富硒核桃粕蛋白降血壓肽的酶解制備及硒含量分析

盧藹純，蘇嘉毅，楊迅，冉佳鑫，郭俊斌，唐德劍，祁蒙，夏曾潤(rùn)，梁興唐，尹艷鎮(zhèn)，曹庸，苗建銀*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

（2.安康市富硒產(chǎn)品研發(fā)中心，陜西安康 725000）

（3.北部灣大學(xué)石油與化工學(xué)院，欽州市生物廢棄物資源富硒功能化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州 535011）

核桃（Juglans regiaL.），也被稱為山核桃或羌桃，屬于山核桃科。中國(guó)是現(xiàn)在世界上產(chǎn)量較大的天然核桃生產(chǎn)基地國(guó)之一和核心消費(fèi)市場(chǎng)國(guó)，近年來(lái)核桃產(chǎn)業(yè)更是發(fā)展迅猛，種植規(guī)模和產(chǎn)品產(chǎn)量增長(zhǎng)速度逐年上升[1]，2019年中國(guó)核桃產(chǎn)量達(dá)252.2萬(wàn)t[2]。但現(xiàn)在我國(guó)核桃資源開發(fā)利用仍以初級(jí)農(nóng)業(yè)產(chǎn)品和榨油為主，作為核桃油加工的副產(chǎn)品，核桃粕的高附加值利用明顯落后于核桃產(chǎn)業(yè)，這大大限制了核桃產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和產(chǎn)品的附加值[3]。

硒（Selenium）是動(dòng)物的一種必需營(yíng)養(yǎng)素，也是植物的一種有益營(yíng)養(yǎng)素。在各種生物機(jī)體代謝中發(fā)揮多種重要生理作用，如參與人類機(jī)體硒酶合成和硒蛋白的合成，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPX）可以以硒半胱氨酸作為活性中心對(duì)各種代謝途徑形成的過(guò)氧化物進(jìn)行保護(hù)[4]。同時(shí)，硒還參與保護(hù)DNA免受損傷和預(yù)防細(xì)胞衰老，影響生殖系統(tǒng)（尤其是男性）、激素（主要是甲狀腺）和免疫功能的正常功能[4]。因此，飲食中缺乏硒會(huì)導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，包括甲狀腺功能減退、感染易感性、腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或心力衰竭[4]。流行病學(xué)研究結(jié)果表明，在世界范圍內(nèi)，硒缺乏影響多達(dá)10億人[5]。因此，如何通過(guò)食物資源補(bǔ)充天然硒元素成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，例如富硒牡蠣肽[6]、富硒桑葚果片[7]以及富硒大米酒[8]等的研究。硒對(duì)于預(yù)防高血壓和冠心病的調(diào)控機(jī)制有直接清除氧自由基、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、改變血流動(dòng)力學(xué)、調(diào)控Ca2+等[9]。研究表明，機(jī)體內(nèi)血栓素B2（Thromboxane B2，TXB2）和6-酮-PGF1α（6-Keto Prostaglandin F1α，6-酮-PGF1α）產(chǎn)生和分解之間的平衡可以控制血管收縮、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，而硒在這一過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，從而控制血管收縮、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[9]。程天德等[10]研究發(fā)現(xiàn)富硒大豆低聚肽具有降低SHR血壓的作用，認(rèn)為這種作用是硒和大豆低聚肽共同作用的結(jié)果。

高血壓是最常見多發(fā)的一種慢性疾病，也是中國(guó)所面臨的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。2012~2015年中國(guó)高血壓調(diào)查（Chinese Hypertension Survey，CHS）發(fā)現(xiàn)，全國(guó)有血壓正常高值人數(shù)約4.35億，中國(guó)年均有250萬(wàn)人死于與高血壓相關(guān)的心血管病[11]。血管緊張素-Ⅰ可以通過(guò)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin- Converting Enzyme，ACE）轉(zhuǎn)變成以致末端血管產(chǎn)生收縮變化的血管緊張素Ⅱ，同時(shí)它還會(huì)導(dǎo)致具有擴(kuò)張血管作用的緩激肽失活，從而導(dǎo)致血壓升高。因此，為了可以積極預(yù)防診斷和治療高血壓病人及其心血管疾病，高效安全地降低血壓，可以采取抑制ACE酶活性以提高緩激肽的濃度并降低血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生。目前，在臨床方面化學(xué)合成的ACE酶抑制類藥物已具有非常高效的降壓效果，但口服該類藥物后也存在副作用的風(fēng)險(xiǎn)，例如味覺紊亂、咽喉癥狀和皮膚問(wèn)題等[12]。因此，尋找天然無(wú)負(fù)作用且經(jīng)濟(jì)可行的替代物成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，例如馬面魚皮ACE抑制肽[13]、雙孢菇ACE抑制肽[14]以及馬氏珍珠貝肉蛋白ACE抑制肽[15]的研究。

本研究以富硒核桃粕為原料制備降血壓肽，對(duì)富硒核桃粕蛋白降血壓肽的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，以及富硒核桃粕蛋白降血壓肽對(duì)ACE抑制的積極作用，結(jié)合硒元素與核桃蛋白降血壓肽的優(yōu)點(diǎn)，為富硒核桃降血壓肽的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)，還為開發(fā)膳食硒補(bǔ)充劑提供了理論基礎(chǔ)，以期促進(jìn)富硒核桃粕的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

1.1.1 原料

富硒核桃：購(gòu)自湖北恩施。

1.1.2 試劑

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、呋喃丙烯酰三肽（N-[3-(2-furyl)acryloyl]-L-phenyalanyl-glycyl-glycine，F(xiàn)APGG）、羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）美國(guó)Sigma公司；胃蛋白酶（300萬(wàn)U/g）、胰蛋白酶（25萬(wàn)U/g）、木瓜蛋白酶（20萬(wàn)U/g）、中性蛋白酶（10萬(wàn)U/g），廣西南寧龐博生物工程有限公司；氫氧化鈉溶液，上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸，河南標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心；乙醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

2300多功能酶標(biāo)儀，PerkinElmer公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；L530，臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；FD-1型冷凍干燥機(jī)，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DH5000BII電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器有限公司；PHS-3D pH計(jì)，上海三信儀表廠；電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；超聲波清洗儀，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 富硒核桃粕制備

將富硒核桃脫殼、去衣和粉碎，以本實(shí)驗(yàn)室自有專利保護(hù)設(shè)備低溫連續(xù)相變萃取技術(shù)提取核桃油后剩余部分即為脫脂富硒核桃粕。

1.3.2 最優(yōu)酶篩選

選用中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶在各自酶最適的pH值及最佳溫度條件下（見表1）對(duì)富硒核桃粕蛋白水解液進(jìn)行單酶酶解3 h。以ACE抑制率為指標(biāo)，篩選出抑制效果最好的蛋白酶。

表1 蛋白酶最適水解條件Table 1 Optimal hydrolysis conditions for proteases

1.3.3 單因素試驗(yàn)

確定胰蛋白酶為最優(yōu)酶后，對(duì)影響蛋白酶水解的pH值（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）、溫度（30、35、40、45、50 ℃）、酶解時(shí)間（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h）、底物濃度（1%、3%、5%、7%、9%，m/V）和加酶量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，V/V）五個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以酶解液ACE抑制率作為最佳水解條件的指標(biāo)。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化

基于單因素實(shí)驗(yàn)，選取主要影響因素，以ACE抑制率為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面軟件Box Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。對(duì)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立數(shù)學(xué)回歸模型并分析，進(jìn)行三次平行的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果，最終確定富硒核桃中降血壓肽的最佳提取工藝。響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels table of response surface experiment

1.3.5 ACE抑制率的測(cè)定

參照陳冰冰等[16]的方法，借助酶標(biāo)儀采用FAPGG法直接檢測(cè)富硒核桃肽的ACE抑制率。配制0.08 mol/L的HEPES-NaOH緩沖液（pH值8.3，含0.3 mol/L NaCl），用適當(dāng)?shù)木彌_液制備0.1 mol/L的FAPGG溶液和 0.1 U/mL的ACE溶液。在酶標(biāo)板樣品孔中依次加入40 μL HEPES緩沖液（80 mmol/L），50 μL的FAPGG溶液（1.0 mmol/L），10 μL 0.1 U/mL的ACE溶液，在空白孔依次加入40 μL HEPES緩沖液（80 mmol/L），50 μL的FAPGG溶液（1.0 mmol/L），10 μL 0.1 U/mL的ACE溶液。加入ACE后，立即將其置于酶標(biāo)儀中，并在340 nm處測(cè)量空白孔和樣品孔的吸光度a1、b1，然后立即轉(zhuǎn)入37 ℃條件下的培養(yǎng)箱中進(jìn)行保溫，30 min后取出，再次在340 nm處再次測(cè)定其反應(yīng)后的吸光度a2、b2。ACE抑制率（Y）按照下式計(jì)算：

式中：

Y——ACE抑制率；

a1——空白孔的吸光度；

b1——樣品孔的吸光度；

a2——培養(yǎng)箱中保溫30 min后空白孔的吸光度；

b2——培養(yǎng)箱中保溫30 min后樣品孔的吸光度。

1.3.6 超濾分離

將酶解液置于3 ku超濾管中，于常溫下4 000 r/min超濾30 min。利用超濾膜的不對(duì)稱微孔結(jié)構(gòu)對(duì)酶解液組分進(jìn)行分離，分別收集上層超濾液和下層超濾液，得到＞3 ku的組分和＜3 ku的組分，將超濾組分冷凍干燥制得凍干粉，便于后續(xù)ACE抑制率的測(cè)定。

1.3.7 氨基酸組成分析

在最優(yōu)酶解條件下對(duì)富硒核桃ACE抑制肽進(jìn)行冷凍干燥，以獲得的凍干粉即為測(cè)定樣品。使用氨基酸分析儀（SYKAM-S433D），參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測(cè)定》中酸水解的方法處理，在570 nm+440 nm的波長(zhǎng)下，以外標(biāo)法檢測(cè)樣品液中16種氨基酸的濃度[17]。

1.3.8 硒含量分析

采用氫化物原子熒光光譜法測(cè)定市售核桃、富硒核桃及其蛋白酶解物、分子量＞3 ku的肽和＜3 ku肽的硒含量。在適量樣品中加入9 mL濃硝酸和1 mL高氯酸混合物在150 ℃下消化2.5 h。樣品經(jīng)消化后，在6 mol/L鹽酸介質(zhì)中，將試樣中的Se6+還原成Se4+。冷卻后移至25 mL容量瓶定容。將10.0 mL試樣消化液移入15 mL離心管中，加入6 mol/L濃鹽酸2.0 mL，鐵氰化鉀溶液10%（m/m）1.0 mL，混合后放置2 h進(jìn)行測(cè)量。用原子熒光光譜法測(cè)定硒的含量，每個(gè)處理組取3次數(shù)據(jù)平均值，同時(shí)做空白對(duì)照。

儀器條件為：負(fù)高壓280 V，硒燈電流80 mA，原子化器高度8 mm，載氣流量為300 mL/min；屏蔽氣流量為800 mL/min，讀數(shù)時(shí)間12 s，延遲時(shí)間3 s。

1.3.9 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)計(jì)算表示，各部分實(shí)驗(yàn)均至少需要進(jìn)行最少3次的平行試驗(yàn)，采用Excel 2019和Design-Expert V8.0.6.1等統(tǒng)計(jì)及分析報(bào)表軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 最優(yōu)酶篩選結(jié)果

在5%底物濃度和0.3%酶添加量的條件下，分別在4種蛋白酶酶解反應(yīng)最適pH值和最適酶解溫度條件下酶解反應(yīng)3 h，用酶標(biāo)儀測(cè)出ACE抑制率如圖1。

圖1 蛋白酶種類對(duì)酶解物ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of protease species on ACE inhibition of enzymatic digests

由圖1可知，在不同酶對(duì)應(yīng)最適酶解條件下，胰蛋白酶的酶解產(chǎn)物在酶標(biāo)儀測(cè)定下表現(xiàn)出了最高的ACE抑制率，高達(dá)68.00%，與胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的ACE抑制率相比差異顯著，其次是中性蛋白酶，ACE抑制率為58.67%，而木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物在酶標(biāo)儀的測(cè)定下表現(xiàn)出了最低的ACE抑制率，僅能表現(xiàn)為22.67%。由于不同種類的蛋白酶作用于富硒核桃蛋白的不同部位，酶解得到的富硒多肽片段也有所不同，表現(xiàn)出的ACE抑制率也存在差異。在大米ACE抑制肽[18]和龍須菜ACE抑制肽[19]的研究中也表明經(jīng)胰蛋白酶酶解得到ACE抑制肽活性最高。因此，選擇胰蛋白酶作為酶解富硒核桃的最優(yōu)酶進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 溫度對(duì)ACE抑制率的影響

酶解溫度對(duì)ACE抑制率的影響結(jié)果見圖2，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到35 ℃時(shí)，ACE抑制率為75.00%，達(dá)到最大值；當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到40 ℃左右時(shí)，ACE抑制率為74.70%，略低于反應(yīng)溫度35 ℃時(shí)的，然而ACE抑制率隨著反應(yīng)溫度的升高逐漸下降。因此，選擇35 ℃為最佳反應(yīng)溫度。

圖2 酶解溫度對(duì)ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of enzymatic digestion temperature on ACE inhibition rate

圖3 pH值對(duì)ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of pH value on ACE inhibition rate

2.2.2 pH值對(duì)ACE抑制率的影響 不適的pH值很可能會(huì)直接導(dǎo)致酶的正?？臻g結(jié)構(gòu)遭到不同程度上的破壞，致使了酶活性降低[20]，最終導(dǎo)致ACE抑制率降低。因此，選擇溶液pH值7.5為最佳的反應(yīng)條件。

2.2.3 時(shí)間對(duì)ACE抑制率的影響

酶解時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)ACE抑制率的影響見圖4。隨著酶解時(shí)間的增加，ACE抑制率先增高后降低，在酶解時(shí)間為3 h，ACE抑制率高達(dá)74.39%。酶解時(shí)間在3 h以內(nèi)時(shí)，隨著酶解時(shí)間的逐步延長(zhǎng)，ACE抑制率不斷攀升，這是因?yàn)槊附膺^(guò)程還沒有結(jié)束，酶解物含量越來(lái)越多，ACE抑制率也隨之增加；而在酶解3 h以后，ACE抑制率逐漸降低，可能是因?yàn)槟承?duì)ACE有抑制作用的短肽被繼續(xù)酶解成活性小的短肽甚至被過(guò)度酶解后失去活性，這在牡丹籽ACE抑制肽[21]和鯽魚加工下腳料ACE抑制肽[22]研究中也有類似的變化趨勢(shì)。因此，選擇酶解時(shí)間3 h為最佳反應(yīng)條件。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of enzymatic digestion time on ACE inhibition rate

2.2.4 底物濃度對(duì)ACE抑制率的影響

底物濃度高低對(duì)ACE抑制率的影響結(jié)果見圖5。酶解產(chǎn)物的ACE抑制率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在底物濃度低于5%時(shí)，僅達(dá)到30%~35%，可能是由于底物太少，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物較少，導(dǎo)致ACE抑制率較低；當(dāng)?shù)孜餄舛壬?%時(shí)，其抑制率達(dá)到最大值73.49%。當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增大時(shí)，ACE抑制率反而降低，原因可能是當(dāng)?shù)孜餄舛人竭^(guò)高時(shí)，造成了反應(yīng)體系中液體黏度增大，阻礙了蛋白質(zhì)和酶的擴(kuò)散，在酶解反應(yīng)過(guò)程中起了抑制作用[23]，ACE抑制率也隨之出現(xiàn)下降。因此，選擇底物濃度為5%為最佳反應(yīng)條件。

圖5 底物濃度對(duì)ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on ACE inhibition rate

2.2.5 加酶量對(duì)ACE抑制率的影響

加酶量對(duì)ACE抑制率的影響如圖6。由結(jié)果可知，隨著酶量的增加，ACE抑制率呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，在加酶量為0.5%時(shí)達(dá)到峰值75.09%。當(dāng)加酶量持續(xù)增大，抑制率反而降低，因?yàn)槎嘤嗟牡鞍酌赴丫哂蠥CE抑制活性的短肽繼續(xù)酶解[24]，導(dǎo)致ACE抑制率的下降，而且還會(huì)造成資源浪費(fèi)，需同時(shí)考慮成本問(wèn)題和高ACE抑制活性[16,25]。因此，選用加酶量為0.3%為最佳反應(yīng)條件。

圖6 加酶量對(duì)ACE抑制率的影響Fig.6 Effect of enzyme addition on ACE inhibition rate

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 模型建立與方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)，以酶解時(shí)間、底物濃度、加酶量為試驗(yàn)因素，以ACE抑制率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)以優(yōu)化富硒核桃ACE抑制肽的酶解工藝，所得響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和初步研究試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Response surface experimental results

根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以ACE抑制率為響應(yīng)值的二次回歸方程如下：

回歸模型方差分析見表4?；诜讲罘治鼋Y(jié)果建立回歸模型P＜0.01，模型極顯著，表明該模型結(jié)果與實(shí)際分布情況擬合很好，可以用于富硒核桃酶解試驗(yàn)。得出R2=0.90，R2adj=0.76，說(shuō)明模型可以較好地反映響應(yīng)值的變化；失擬項(xiàng)不顯著，回歸模型和預(yù)測(cè)值之間有較好的擬合度。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Regression model analysis of variance

借助時(shí)間、底物濃度、加酶量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化，以獲得對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)分析。從二次方程的回歸系數(shù)中得知，因素A（時(shí)間）、C（加酶量）對(duì)酶解富硒核桃ACE抑制率影響顯著；因素B（底物濃度）對(duì)酶解富硒核桃ACE抑制率影響不顯著；交互項(xiàng)影響均不顯著；二次項(xiàng)A2對(duì)酶解富硒核桃ACE抑制率影響極顯著、B2對(duì)酶解富硒核桃ACE抑制率影響顯著。

根據(jù)回歸模型構(gòu)建相應(yīng)的響應(yīng)面和等高線 （圖7~9），并從不同因素角度分析響應(yīng)面，響應(yīng)面等高線圖可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，能找到最佳工藝參數(shù)和各參數(shù)之間的關(guān)系，等高線圖形中最小橢圓的中心點(diǎn)即為響應(yīng)面的最高點(diǎn)[26]。

圖7 酶解時(shí)間和底物濃度對(duì)酶解反應(yīng)ACE抑制率的影響響應(yīng)面圖與等高線Fig.7 Response surface plots and contours of the effect of enzymatic digestion time and substrate concentration on the ACE inhibition rate of the enzymatic reaction

圖8 酶解時(shí)間和加酶量對(duì)酶解反應(yīng)ACE抑制率的影響響應(yīng)面圖與等高線Fig.8 Response surface plots and contours of the effect of enzymatic digestion time and enzyme addition on the ACE inhibition rate of the enzymatic reaction

圖9 底物濃度和加酶量對(duì)酶解反應(yīng)ACE抑制率的影響響應(yīng)面圖與等高線Fig.9 Response surface plots and contours of the effect of substrate concentration and enzyme addition on the ACE inhibition rate of the enzymatic reaction

2.3.2 模型驗(yàn)證

通過(guò)響應(yīng)面方法的設(shè)計(jì)，得到酶解富硒核桃的最佳條件為：反應(yīng)時(shí)間為2.52 h，反應(yīng)底物濃度為5.39%，加酶量為0.33%，預(yù)測(cè)測(cè)得ACE抑制率為78.74%。根據(jù)此最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到酶解富硒核桃反應(yīng)的實(shí)際ACE抑制率為79.13%，高于單因素試驗(yàn)結(jié)果；實(shí)際ACE抑制率與預(yù)測(cè)ACE抑制率實(shí)驗(yàn)誤差值為0.48%，相近于預(yù)測(cè)值。因此，利用響應(yīng)面法對(duì)酶解富硒核桃蛋白的酶解工藝優(yōu)化是穩(wěn)定可行的。

2.4 酶解物的超濾分離及活性對(duì)比分析

經(jīng)過(guò)3 ku超濾膜超濾分離，得到＜3 ku和＞3 ku的組分隨后凍干開展ACE抑制活性研究。使用HEPES緩沖液配制濃度為1 mg/mL的溶液，進(jìn)行ACE抑制率的測(cè)定。由圖10可知，＜3 ku的組分ACE抑制率顯著高于＞3 ku組分，達(dá)到77.78%。由此結(jié)果可知，分子量相對(duì)較小的組分ACE抑制活性也更高，在綿羊乳酪蛋白和馬面魚皮含有的ACE抑制肽中也有類似的結(jié)論表明分子量較小的ACE抑制肽其抑制活性越高[13,27]。原因可能是分子質(zhì)量大的肽段結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，具備抑制活性的氨基端沒有暴露，導(dǎo)致ACE抑制作用低[28]。

圖10 超濾分離各組分ACE抑制率Fig.10 Ultrafiltration separation of each component ACE inhibition rate

2.5 氨基酸組成分析

采用陽(yáng)離子交換色譜柱（LCA K06/Na柱），在流動(dòng)相為檸檬酸鈉A=0.12 N，pH值3.45和B=0.2 N，pH值10.85，流速為洗脫泵0.45 mL/min+衍生泵 0.25 mL/min，溫度在58 ℃~74 ℃梯度控溫，壓力范圍控制在30 bar~40 bar，進(jìn)樣量在20 μL的條件下測(cè)得波長(zhǎng)570 nm與440 nm的曲線與數(shù)據(jù)如圖11所示。

圖11 氨基酸分析色譜圖Fig.11 Chromatogram for amino acid analysis

根據(jù)氨基酸的分析色譜圖可知，檢測(cè)到共16種氨基酸，其中包含了7種人體必需氨基酸，含量共26.36%。其中在440 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)到脯氨酸的存在，其含量為2.88%。大多數(shù)研究表明在ACE抑制肽中，脯氨酸起著非常重要的作用，其存在使其附近的多肽不易被體內(nèi)的水解酶降解[29]，所以脯氨酸的存在對(duì)保護(hù)抑制肽有著重要意義。

其次，有研究表明，ACE抑制肽序列的疏水性和空間特性在生物活性上起著重要作用[30]。由于ACE的C端的結(jié)構(gòu)域包含的3個(gè)催化活性位點(diǎn)都有明顯的疏水性[12]，說(shuō)明其C端結(jié)構(gòu)域是疏水性環(huán)境。當(dāng)?shù)孜锖惺杷园被釙r(shí)ACE更傾向于與其結(jié)合[16]，可以得出疏水性氨基酸對(duì)ACE抑制肽的抑制能力有重 要影響，并且其數(shù)量和位置則直接影響多肽的空間結(jié)構(gòu)的形成[31]。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，樣品中含有的疏水性氨基酸共7種，總含量為27.19%，其豐富的種類與含量可能對(duì)ACE抑制肽的高抑制活性具有一定影響。

表5 富硒核桃粕酶解物氨基酸的相對(duì)百分含量Table 5 Relative percentages of amino acids in enzymatic digest of selenium-rich walnut meal

2.6 硒含量分析

由表6可得，富硒核桃中的硒含量為1.64 mg/kg，遠(yuǎn)大于普通市售核桃的硒含量0.11 mg/kg。酶解物、＜3 ku組分和＞3 ku組分的硒含量分別為0.82 mg/kg、1.35 mg/kg和0.32 mg/kg。這說(shuō)明富硒核桃中存在于多糖、核酸或沒被完全酶解的蛋白等成分中的約50%的硒元素在酶解后的離心環(huán)節(jié)中已損失掉[32]。而酶解物中硒元素主要集中在占比較小的＜3 ku的肽組分中，而占比較大的＞3 ku組分中硒含量明顯較低。堿性蛋白酶在制備富硒肽的現(xiàn)有研究中常使用堿性蛋白酶，例如富硒平菇肽[33]與富硒玉米肽[34]的制備。本研究在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考慮到堿性蛋白酶酶所得水解物后續(xù)需要脫鹽工藝操作，因此選用弱堿性的胰蛋白酶作為工具酶，發(fā)現(xiàn)在pH值7.5弱堿性條件下對(duì)富硒核桃粕進(jìn)行酶解，效果相對(duì)較好，得到的＜3 ku組分硒濃度接近于富硒核桃粕，同時(shí)ACE抑制活性隨著pH值的升高而降低。在富硒大豆[35]研究中發(fā)現(xiàn)，利用中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解得到的富硒大豆低聚肽中硒含量也達(dá)到76.39 μg/kg，這說(shuō)明在弱堿性、中性甚至弱酸性酶解條件下也具有良好的含硒肽段釋放效果。

表6 市售核桃與富硒核桃及其酶解物的硒含量分析Table 6 Analysis of the selenium content of commercially available walnuts and selenium-enriched walnuts and their enzymatic digests

3 結(jié)論

本研究通過(guò)蛋白酶篩選，單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化確定了富硒核桃蛋白ACE抑制肽的最優(yōu)酶解工藝。在此研究基礎(chǔ)上通過(guò)超濾分離得到了ACE抑制活性更好的小分子量肽組分，同時(shí)對(duì)酶解物的氨基酸組成和硒含量進(jìn)行了分析。本研究首次通過(guò)富硒核桃粕制備ACE抑制肽，為富硒核桃粕高值化利用提供了新的研究思路，為食物源性補(bǔ)硒產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。