生物炭對四環(huán)素污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響及環(huán)境因子關聯(lián)的劑量效應分析

李慧君，衛(wèi)婷，黃楓城，陳藝杰，李高洋，張偉健，吳偉健，藺中，甄珍*

（1.廣東海洋大學濱海農(nóng)業(yè)學院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學化學與環(huán)境學院，廣東 湛江 524088）

四環(huán)素類抗生素是一類具有并四苯結(jié)構(gòu)的廣譜性抗生素，常用種類包括四環(huán)素（Tetracycline，TC）、金霉素（Chlortetracycline，CTC）和土霉素（Oxytetracycline，OTC），在防治細菌感染、促進動物生長和防止病蟲害等方面有巨大貢獻[1]。四環(huán)素因價格低廉、抑菌效果好[2]而被廣泛應用于養(yǎng)殖業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)（年均用量10 002.73 t）中[3]。據(jù)統(tǒng)計，30%～90%的四環(huán)素可隨尿糞排出體外，并伴隨糞肥農(nóng)用在我國農(nóng)田土壤中累積[4]。我國農(nóng)業(yè)用地（菜田、大棚）四環(huán)素檢測范圍介于0～2 450 μg·kg-1之間[5]，部分地區(qū)抗生素濃度遠超歐盟標準的生態(tài)安全風險值（100 μg·kg-1）[6]。進入農(nóng)田土壤的四環(huán)素嚴重破壞土壤微生物種群結(jié)構(gòu)，誘導土壤中耐藥基因的產(chǎn)生，干擾土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和流動。更為關鍵的是，土壤中的四環(huán)素還會被蔬菜等作物吸收，并通過食物鏈傳播給人類[7]。土壤四環(huán)素污染已嚴重威脅我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)地環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，進而影響到人體健康。因此，尋求一種高效經(jīng)濟的措施促進四環(huán)素去除，保障生態(tài)安全成為當前研究的熱點。

農(nóng)田土壤四環(huán)素修復技術主要包括物理、化學和生物修復[8-9]。物理（如吸附）或化學（如氧化）修復技術，由于成本高昂、可持續(xù)性差、易造成二次污染等問題而難以大范圍推廣。與之相比，生物修復技術是一種更有效和環(huán)保的方法。目前，土壤四環(huán)素的生物修復多集中于接種馴化的降解菌。然而，實際應用中面臨的環(huán)境適應力差、與土著微生物相互競爭、受污染物種類和濃度限制等諸多限制因素，致使田間修復效果欠佳。大量研究證實，土壤中的Trichosporon mycotoxinivorans、Stenotrophomonas maltophilia和Sphingobacterium等微生物能夠代謝四環(huán)素[10-12]。在自然環(huán)境中，降解微生物生長緩慢、豐度低、分解代謝活性差，致使其降解四環(huán)素能力較低。近年來，國內(nèi)外學者致力于激發(fā)土著微生物降解效率的驅(qū)動因素研究，從而嘗試解決上述限制因素。例如改善微生物生存環(huán)境條件、添加營養(yǎng)物刺激微生物的代謝活性等[13-15]。

生物炭是由作物秸稈、污泥等生物質(zhì)材料在限氧條件下，經(jīng)過高溫熱解炭化形成的多孔富碳材料[16]，其理化性質(zhì)穩(wěn)定，比表面積大，孔隙結(jié)構(gòu)豐富，富含C、N、P等元素。一方面，生物炭不僅可以提高土壤的透氣性，改善土壤環(huán)境[17]，為微生物提供良好的棲息環(huán)境。另一方面，生物炭可作為土壤微生物代謝碳源，為微生物生長和繁殖提供必需的營養(yǎng)元素[18]。此外，生物炭含有羥基、羧基、羰基等官能團，可有效吸附土壤中的四環(huán)素，減少四環(huán)素在環(huán)境中的遷移[19]。因此，生物炭作為一種新型改良劑，在四環(huán)素的去除中發(fā)揮著重要作用。不同劑量生物炭對土壤中四環(huán)素去除的影響效果和機制差異很大。低劑量生物炭的施入可能導致土著微生物活性激發(fā)不完全，效果不佳[15]。高劑量生物炭易產(chǎn)生較強的吸附固定效果，反而延緩土壤中四環(huán)素的生物降解，且造成資源浪費[20]。適宜的劑量是決定生物炭修復農(nóng)田土壤中四環(huán)素效果的關鍵因素，明確合適的生物炭劑量對于修復農(nóng)田土壤四環(huán)素污染具有重要的現(xiàn)實意義。

據(jù)此，本研究以南方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見的廢棄物甘蔗渣為原材料制備生物炭，選取3 種劑量（1%，2%，3%）生物炭對農(nóng)田土壤中四環(huán)素的去除性能進行探究。運用高通量測序測定不同劑量生物炭對農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，尋找潛在的降解微生物類群。通過測定土壤酶活性反映生物炭施入后對土壤健康質(zhì)量狀況的改善情況。進一步運用冗余分析（Redundancy analysis，RDA）對土壤理化性質(zhì)、四環(huán)素去除效率以及細菌群落結(jié)構(gòu)進行相關性研究，以期明確生物炭通過改變何種環(huán)境因子，促進污染土壤四環(huán)素的去除。研究結(jié)果為開發(fā)一種高效環(huán)保的農(nóng)田四環(huán)素污染修復技術提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗土壤采集自廣東省湛江市麻章區(qū)郊區(qū)農(nóng)田（21°04′1.85″N，110°19′27.86″E），用土壤取樣器取表層0～20 cm 的土壤，土樣采集后風干研磨過0.25 mm 篩備用。土壤中未檢測出四環(huán)素。供試土壤理化性質(zhì)：pH 為5.35，有機質(zhì)含量為31.66 g·kg-1，腐殖質(zhì)含量為11.92 g·kg-1。

生物炭原材料為甘蔗渣，收集于廣東湛江市遂溪制糖廠，生物炭具體制備步驟：原材料經(jīng)自然風干、粉碎、研磨后過2 mm 篩。將研磨的甘蔗渣置于陶瓷坩堝中，壓實蓋上蓋，于馬弗爐中按目標溫度熱解炭化。馬弗爐升溫速率為10 ℃·min-1，升至550 ℃并保持2 h。待爐內(nèi)溫度自然冷卻后取出生物炭，置于廣口瓶中，干燥保存待用。生物炭理化性質(zhì)：pH 為9.03，有機質(zhì)含量為548.69 g·kg-1。

鹽酸四環(huán)素（純度＞98%）購于美國Sigma-Aldrich公司。乙腈、甲醇和乙酸乙酯購于美國Sigma-Aldrich 公司，為高效液相色譜（HPLC）級。其他化學品均購于中國科城生物技術有限公司，均為分析純。

1.2 試驗設計

試驗共設置4 個處理：土壤+四環(huán)素（CK）、土壤+四環(huán)素+1%生物炭（BC-1）、土壤+四環(huán)素+2%生物炭（BC-2）、土壤+四環(huán)素+3%生物炭（BC-3），每個處理設置3 個重復。依據(jù)文獻報道的農(nóng)田土壤中四環(huán)素污染現(xiàn)狀[21]（檢測范圍介于0.01～300.00 mg·kg-1），本研究以四環(huán)素含量為5.00 mg·kg-1（以干土質(zhì)量計）代表四環(huán)素在土壤中污染的情況。供試土壤初始含水率為10%，將60.00 mg 鹽酸四環(huán)素溶解于水中，并與1.00 kg 供試土壤充分混合30 min。將人工污染土壤與11.00 kg 供試土壤混合，制備成最終均勻土壤樣品。將土壤平均分成12份，放入寬10 cm、高30 cm的圓柱形培養(yǎng)瓶內(nèi)。按試驗設計分別添加1%、2%和3%的生物炭。隨后，將土壤的含水率調(diào)節(jié)到田間持水量的60%。所有處理均在25 ℃的恒溫和黑暗密封條件下培養(yǎng)。于第0、10、20、30、40 天，5 個時間段分別采集樣品，并置于-20 ℃冷凍保存，測定四環(huán)素殘留量、土壤理化性質(zhì)和酶活性指標。試驗結(jié)束時（第40天）高通量測序土壤樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)。

1.3 四環(huán)素殘留量的測定

將冷凍干燥后的土壤樣品過0.15 mm 篩，隨后稱取土壤樣品1.00 g。將土樣置于50 mL帶蓋塑料離心管中。先向離心管中加入20 mL McIlvaine -Na2EDTA-甲醇提取液用于提取四環(huán)素，在漩渦振蕩器上室溫（約25 ℃）提取1 min，使土壤與提取液混合均勻，然后將離心管置于超聲波清洗儀下10 min，最大程度破碎土壤顆粒，在機械振蕩提取儀中室溫（約25 ℃）提取20 min，充分提取四環(huán)素，于15 ℃下置于4 000 r·min-1的離心機上，離心10 min 后取上清液至另一離心管中。向殘渣中依次加入20、10 mL Mc-Ilvaine-Na2EDTA-甲醇提取液，重復提取兩次，合并上清液并用提取液定容至50 mL。取5 mL 上清液置于氮氣吹干儀上，室溫下避光吹至原體積的一半左右，加適量水稀釋至5 mL，然后以1.00 mL·min-1的速度通過已活化處理的固相萃取柱。依次用5 mL 水、5 mL 甲醇－水淋洗固相萃取柱，將以上過程的流出液全部棄去，減壓抽干5 min，再用5 mL 色譜純甲醇洗脫目標物。將洗脫出的樣品再次置于氮氣吹干儀上吹至近干，最后用1 mL 的甲醇溶解殘渣，過0.22 μm有機相濾膜，樣品待測。色譜柱為安捷倫的規(guī)格為4.66 mm×260.00 mm 的烷基C18 反相柱；流動相為三元流動相，甲醇∶草酸∶乙腈=10∶80∶10；流速1 mL·min-1；柱溫為左右端均25 ℃；進樣量為10 μL；紫外燈檢測波長為355 nm。每個試驗樣品進行3 次重復測定，回收率在95.80%～102.50%之間。

1.4 土壤理化性質(zhì)測定

土壤理化性質(zhì)測定依據(jù)《土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法》[22]，具體為：

土壤pH 的測定：土壤pH 采用電位法（水土比為2.5∶1）測定。稱取過2 mm篩的風干土樣10.00 g，將其置于50 mL 燒杯中，加入25 mL 無CO2的水，攪動1 min，使土樣充分分散。靜置30 min 后將校準過的雷磁pH 計（型號為PHSJ-3F，上海儀電科學儀器股份有限公司）插入上部澄清液中，待讀數(shù)穩(wěn)定后讀取pH值。

有機質(zhì)的測定：在外加熱的條件下（油浴溫度為180 ℃，沸騰5 min），用一定濃度的重鉻酸鉀-硫酸溶液氧化土壤有機碳，剩余的重鉻酸鉀用硫酸亞鐵滴定，通過所消耗的重鉻酸鉀量按校正系數(shù)計算出有機碳含量。

腐殖質(zhì)的測定：用含有焦磷酸鈉和氫氧化鈉的浸提劑提取腐殖質(zhì)，將土壤中難溶和易溶的結(jié)合態(tài)腐殖質(zhì)一次結(jié)合成易溶的腐殖酸鈉鹽，從而將腐殖質(zhì)浸出，然后用重鉻酸鉀氧化外加熱法進行測定。

1.5 土壤酶活性測定

蔗糖酶活性的測定：蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定[23]。采用還原糖共熱法將3，5-二硝基水楊酸還原為3-氨基-5-硝基水楊酸，利用分光光度計在508 nm 波長下進行比色測定，其活性以每日每克土生成葡萄糖的量表示，單位為mg·g-1·d-1。

脲酶活性的測定：脲酶活性測定采用靛酚藍比色法測定[24]。酶促產(chǎn)物氨在堿性基質(zhì)中與苯酚及次氯酸鈉作用產(chǎn)生靛酚藍，靛酚藍的生成量與氨濃度呈正比，利用分光光度計在578 nm 處進行比色分析，其活性以每日每克土壤生成銨態(tài)氮的量表示，單位為mg·g-1·d-1。

過氧化氫酶活性的測定：過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測定[25]。用高錳酸鉀滴定量之差計算分解量，以1.00 g 干土每1 h 內(nèi)消耗0.10 mol·L-1KMnO4的體積數(shù)（以mL計）表示，單位為mL·g-1·h-1。

脫氫酶活性的測定：脫氫酶活性采用TTC還原法測定[26]。采用氯化三苯基四氮唑還原法，用三苯基四唑氯化物作為氫的受體生成紅色三苯基甲?（TPF），TPF 的量與紅色深淺有關。利用分光光度計在485 nm 處進行比色測定，脫氫酶活性以每日每克土生成的TPF的量表示，單位為μg·g-1·d-1。

1.6 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)測定

利用Bio Fast 土壤DNA 提取試劑盒（BIOEER，杭州）提取土壤樣品DNA，利用NanoDrop 200 檢測DNA濃度和純度。用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）通用引物進行PCR 擴增，擴增區(qū)域為16S rRNA V3+V4高變區(qū)。PCR反應體系由KOD FX Neo緩沖液5 μL（2 mmol·L-1）、dNTP 2 μL（各2 mmol·L-1）、KOD FX Neo 0.2 μL、引物0.3 μL、模板DNA 50 ng、去離子水（加至終體積10 μL）組成。PCR 擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環(huán)，最后于72 ℃延伸5 min。將擴增后的產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進行檢測并回收，并委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行純化和測序。

1.7 數(shù)據(jù)分析

在Illumina MiSeq 高通量測序平臺進行雙末端測序后，使用Usearch 11.0 對序列在97%的相似度水平下進行聚類獲得操作分類單元（Operational taxonomic units，OTUs）。使用Silva 數(shù)據(jù)庫（https：//www.arbsilva.de/）對所有OTUs進行分類學注釋。為了評估細菌微生物群落的豐富度和復雜性，使用QIIME 1.8.0獲得屬水平上的物種組成圖和聚類熱圖[27]。土壤理化性質(zhì)、酶活性均采用SPSS 25.0 進行正態(tài)性分布和方差齊性檢驗后對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（Oneway ANOVA），采用鄧肯（Duncan′s）法進行多重比較（P＜0.05），來檢驗不同處理間的顯著差異性。利用Origin 2022 繪制柱形圖，利用Canoco 5.0 中的線性模型RDA 分析降解率與微生物群落結(jié)構(gòu)及環(huán)境因子的相關關系。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量生物炭對土壤四環(huán)素去除的影響

如圖1 所示，生物炭處理下的土壤中四環(huán)素含量均顯著低于CK（P＜0.05），說明添加生物炭可以顯著加速四環(huán)素的降解效率。經(jīng)過40 d的培養(yǎng)后，BC-2處理下四環(huán)素的去除效率（79.50%）顯著高于BC-3（62.50%）和BC-1（50.30%）處理（P＜0.05），表明不同劑量的生物炭對四環(huán)素的去除效果有一定差異，其中BC-2處理效果最優(yōu)。

圖1 不同處理下的四環(huán)素殘留量Figure 1 Residual concentrations of tetracycline under different treatments

2.2 不同劑量生物炭對四環(huán)素污染土壤理化性質(zhì)的影響

不同劑量生物炭對土壤理化性質(zhì)有顯著影響（表1）。與CK相比，添加生物炭提高了土壤pH值和有機質(zhì)、腐殖質(zhì)含量。培養(yǎng)40 d 后，生物炭處理（BC-1、BC-2 和BC-3）的pH 值分別比CK 提高了0.46、0.54個和0.80 個單位。不同劑量生物炭對土壤有機質(zhì)的含量也有較大影響。施入生物炭后（0 d 時），BC-1、BC-2和BC-3處理土壤有機質(zhì)含量較CK顯著增加了5.37%、8.85%和19.23%（P＜0.05）。在整個培養(yǎng)期間，各生物炭處理組有機質(zhì)含量呈逐漸下降趨勢，但均高于CK 處理。40 d 后，BC-1、BC-2 和BC-3 處理土壤的腐殖質(zhì)含量均顯著大于CK，與CK 處理相比，BC-1、BC-2 和BC-3 處理增幅分別為37.06%、54.18%和43.09%（P＜0.05），且生物炭處理組腐殖質(zhì)含量始終呈逐漸上升的趨勢。

表1 不同處理下土壤理化性質(zhì)的變化Table 1 Changes of soil physical and chemical properties under different treatments

2.3 不同劑量生物炭對四環(huán)素污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

試驗結(jié)束時，在所有土壤中共獲得386 984 條有效序列，每個樣品的有效序列范圍為80 254～80 796條，其中共鑒定出3 055 個OTUs，相似度為97%。在屬水平上，將相對豐度前20 的細菌屬選為優(yōu)勢細菌屬，剩余的歸為其他（Others）。圖2a 為不同處理下屬水平細菌群落結(jié)構(gòu)的變化，CK 中Achromobacter（無色桿菌屬）、Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Trichosporon（毛孢子菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）等為主要優(yōu)勢菌。不同劑量生物炭添加后，Achromobacter（無色桿菌屬）、Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Trichosporon（毛孢子菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Ralstonia（雷爾氏菌屬）和Klebsiella（克雷伯菌屬）的豐度發(fā)生了顯著的變化。添加不同劑量的生物炭顯著提升了土壤中優(yōu)勢微生物的豐度。和CK相比，BC-1、BC-2和BC-3處理中Achromobacter（無色桿菌屬）的相對豐度分別提升103.02%、224.22%和145.41%，Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）的相對豐度分別提升138.12%、209.53% 和5.22%，Trichosporon（毛孢子菌屬）的相對豐度分別提升8.31%、150.42%和25.01%，Pseudomonas（假單胞菌屬）的相對豐度分別提升150.00%、283.31%和16.34%，Ralstonia（雷爾氏菌屬）的相對豐度分別提升175.21%、300.43%和500.20%，Klebsiella（克雷伯菌屬）的相對豐度分別提升12.13%、240.31%和17.64%，其中除Ralstonia（雷爾氏菌屬）外的其他菌屬的相對豐度均為BC-2 處理提升的幅度最大。Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）僅在BC-2 處理中增長了20.61%，在BC-1 和BC-3 處理中分別下降了13.82%和10.44%。Shewanella（希瓦氏菌屬）也僅在BC-2 處理中增長了17.60%，在BC-1 和BC-3 處理中分別下降了58.90%和35.30%。Bacillus（芽孢桿菌屬）僅在BC-1 處理中增長了68.70%，在BC-2 和BC-3 處理中分別下降了28.50%和28.70%。與CK 相比，BC-1、BC-2、BC-3處理中Comamonas（叢毛單胞菌屬）的相對豐度分別下降了17.20%、14.30%和7.60%。圖2b 為不同處理下屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)聚類熱圖，根據(jù)細菌屬的層次聚類熱圖，將樣品分為三大類。BC-1、BC-2 與CK 和BC-3 組合分離，表明添加生物炭對細菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。與CK處理相比，BC-2處理的細菌群落結(jié)構(gòu)變化最大。

圖2 不同處理下微生物群落結(jié)構(gòu)的變化Figure 2 Changes of microbial community structure under different treatments

2.4 不同劑量生物炭對四環(huán)素污染土壤酶活性的影響

添加不同劑量生物炭均可以提升土壤脲酶、蔗糖酶、過氧化氫酶和脫氫酶的活性。圖3a 顯示，添加不同劑量生物炭處理中土壤脲酶活性在20 d 時達到峰值，試驗結(jié)束時，BC-1、BC-2 和BC-3 的脲酶活性分別為4.27、5.16、4.47 mg·g-1·d-1，顯著高于CK（3.61 mg·kg-1·d-1），其中BC-2 對脲酶活性的促進作用最顯著。添加不同劑量生物炭處理中土壤蔗糖酶活性在30 d 時達到峰值，隨后降低（圖3b），40 d 后BC-1、BC-2、BC-3 的土壤蔗糖酶活性分別較CK 增加了164.10%、183.30%、128.50%。生物炭處理中，過氧化氫酶活性在20 d 時達到峰值，但脫氫酶活性在整個培養(yǎng)過程中持續(xù)升高。試驗結(jié)束時，BC-1、BC-2和BC-3 處理的過氧化氫酶活性分別為6.86、7.39 mL·g-1·h-1和6.97 mL·g-1·h-1，均顯著高于CK（4.47 mL·g-1·h-1），脫氫酶活性分別為0.89、1.39 μg·g-1·d-1和1.14 μg·g-1·d-1，也均顯著高于CK（0.54 μg·g-1·d-1）。綜上所述，生物炭的施入大幅度提升了土壤的酶活性，其中以BC-2 處理提升效果最好。

圖3 不同處理下土壤酶活性的變化Figure 3 Changes of soil enzyme activities under different treatments

2.5 環(huán)境因子、土壤微生物及四環(huán)素降解效率的關聯(lián)分析

土壤微生物群落、環(huán)境因子和四環(huán)素降解效率之間的相關性如圖4所示。RDA 結(jié)果表明，第一軸解釋關聯(lián)性信息的57.70%，第二軸解釋25.10%，累計解釋信息量為82.80%。由此得出，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、環(huán)境因子與四環(huán)素降解效率的相關性主要是由第一軸來解釋。第一軸主要與Achromobacter（無色桿菌屬）、Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Trichosporon（毛孢子菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Ralstonia（雷爾氏菌屬）、Klebsiella（克雷伯菌屬）等細菌屬有關。第二軸主要與土壤理化性質(zhì)（pH、有機質(zhì)和腐殖質(zhì)含量）有關。添加不同劑量生物炭對土壤四環(huán)素降解效率的影響主要源于其對土壤蘊含的微生物種群結(jié)構(gòu)和豐度的影響，土壤理化性質(zhì)的改變貢獻率次之。第一軸微生物群落中，Achromobacter（無色桿菌屬）、Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Trichosporon（毛孢子菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Ralstonia（雷爾氏菌屬）、Klebsiella（克雷伯菌屬）和Nocardioides（諾卡氏菌屬）與四環(huán)素降解效率呈正相關，Mycobacterium（分枝桿菌屬）、Streptomyces（鏈霉菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）和Comamonas（叢毛單胞菌屬）與四環(huán)素去除效率呈負相關。第二軸土壤理化性質(zhì)中，四環(huán)素去除效率主要與pH 和腐殖質(zhì)含量呈正相關。

圖4 環(huán)境因子、土壤微生物與四環(huán)素去除效率的冗余分析Figure 4 Redundancy analysis of environmental factors，soil microorganisms and tetracycline removal efficiency

3 討論

本研究探討生物炭的不同劑量對土壤中四環(huán)素去除效率的影響。培養(yǎng)40 d后，生物炭處理的四環(huán)素殘留量顯著低于CK，說明生物炭處理顯著加快了土壤中四環(huán)素的去除，且BC-2 處理的四環(huán)素去除效率（79.50%）顯著高于BC-3（62.50%）和BC-1（50.30%）處理。同時發(fā)現(xiàn)土壤原生微生物在四環(huán)素污染土壤的解毒凈化中發(fā)揮著重要作用。不同劑量的生物炭在不同程度上提高了土壤降解微生物的豐度。結(jié)果表明，生物炭能改善土壤理化性質(zhì)和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，提升具有四環(huán)素降解功能的微生物的豐度，進而加速四環(huán)素在土壤中的降解。本研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素降解在土壤中既有生物因素也有非生物因素，其中生物因素占主導作用。

生物炭在土壤中的應用被認為是一種環(huán)保且具有成本效益的方法，它可以加速污染物降解并減少污染物帶來的風險[28]。本研究表明，添加生物炭后土壤中某些細菌群落的豐度發(fā)生了變化，這些細菌群落可能可以作為評價四環(huán)素對土壤環(huán)境污染程度的生物指標。施入生物炭后，Achromobacter（無色桿菌屬）、Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Trichosporon（毛孢子菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Ralstonia（雷爾氏菌屬）、Klebsiella（克雷伯菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）和Comamonas（叢毛單胞菌屬）的細菌豐度相比于CK 顯著提高。RDA 冗余分析表明，Achromobacter（無色桿菌屬）、Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Trichosporon（毛孢子菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Ralstonia（雷爾氏菌屬）和Klebsiella（克雷伯菌屬）與四環(huán)素降解效率呈正相關，說明他們顯著影響著四環(huán)素在土壤中的降解。Achromobacter（無色桿菌屬）、Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Trichosporon（毛孢子菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）和Klebsiella（克雷伯菌屬）被發(fā)現(xiàn)為潛在的降解菌。其中，Achromobacter（無色桿菌屬）被發(fā)現(xiàn)是四環(huán)素潛在降解菌，可以促進四環(huán)素的高效降解，Wang 等[29]研究發(fā)現(xiàn)在四環(huán)素的污染環(huán)境下，Achromobacter（無色桿菌屬）在降解四環(huán)素過程中起主導作用。Shao等[30]發(fā)現(xiàn)Klebsiella（克雷伯菌屬）可以在8 d 內(nèi)降解超過89.66%的四環(huán)素。Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）含有編碼NADP 依賴的單加氧酶的tetX基因，可針對性地對土壤中的四環(huán)素進行降解[11]。Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）可以將四環(huán)素或其代謝物作為碳源，在四環(huán)素降解過程中保持較高的活性[31]。Pseudomonas（假單胞菌屬）可以礦化多種藥物，包括四環(huán)素、磺胺甲惡唑和環(huán)丙沙星[32]。在生物炭處理中，這些細菌在BC-2 處理中的豐度提升幅度最大，說明適宜濃度的生物炭可以促進土壤中四環(huán)素降解菌群豐度的提高，進一步加速微生物對四環(huán)素的生物降解。

土壤酶作為土壤組分之一，是一種具有加速土壤生化反應速率功能的蛋白質(zhì)，其參與土壤生物化學過程中許多有關物質(zhì)循環(huán)和能量流動的反應[10]。土壤酶活性的高低能夠表征土壤中微生物活性的高低，同時反映出土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化及其運移能力的強弱，是土壤綜合肥力特征的有效反映[33]。土壤脲酶是唯一能對尿素起轉(zhuǎn)化作用的酶，能夠破壞C--N鍵，催化尿素分解生成氨、二氧化碳和水，為植物提供氮素營養(yǎng)[34]。土壤蔗糖酶是一種能將蔗糖水解為葡萄糖和果糖，增加土壤中易溶性營養(yǎng)物質(zhì)，為微生物提供能源的水解酶[33]。土壤脫氫酶和過氧化氫酶是直接參與異生物解毒的主要微生物催化劑，已得到廣泛的研究[33，35]。本研究表明，四環(huán)素污染降低了土壤的酶活性，這與Chessa 等[36]關于外源添加四環(huán)素會對土壤微生物活性產(chǎn)生不利影響的研究結(jié)果一致，也與李研等[37]研究抗生素菌渣作為有機肥施入土壤中對土壤酶活性產(chǎn)生影響的結(jié)果一致。造成抑制作用的原因是四環(huán)素進入土壤后與土壤內(nèi)的酶分子形成了穩(wěn)定的絡合物，從而使酶活性降低，表現(xiàn)出抑制性。施入生物炭之后，土壤酶活性得到了提升，其中BC-2處理提升能力最強。由于生物炭自身含碳豐富，施入土壤直接增加了碳源，為微生物提供了溫床，使優(yōu)勢微生物得到生長，間接提高了土壤中的微生物數(shù)量和酶活性[38]。同時，生物炭可以為微生物提供生活所需的能量，生物炭蘊含的有效養(yǎng)分和可溶性碳可促進土壤微生物的生存與繁殖，使之生命活動旺盛，從而間接增強土壤酶活性[39]。生物炭由于自身的吸附能力，減緩了四環(huán)素對酶活性的抑制作用。生物炭吸附在土壤酶基上，促進酶促反應位點，提高土壤酶活性[40]，并間接增強土壤自身的解毒能力，本研究與Briceno 等[41]研究一致。生物炭的施入極大促進了土壤中四環(huán)素污染物降解菌群豐度的提高，加速了微生物對四環(huán)素的消耗，從而降低了土壤中四環(huán)素對微生物的毒害，使得土壤過氧化氫酶、脲酶、脫氫酶和蔗糖酶的活性提高。

土壤是一個復雜的多相體系。土壤的理化性質(zhì)（pH 和有機質(zhì)、腐殖質(zhì)含量）會影響四環(huán)素的降解[42]。RDA 結(jié)果表明，四環(huán)素的降解效率與土壤pH 和有機質(zhì)、腐殖質(zhì)含量呈正相關關系（圖4）。土壤pH 是影響四環(huán)素降解的重要因素，施入生物炭顯著提高了土壤pH。大量研究表明，與酸性土壤相比，四環(huán)素在中性或堿性土壤中更容易被降解[43-44]。在堿性環(huán)境中，四環(huán)素苯環(huán)C6位置的羥基在氫氧根離子的作用下容易形成氧負離子，向C11發(fā)生分子內(nèi)親核進攻，破壞C環(huán)，從而生成非活性的內(nèi)酯異構(gòu)體，加速四環(huán)素的去除[45]。此外，pH 可以影響有機質(zhì)對四環(huán)素的吸附和固定作用，從而改變四環(huán)素的生物利用度，加速其在土壤中的去除[21]。四環(huán)素在土壤中的吸附率隨土壤pH 的增加而降低。腐殖質(zhì)結(jié)構(gòu)以芳香核為主體，附以大量羰基、酚羥基等基團。當腐殖質(zhì)增多時，羧基和酚羥基與四環(huán)素的--N（CH3）2基團結(jié)合發(fā)生反應，從而促進四環(huán)素的氧化降解[46]。因此，生物炭可以通過提高土壤pH 和有機質(zhì)、腐殖質(zhì)含量加速四環(huán)素的去除。同時，土壤中的電子傳遞作用會影響四環(huán)素的降解，促使四環(huán)素結(jié)構(gòu)中雙鍵的電子轉(zhuǎn)移到配位鍵上，強化的親核性質(zhì)，削弱雙鍵的穩(wěn)定性，使得更容易破壞四環(huán)素的結(jié)構(gòu)，使得四環(huán)素的毒性顯著降低[47]。

4 結(jié)論

（1）1%（BC-1）、2%（BC-2）、3%（BC-3）3 種不同劑量的生物炭均可加速四環(huán)素在土壤中的去除，表現(xiàn)為BC-2（79.50%）＞BC-3（62.50%）＞BC-1（50.30%）。

（2）3 種不同劑量的生物炭提升土壤原生四環(huán)素潛在降解微生物Achromobacter（無色桿菌屬）、Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Trichosporon（毛孢子菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Klebsiella（克雷伯菌屬）的豐度，進而顯著加速土壤四環(huán)素的去除，其中BC-2處理對土壤原生潛在降解微生物豐度的提升最強。3 種不同劑量的生物炭均可提升土壤的理化性質(zhì)（pH、有機質(zhì)、腐殖質(zhì)），其中BC-3 處理對pH 和有機質(zhì)的提升效果最好，BC-2 處理對腐殖質(zhì)的提升效果最好。

（3）3 種不同劑量生物炭的施入均可以顯著提高四環(huán)素污染土壤中脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶和脫氫酶的活性，提高土壤健康質(zhì)量狀況，其中BC-2處理對酶活性的提升效果最優(yōu)。