大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中抗生素抗性基因分布特征及其影響因素

黃薇，劉洋，饒秋華，羅欽，王為剛，宋永康*，羅土炎*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350003；2.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350108；3.連江縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，福州 350500）

抗生素在醫(yī)療、畜禽養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖中都發(fā)揮著十分重要的作用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，抗生素被用于防治各種細(xì)菌性疾病，同時(shí)兼具促進(jìn)水生動(dòng)物生長(zhǎng)等功效[1]。為了提高養(yǎng)殖產(chǎn)量、降低養(yǎng)殖成本，抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中被長(zhǎng)期過度使用，這導(dǎo)致了水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)耐藥菌和抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）[2]的產(chǎn)生。ARGs于2006 年由Pruden 等[3]首次確認(rèn)為新型的環(huán)境污染物，由于可以通過水平基因轉(zhuǎn)移在環(huán)境和生物體內(nèi)長(zhǎng)久持續(xù)傳播，ARGs 的危害性相對(duì)于抗生素和耐藥菌更強(qiáng)，因此其被世界衛(wèi)生組織列為21 世紀(jì)人類醫(yī)療健康面臨的三大威脅之一[4]。

水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境被證明是ARGs 的潛在儲(chǔ)藏庫，ARGs 在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境（水體、沉積物）及水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象中普遍存在[5-7]。Hedberg 等[8]證實(shí)沿海水域的ARGs 主要來源于水產(chǎn)養(yǎng)殖。水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的ARGs可以通過食物鏈直接與人類腸道菌群進(jìn)行水平基因轉(zhuǎn)移傳播[9]。Yang 等[10]的研究顯示，海水養(yǎng)殖沉積物中的ARGs 序列與人體致病菌中的ARGs 序列高度相似。因此，隨著全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的ARGs 引起了更多的關(guān)注，尤其是沉積物。與水不同，沉積物中的ARGs 具有更穩(wěn)定、更持久的特點(diǎn)，其ARGs 賦存量顯著大于水，被認(rèn)為是ARGs 的“匯”[11]。Yuan 等[12]認(rèn)為隨著時(shí)間的推移，水中的ARGs 會(huì)在沉積物中不斷積累，沉積物很可能增強(qiáng)了抗生素抗性的傳播。

不同養(yǎng)殖區(qū)域、不同養(yǎng)殖對(duì)象以及不同養(yǎng)殖模式造成的ARGs賦存情況顯著不同[11]。大黃魚是我國(guó)養(yǎng)殖規(guī)模最大的海水魚，也是海區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖最主要的品種[13]，然而對(duì)大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物ARGs 賦存特征的研究尚未見報(bào)道。目前，ARGs 的檢測(cè)方法主要以PCR 技術(shù)為主，雖然很多研究人員已經(jīng)利用PCR 方法對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的ARGs 進(jìn)行了定量研究，且取得了一定成果，但對(duì)研究ARGs 的種類有限制，很難得到環(huán)境中微生物抗生素抗性基因組的全面且詳細(xì)的信息[14]。近年來，隨著高通量測(cè)序和功能基因組篩選技術(shù)的發(fā)展，宏基因組測(cè)序分析技術(shù)不再局限于PCR引物設(shè)計(jì)，可以為研究環(huán)境抗生素抗性基因組提供ARGs 的廣譜特征，從而全面客觀地反映環(huán)境中ARGs 的多樣性。因此，本文以大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物為研究對(duì)象，利用宏基因組測(cè)序分析技術(shù)調(diào)查大黃魚養(yǎng)殖海域內(nèi)ARGs 的污染狀況，并探討ARGs 與環(huán)境因子以及微生物群落結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性，揭示ARGs 在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的擴(kuò)散和傳播規(guī)律，以期為評(píng)價(jià)大黃魚養(yǎng)殖區(qū)域ARGs 的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和污染控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)及樣品采集

2022年1月選取6個(gè)大黃魚養(yǎng)殖密集區(qū)采集養(yǎng)殖魚排下的沉積物樣品，具體采樣點(diǎn)分布如圖1所示，采樣點(diǎn)信息見表1。每個(gè)采樣點(diǎn)選取3個(gè)不同的網(wǎng)箱（分別用A、B、C 表示），選取的網(wǎng)箱之間至少間隔一個(gè)網(wǎng)箱，在選取的網(wǎng)箱框架踏板上使用抓斗采泥器采集沉積物樣品，樣品采集后立即放入無菌的聚乙烯塑料袋中，放到低溫（冰?。├洳叵渲羞\(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

表1 樣本的基本信息Table 1 Basic information of the samples

圖1 采樣點(diǎn)分布示意圖Figure 1 Location of sampling sites

1.2 沉積物理化因子測(cè)定

樣品pH和電導(dǎo)率（含鹽量）通過出海采樣實(shí)時(shí)檢測(cè)得到，pH 使用便攜式pH 計(jì)（METTLER TOLEDO，瑞士）獲取，電導(dǎo)率通過便攜式電導(dǎo)率儀（METTLER TOLEDO，瑞士）測(cè)定。有機(jī)碳（TOC）采用重鉻酸鉀氧化-還原容量法測(cè)定，總氮（TN）采用凱氏滴定法測(cè)定，總磷（TP）采用分光光度法測(cè)定。

1.3 沉積物微生物DNA提取

使用PowerSoil DNA Isolation Kit 試劑盒（MOBIO，Carlsbad，CA，美國(guó)），參照試劑盒說明書進(jìn)行沉積物總基因組DNA 的提取，使用Qubit 2.0 Fluorometer（Invitrogen，Carlsbad，CA，美國(guó)）檢測(cè)DNA 樣品的濃度，然后將DNA 樣品放置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?6S rRNA 基因高通量測(cè)序樣品為每個(gè)采樣點(diǎn)的3 個(gè)平行沉積物樣品分別提取DNA，宏基因高通量測(cè)序樣品為每個(gè)采樣點(diǎn)的3 個(gè)平行沉積物樣品等質(zhì)量混合后提取DNA，最后共獲得18 個(gè)用于16S rRNA 基因高通量測(cè)序的基因組DNA 樣品和6 個(gè)宏基因組高通量測(cè)序的基因組DNA樣品。

1.4 16S rRNA基因高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析

16S rRNA基因高通量測(cè)序DNA樣品送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，于Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，16S rRNA 基因高通量測(cè)序擴(kuò)增16S rRNA 基因V3～V4 可變區(qū)，通用引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。Miseq 測(cè)序得到的原始序列首先根據(jù)overlap 關(guān)系進(jìn)行拼接，之后裁切序列中的正反向引物，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后按97%序列相似度進(jìn)行OTU 聚類分析劃分分類操作單元（OTUs），再運(yùn)用Ribosomal Database Project（RDP）classifier進(jìn)行物種注釋，得到每條序列從門到屬各個(gè)水平的分類信息，基于分類學(xué)信息，統(tǒng)計(jì)每個(gè)生物樣本的多樣性指數(shù)。

1.5 宏基因組高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析

宏基因組高通量測(cè)序DNA 樣品送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，于Illumina Hiseq 2500 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。Hiseq 測(cè)序得到的原始序列首先進(jìn)行質(zhì)控，剪切接頭序列、低質(zhì)量序列及含N堿基序列，然后利用Megahit 與Newbler 拼接軟件對(duì)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行拼接組裝，再使用MetaGene 軟件對(duì)拼接結(jié)果中的contigs進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)出的基因序列按相似度95%進(jìn)行聚類，每類取最長(zhǎng)的基因作為代表序列，構(gòu)建非冗余基因集；將數(shù)據(jù)上傳CARD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得基因?qū)?yīng)的ARGs功能注釋信息，包括基因名稱、抗生素抗性類型、耐藥機(jī)制以及基因如何與抗生素藥物有關(guān)的描述等；ARGs 的相對(duì)豐度使用百萬分率（10-6）表示，即在1 000 000 個(gè)質(zhì)控序列中有一個(gè)被標(biāo)注為ARG的序列。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 軟件計(jì)算數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析，方差分析采用LSD檢驗(yàn)，相關(guān)性分析選擇spearman算法。應(yīng)用R 語言vegan、gplots、venn diagram 和pheatmap 等軟件包繪制PCoA圖、柱狀圖、韋恩圖、熱圖和相關(guān)性熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中抗生素抗性基因分布特征

本研究從6 個(gè)沉積物底泥樣本中共獲得了80 604 948～94 023 130條（平均89 055 467條）宏基因組高通量測(cè)序質(zhì)量過濾序列，其中275 976～557 910條（0.32%～0.36%）序列被注釋為CARD 抗性基因序列（BLASTp，e-value≤10-5）。圖2 為豐度前50 的ARGs，OS1～OS6 位點(diǎn)豐度最高的ARG 均為macB（254.31 × 10-6～436.85 × 10-6），其次均為tetA（58）（131.64×10-6～241.69×10-6）、evgS（87.00×10-6～193.42×10-6）和bcrA（76.75×10-6～128.89×10-6），上述優(yōu)勢(shì)ARGs分別占ARGs序列總數(shù)的15.44%～16.48%，表明不同大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中的優(yōu)勢(shì)抗生素抗性基因種類基本一致。

圖2 大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中ARGs賦存特征Figure 2 Occurrence characteristics of ARGs in the different sediment samples from large yellow croaker culture area

根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，在大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物樣品中共識(shí)別出38 種抗生素抗性類型，781 個(gè)ARGs 亞型。圖3a為不同抗生素抗性類型ARGs的相對(duì)豐度，在大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中，ARGs 的主要抗生素抗性類型為四環(huán)素類（Tetracyclines，1 049.03×10-6～2 061.39×10-6）、大環(huán)內(nèi)酯類（Macrolides，999.59×10-6～1 946.88×10-6）和氟喹諾酮類（Fluoroquinolones，660.02×10-6～1 292.33×10-6）。圖3b 為不同耐藥機(jī)制的ARGs 占ARGs 序列總數(shù)的相對(duì)百分比情況，從結(jié)果中可以看出，不同大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物樣品中ARGs 引起細(xì)菌耐藥的機(jī)制基本一致，其中外排泵（Antibiotic efflux）是主要的耐藥機(jī)制，占ARGs 序列總數(shù)的62.63%～63.84%，其次為抗生素靶點(diǎn)改變（Antibiotic target alteration），占ARGs序列總數(shù)的18.76%～20.03%。

圖3 大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中ARGs的抗生素抗性類型和耐藥機(jī)制Figure 3 Antibiotic resistance types and resistance mechanisms of ARGs in different sediment samples from large yellow croaker culture area

2.2 大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物ARGs與環(huán)境因子之間的關(guān)系

2.2.1 大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中環(huán)境因子分布特征

大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中5 種環(huán)境因子的檢測(cè)結(jié)果見表2。6 個(gè)位點(diǎn)的大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物樣品的pH 和電導(dǎo)率相似，但TOC、TN 和TP 存在顯著差異（P＜0.05），TOC 范圍為0.48%（OS1）～0.59%（OS4），TN含量范圍為398（OS1）～563 mg·kg-1（OS6），TP 含量范圍為546（OS5）～777 mg·kg-1（OS1）。根據(jù)我國(guó)《海洋沉積物質(zhì)量》（GB 18668—2002），6 個(gè)位點(diǎn)的TOC 均超過第三類海洋沉積物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)加拿大安大略省環(huán)境和能源部1992 年制定的沉積物標(biāo)準(zhǔn)，OS6中TN 屬輕度污染，OS1、OS2、OS3 和OS6 中TP 為輕度污染。

表2 大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中環(huán)境因子分布特征（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=3）Table 2 Distribution characteristics of environment factors in different sediment samples from large yellow croaker culture area（Mean±SEM，n=3）

2.2.2 沉積物中環(huán)境因子與ARGs之間的相關(guān)性

為探究大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中環(huán)境因子對(duì)ARGs 分布特征的影響，使用相關(guān)性分析解析6 個(gè)位點(diǎn)大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中的5 種環(huán)境因子與豐度前20 的ARGs 之間的關(guān)系，結(jié)果見圖4。如圖4 所示，大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中，pH 與豐度前20 的ARGs均存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，TN 與豐度前20 的ARGs 均存在正相關(guān)關(guān)系，但除PNGM-1 與電導(dǎo)率和TN 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）外，其余ARGs 與所檢環(huán)境因子之間的相關(guān)性均不顯著（P＞0.05）。

圖4 大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中ARGs和環(huán)境因子的關(guān)系Figure 4 Correlation between ARGs and environmental factors in the sediment of large yellow croaker culture area

2.3 大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物ARGs與微生物群落的關(guān)系

2.3.1 大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

18 個(gè)大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物樣品Illumina MiSeq測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表3。從表3 可知，18 個(gè)沉積物樣品獲得的16S rRNA 序列數(shù)為56 007～66 002條，OTUs 為2 066～3 451，每個(gè)樣品的OUT 覆蓋率均大于96%，表明Illumina MiSeq 測(cè)序獲取的數(shù)據(jù)量能夠很好地反映特定樣品的細(xì)菌多樣性情況。Alpha多樣性分析結(jié)果表明，盡管OS2、OS3和OS4沉積物樣品的覆蓋率要顯著低于OS1、OS5 和OS6（P＜0.05），但是OS2、OS3 和OS4 的OTUs、ACE 指數(shù)和Chao 指數(shù)要顯著高于OS1、OS5 和OS6（P＜0.05），表明OS2、OS3 和OS4 樣品中的物種數(shù)要高于OS1、OS5 和OS6。此外，除OS1 的Shannon 指數(shù)外，各樣本的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)的差異不顯著（P＞0.05），說明各樣品間的物種豐度和多樣性差異不顯著。Beta 多樣性分析（PCoA 分析，圖5）結(jié)果表明，除OS3 和OS4 微生物組成結(jié)構(gòu)相似外，不同采樣點(diǎn)的微生物組成結(jié)構(gòu)存在明顯差異。

圖5 大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)PCoA分析Figure 5 Principal coordinates analysis（PCoA）of bacterial community compositions in the different sediment samples from large yellow croaker culture area

表3 Illumina MiSeq測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=3）Table 3 Statistical indexes calculated based on the Illumina MiSeq sequencing data（Mean±SEM，n=3）

通過構(gòu)建韋恩圖分析了不同大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物樣品中所共有的和特有的OTU 數(shù)目（圖6）。如圖6 所示，18 個(gè)大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物樣品共有1 059 個(gè)OTUs，統(tǒng)計(jì)分析表明，共有的OTUs 序列分別占樣品序列總數(shù)的13.68%～22.85%，特有OTUs 序列分別占樣品序列總數(shù)的0.26%～1.39%。從物種注釋結(jié)果來看，本研究共得到細(xì)菌59 個(gè)門（圖7a），981 個(gè)屬（圖7b）。對(duì)注釋結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，從門水平上看，除OS3 外，其余大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中豐度最高的細(xì)菌門均為Proteobacteria，其占樣品序列總數(shù)的21.36%±0.86%～44.19%±22.59%，OS3 豐度最高的細(xì)菌門為Desulfobacterota；其次，OS1、OS2 和OS6 為Bacteroidota（13.45% ± 6.97%、14.72% ± 1.57% 和15.82%±0.38%），OS5 為Acidobacteriota（11.22%±1.38%），OS4為Desulfobacterota（16.13%±0.87%），OS3為Proteobacteria（20.09%±0.67%）；對(duì)樣品中前20 的門的豐度進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果顯示這些門類的細(xì)菌在不同大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中均存在顯著差異（P＜0.05）。從屬水平上看，OS1 豐度最高的屬為Pseudoalteromonas，OS2、OS4 和OS5 豐度最高的屬為Woeseia，OS3豐度最高的屬g_no rank_o_Sva1033，OS6豐度最高的屬為g_no rank_f_unclassified。同時(shí)對(duì)樣品中前20 的屬的豐度進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果顯示 除g_no rank_o_Actinomarinales、Pseudoalteromonas不顯著（P＞0.05）外，其他屬類細(xì)菌在不同大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中均存在顯著差異（P＜0.05）。以上說明不同點(diǎn)位的大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物的細(xì)菌豐度組成存在明顯差異。

圖6 不同大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中共有和特有的OTUsFigure 6 Venn diagram displaying the number of shared and unique OTUs in the different sediment samples from large yellow croaker culture area

圖7 門水平下和屬水平下不同大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成Figure 7 Bacterial community compositions in the different sediment samples from large yellow croaker culture area at the phylum level and at the genus level

2.3.2 沉積物中細(xì)菌群落對(duì)ARGs分布特征的影響

在大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中，豐度前20 的細(xì)菌屬與豐度前20 的ARGs 之間的相關(guān)關(guān)系如圖8 所示。由圖8可知，除PNGM-1外，大部分ARGs之間呈顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01）。從微生物群落結(jié)構(gòu)與ARGs之間的關(guān)系來看，豐度前20的微生物菌屬中有8 種與ARGs 呈顯著或極顯著相關(guān)。其中，g_no rank_c_Subgroup_21 與豐度前20 種的15 種ARGs 呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01），涉及8 種抗生素抗性類型和2 種耐藥機(jī)制；unclassified_f_Flavobacteriaceae與13種ARGs呈顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01），涉及6 種抗生素抗性類型和2 種耐性機(jī)制；g_no rank_c_Thermodesulfovibrionia與8 種ARGs 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），涉及5 種抗生素抗性類型和1 種耐藥機(jī)制；g_no rank_f_Desulfocapsaceae與6 種ARGs 呈顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01），涉及2種抗生素抗性類型和2種耐藥機(jī)制；g_no rank_f_unclassified 與4 種ARGs 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），涉及3 種抗生素抗性類型和3 種耐藥機(jī)制；g_no rank_f_Anaerolineaceae與4種ARGs呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），涉及4 種抗生素抗性類型和1 種耐藥機(jī)制；g_no rank_o_Syntrophobacterales與2 種ARGs呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01），涉及2 種抗生素抗性類型和1 種耐藥機(jī)制；Woeseia與2 種ARGs 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），涉及1 種抗生素抗性類型和1種耐藥機(jī)制。從ARGs與微生物群落之間的關(guān)系來看，豐度前20 的ARGs 均與豐度前20 的菌屬有不同程度的顯著相關(guān)性，其中，macB、tetA（58）、evgS、bcrA、msbA、oleC、mtrA、novA、TaeA、rpoB2、PNGM-1、baeS、Staphylococcus mupA/mupirocin、MexW、vanRF和arlR分別與1種菌屬呈顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01），分別與1、3、3、3、1、3、3、4、1、1、0、2、1、1、1 種和0 種菌屬呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01）；Streptimyoes rishiriensis parYmutant/aminocoimarin、MexK、arlS和cpxA與2 種菌屬呈顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01），與0、0、1 種和2種菌屬呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）。

圖8 ARGs與微生物菌屬相關(guān)性分析Figure 8 Correlation analysis between ARGs and microbial genus

3 討論

本研究利用宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)首次對(duì)大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中ARGs 賦存特征進(jìn)行了分析。宏基因組高通量測(cè)序方法可以使檢出的ARGs 更加全面[9，15]。從測(cè)序分析結(jié)果可知，本研究在6 個(gè)大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中共檢測(cè)出781 個(gè)ARGs 亞型，其中有許多未曾在大黃魚養(yǎng)殖環(huán)境中報(bào)道，如fusH、QnrS7等。從ARGs 注釋結(jié)果來看，大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中ARGs 最主要的抗生素抗性類型為四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和氟喹諾酮類，而在多數(shù)以PCR 檢測(cè)方法研究抗性基因的報(bào)道中，磺胺類抗性基因被認(rèn)為是我國(guó)海水養(yǎng)殖場(chǎng)中常見的抗性基因，其豐度占環(huán)境總ARGs 的比例較高[5，16-17]，存在這種差異的原因可能與PCR 檢測(cè)目標(biāo)ARGs種類的局限性造成ARGs統(tǒng)計(jì)結(jié)果產(chǎn)生差異有關(guān)。在本研究中，大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中優(yōu)勢(shì)ARGs 的種類與已報(bào)道的珠江三角洲[18]、海南東寨港[19]、東海近海（杭州灣、象山灣和臺(tái)州灣）[20]等沉積物中的ARGs賦存特征存在明顯的差異。ARGs 的產(chǎn)生和環(huán)境殘留機(jī)制較為復(fù)雜，如抗生素是ARGs 發(fā)生和傳播的主要應(yīng)激源，但抗生素與其相應(yīng)的ARGs 也并非總是同時(shí)出現(xiàn)，使用單一類型的抗生素也可能出現(xiàn)復(fù)雜的ARGs 污染[21-22]。近年來的研究表明，水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境ARGs 與養(yǎng)殖動(dòng)物腸道菌群特征、環(huán)境因子、養(yǎng)殖藥物和飼料以及養(yǎng)殖模式等諸多因素均有密切聯(lián)系[23-25]。目前，有關(guān)大黃魚養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 污染情況的研究尚處在初期階段，ARGs 污染特征的時(shí)空分布特征以及影響因子還有待進(jìn)一步深入研究。同時(shí)在本研究中，大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中優(yōu)勢(shì)ARGs 的豐度為76.75×10-6～436.85×10-6，這比相同算法的對(duì)蝦養(yǎng)殖沉積物的豐度大得多[26]。明確ARGs耐藥機(jī)制對(duì)防止或延緩耐藥性的產(chǎn)生具有重要意義[27]。本研究結(jié)果顯示大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中ARGs主要的耐藥機(jī)制為外排泵，這與杭州灣、我國(guó)沿海水域沉積物樣品中ARGs 的主要耐藥機(jī)制一致[28-29]。研究表明，抑制外排系統(tǒng)中外排泵蛋白的表達(dá)量可以降低細(xì)菌對(duì)藥物的外排作用，減緩耐藥性的產(chǎn)生[30]。

環(huán)境因素可能會(huì)驅(qū)動(dòng)和增強(qiáng)ARGs 在環(huán)境中的傳播[31]。本研究測(cè)定了所取大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物樣品中的5 種環(huán)境因子，探究了其分布規(guī)律，并解析了這5 種環(huán)境因子與ARGs 之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中的TOC、TN 和TP 的含量較高，存在污染情況。TOC、TN 和TP 代表養(yǎng)殖環(huán)境中的污染狀況[11]，側(cè)面反映出漁業(yè)養(yǎng)殖是近海環(huán)境質(zhì)量惡化的主要原因之一。對(duì)所檢環(huán)境因子與ARGs 進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)除PNGM-1 與電導(dǎo)率和TN 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）外，其余ARGs 均與環(huán)境因子之間相關(guān)性不顯著（P＞0.05），這一結(jié)果與陳嘉瑜[20]的研究結(jié)果相似，但與Guo 等[31]的研究結(jié)果存在差異。水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的理化因子復(fù)雜多變，除所檢的5 種環(huán)境因子外，還包括溫度、化學(xué)耗氧量、溶解氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和重金屬等多種環(huán)境因子，且這些因子與氣候條件、飼料組分、投餌量和吸收率等都有較密切的關(guān)系[11]?？紤]到環(huán)境因子的復(fù)雜性，在自然條件下確定哪種因素決定了ARGs 的賦存特征很難，未來需要擴(kuò)大環(huán)境因子的檢測(cè)種類，增加樣品數(shù)量，構(gòu)建綜合模型來更好地研究ARGs在環(huán)境介質(zhì)中的行為。

ARGs 與細(xì)菌群落之間存在著連鎖效應(yīng)、協(xié)同選擇和進(jìn)化的關(guān)系[32-33]。本文利用16S rRNA 基因高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同位置的大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示不同采樣點(diǎn)的微生物組成結(jié)構(gòu)存在明顯差異，其中OS2、OS3和OS4樣品中的微生物種類要顯著高于OS1、OS5 和OS6（P＜0.05）。進(jìn)一步將6 個(gè)位點(diǎn)的大黃魚養(yǎng)殖海域的水深（表1）與沉積物細(xì)菌群落Alpha 多樣性指數(shù)（表3）進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示物種總數(shù)指數(shù)（OTUs、ACE指數(shù)和Chao 指數(shù)）均與水深呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01 或P＜0.05），說明海水深度越深，微生物種類越少[34]。盡管不同采樣位置大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中的菌群結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)菌群存在顯著差異（P＜0.05），但是不同海域沉積物中的ARGs基因類型基本一致。這個(gè)結(jié)果表明即使在不同地理位置上，同一養(yǎng)殖品種和同一養(yǎng)殖模式的海水養(yǎng)殖沉積物中ARGs的賦存狀況也較相似，這也從側(cè)面反映出海水養(yǎng)殖沉積物ARGs 的主要來源為水產(chǎn)養(yǎng)殖。這個(gè)結(jié)果與Hedberg 等[8]的研究結(jié)果一致。

ARGs 在不同種類的細(xì)菌群落之間遷移、轉(zhuǎn)化和傳播，使其在環(huán)境中持續(xù)殘留，這比抗生素自身的殘留對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害更大[35]。因此，對(duì)大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中ARGs 和微生物群落之間進(jìn)行相關(guān)性分析至關(guān)重要。本研究的結(jié)果顯示，豐度前20 的微生物菌屬中有3 種菌屬與ARGs 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），5 種菌屬與ARGs 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。徐秋鴻等[36]認(rèn)為當(dāng)微生物與目的ARGs 呈顯著正相關(guān)時(shí)，這些微生物可能是ARGs 的潛在宿主；當(dāng)微生物與目的ARGs 呈顯著負(fù)相關(guān)時(shí)，這些微生物可能會(huì)影響ARGs 的水平轉(zhuǎn)移。在本研究中，盡管有些菌屬在沉積物樣品中的相對(duì)豐度較低，但其卻與多種ARGs存在顯著相關(guān)性，說明在研究微生物與ARGs 的關(guān)系時(shí)，應(yīng)盡可能擴(kuò)大研究范圍。此外，部分菌屬與多種抗生素抗性類型ARGs 顯著相關(guān)涉及多種耐藥機(jī)制，而有些菌屬僅與1 種抗生素抗性類型ARGs 顯著相關(guān)，表明部分微生物可能是多種ARGs 的共同潛在宿主，這種存在也可能對(duì)ARGs 的分布特征和水平轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性[37]。而少數(shù)ARGs 與2 種菌屬之間呈顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01），顯示這些ARGs 可能有多個(gè)潛在的微生物宿主[38]。不同微生物攜帶ARGs 的偏好不同[36]，后續(xù)研究也應(yīng)積極探索ARGs 對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境微生物之間轉(zhuǎn)移的機(jī)理，為通過控制相關(guān)菌屬豐度來消減ARGs提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

（1）利用宏基因組高通量測(cè)序方法能夠獲得更加全面的ARGs 信息。在大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中，共檢測(cè)出38種抗生素抗性類型，781個(gè)ARGs亞型，豐度最高的ARG 為macB（254.31×10-6～436.85×10-6），其次為tetA（58）（131.64×10-6～241.69×10-6）、evgS（87.00×10-6～193.42×10-6）和bcrA（76.75×10-6～128.89×10-6），不同站點(diǎn)沉積物中的優(yōu)勢(shì)ARGs 種類基本一致，主要的ARGs 抗生素抗性類型為四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和氟喹諾酮類，主要的ARGs耐藥機(jī)制為外排泵。

（2）對(duì)大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物中的pH、電導(dǎo)率、TOC、TN和TP進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物已受到污染；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，除PNGM-1與電導(dǎo)率和TN 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）外，其余ARGs均與環(huán)境因子之間相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。

（3）Proteobacteria 是各大黃魚養(yǎng)殖海域沉積物樣品中豐度最高的細(xì)菌門，但各站點(diǎn)沉積物中的微生物組成結(jié)構(gòu)存在明顯差異，且微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)環(huán)境ARGs 的產(chǎn)生和分布具有顯著影響，豐度前20 的微生物菌屬中有8 種與ARGs 呈顯著或極顯著相關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01），豐度前20 的ARGs 均與豐度前20 的菌屬呈顯著或極顯著相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）。