷氨酸棒狀桿菌的代謝工程改造提供更多選擇。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：基于低拷貝質(zhì)粒pOK12CG1的谷氨酸棒狀桿菌重組菌株紫色桿菌素產(chǎn)量顯著高于基于高拷貝質(zhì)粒pEC-XK99E的重組菌株；以IS元件刪除菌株為宿主，可以提高紫色桿菌素的產(chǎn)量，為谷氨酸棒狀桿菌菌種的進(jìn)一步改良提供了參考。此外，本文通過(guò)以刪除3個(gè)IS基因的谷氨酸棒狀桿菌ISDM023菌株為宿主，低拷貝載體pCGvio為基因表達(dá)工具，構(gòu)建了一株高效合成紫色桿菌素的重組菌株ISDM023/pCGvio。使用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)該菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定最佳誘導(dǎo)劑濃度是0.75 mmol/L，最佳誘導(dǎo)劑添加時(shí)間是30 ℃培養(yǎng)18 h后，最佳LBHIS培養(yǎng)基比例為L(zhǎng)B和BHIS體積比1:2。綜上，本研究基于低拷貝質(zhì)粒，構(gòu)建了紫色桿菌素的谷氨酸棒狀桿菌重組菌株ISDM023/pCGvio，其紫色桿菌素產(chǎn)量高于基于高拷貝質(zhì)粒的重組菌株，經(jīng)過(guò)搖瓶發(fā)酵優(yōu)化，產(chǎn)量可達(dá)到1 007 mg/mL，為谷氨酸棒狀桿菌高效合成紫色桿菌素奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為其它產(chǎn)物的高效合成提供參考。