基于特征圖譜結(jié)合效毒值與外觀性狀的蜜馬兜鈴炮制工藝研究

鐘文峰, 洪婉敏,劉曉霞,紀(jì)玉華,王文麗,汪凱東,孫冬梅

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 佛山 528244)

馬兜鈴為馬兜鈴科植物北馬兜鈴Aristolochiacontorta Bge.或馬兜鈴AristolochiadebilisSieb.et Zucc.的干燥成熟果實(shí),其生品及炮制品蜜馬兜鈴均收載于2015年版《中國藥典》,而2020年版《中國藥典》并未收載。馬兜鈴藥材市場流通較少,以東北產(chǎn)的北馬兜鈴貨源較多,目前學(xué)者研究也多集中在北馬兜鈴這一基原上。今北馬兜鈴主要分布于黑龍江、河南、河北等地,其味苦,性微寒,具有清肺降氣,止咳平喘,清腸消痔的功效,常用于肺熱咳喘,痰中帶血,腸熱痔血,痔瘡腫痛等癥[1]。研究表明,馬兜鈴中含有的馬兜鈴酸類物質(zhì),是一類具有強(qiáng)烈致癌性和腎毒性的硝基菲羧酸[2],其經(jīng)肝臟代謝后仍會在體內(nèi)長期蓄積,具有嚴(yán)重的腎臟毒性[3-4]。這可能是2020年版《中國藥典》不再收載的原因之一,但蜜馬兜鈴在臨床仍有一定應(yīng)用。

中醫(yī)傳統(tǒng)理論認(rèn)為,部分毒性中藥材經(jīng)炮制后,可達(dá)到“減毒存效”的目的,如甘遂中的萜類成分在醋制過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化,使毒性下降,但藥效得以保留[5]。楊標(biāo)等[6]亦發(fā)現(xiàn)馬兜鈴經(jīng)蜜炙、醋炙、鹽炙、姜炙、炒焦、堿炙、先堿炙再醋炙等方法炮制后,馬兜鈴酸類物質(zhì)的含量均較生品有所降低,但未對整個(gè)炮制過程中毒性成分的變化規(guī)律進(jìn)行深入研究?；诖?本研究擬以毒性成分含量降低、有效成分含量提高、飲片外觀性狀符合標(biāo)準(zhǔn)要求為前提,通過建立蜜馬兜鈴的特征圖譜,測定飲片粉末色度值,分析毒性成分在炮制過程中的變化規(guī)律,結(jié)合外觀性狀與內(nèi)在效毒值對蜜馬兜鈴飲片進(jìn)行綜合評價(jià),優(yōu)選蜜馬兜鈴炮制工藝,以期為毒性飲片的炮制減毒研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters ACQUITY ARC 高效液相色譜儀(ARC,沃特世公司),Waters XBridge Phenyl色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),萬分之一天平(ME204E,梅特勒-托利多公司),百萬分之一天平(XP26,梅特勒-托利多公司),恒溫水浴鍋(HWS28,上海一恒科技有限公司),超純水機(jī)(Milli-Q Direct,默克公司),數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DE,昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

木蘭花堿(批號:wqk17063003,純度:98.0%)、馬兜鈴酸D(批號:wqk19011704,純度:98.0%)、馬兜鈴酸B(批號:wqk18051806,純度:97.0%)、馬兜鈴酸內(nèi)酰胺Ⅰ(批號:wqk19012101,純度:98.0%)對照品均購自四川維克奇生物科技有限公司;馬兜鈴酸Ⅰ(110746-201611,純度:98.89%)對照品購自中國食品藥品檢定研究院;7-羥基馬兜鈴酸A(批號:Z13N9574959,純度:95.0%)對照品購自上海源葉生物科技有限公司。分析純甲醇、乙醇均購自西隴科學(xué)股份有限公司;色譜級乙腈購自默克公司;冰醋酸、三乙胺均購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;水為自制超純水。

17批馬兜鈴藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定均為馬兜鈴科植物北馬兜鈴AristolochiacontortaBge的干燥成熟果實(shí)。根據(jù)2015年版《中國藥典》蜜馬兜鈴(北馬兜鈴)炮制項(xiàng)下方法[1],將17批馬兜鈴(北馬兜鈴)藥材,搓碎,置炒制容器內(nèi),照蜜炙法(通則0213)炒至不粘手,即得17批對應(yīng)的蜜馬兜鈴炮制品。馬兜鈴藥材來源與炮制品批號詳見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

XBridge Pheny1色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-1%冰醋酸溶液(加入0.16%三乙胺溶液)(B),梯度洗脫:0～15 min,10%～24%A;15～20 min,24%～28%A;20～40 min,28%～35%A;40～45 min,35%～37%A;45～55 min,37%～50%A;55～56 min,50%～10%A;56～65 min,10%A;檢測波長:254 nm;柱溫:35 ℃;流速:1.0 mL·min-1。

2.2 對照品溶液的制備

稱取木蘭花堿對照品2.130 mg、馬兜鈴酸D對照品2.064 mg、馬兜鈴酸B對照品2.122 mg、馬兜鈴酸Ⅰ對照品2.066 mg、馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ對照品2.032 mg、7-羥基馬兜鈴酸A對照品2.088 mg,置100 mL容量瓶中,加甲醇制成含木蘭花堿20.874 0 μg·mL-1、馬兜鈴酸D 20.227 2 μg·mL-1、馬兜鈴酸B 20.583 4 μg·mL-1、馬兜鈴酸Ⅰ 20.430 7 μg·mL-1、馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ 19.913 6 μg·mL-1、7-羥基馬兜鈴酸A 19.836 0 μg·mL-1的混合溶液,作為對照品參照物溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取蜜馬兜鈴飲片(MMDL15)的粉末(過4號篩)約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,加熱回流30 min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,用0.22 μm的微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,以6號色譜峰(馬兜鈴酸D)作為參照峰(S),計(jì)算峰1～9與S峰的相對保留時(shí)間、相對峰面積。各共有峰的相對保留時(shí)間RSD<0.1%,相對峰面積RSD<3.94%,表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 依次進(jìn)樣,以6號色譜峰(馬兜鈴酸D)作為參照峰(S),計(jì)算峰1～9與S峰的相對保留時(shí)間、相對峰面積。各共有峰的相對保留時(shí)間RSD<0.10%,除峰9(馬兜鈴酸內(nèi)酰胺Ⅰ)相對峰面積RSD為7.89%外,其余相對峰面積的RSD<4.32%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好,其中馬兜鈴酸內(nèi)酰胺Ⅰ隨著放置時(shí)間的延長,相對峰面積略微增加,但是特征圖譜整體輪廓不變。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品6份,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,以6號色譜峰(馬兜鈴酸D)作為參照峰(S),計(jì)算峰1～9與S峰的相對保留時(shí)間、相對峰面積,各共有峰的相對保留時(shí)間RSD<0.10%,相對峰面積RSD<5.22%,表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.4 蜜馬兜鈴多批次飲片相似度評價(jià)及色譜峰指認(rèn) 使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件(2012,130723)版本》進(jìn)行共有峰匹配,以MMDL01的色譜圖為參照圖譜,將時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1 min,采用中位數(shù)法,采用多點(diǎn)校正法-全譜峰進(jìn)行匹配,疊加圖見圖1,對照特征圖譜見圖2。17批次的蜜馬兜鈴飲片共有10個(gè)特征峰,以MMDL01作為參照峰,計(jì)算相似度,結(jié)果顯示MMDL01～MMDL17的相似度依次為 1.000、0.977、0.994、0.936、0.913、0.939、0.997、0.983、0.908、0.894、0.882、0.912、0.901、0.909、0.976、0.991、0.960;采用對照品色譜峰共指認(rèn)了其中6個(gè)色譜峰,分別是峰2(木蘭花堿)、峰5(7-羥基馬兜鈴酸A)、峰6(馬兜鈴酸D)、峰8(馬兜鈴酸B)、峰9(馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ)、峰10(馬兜鈴酸Ⅰ)。詳見圖2。

注:2.木蘭花堿;5.7-羥基馬兜鈴酸A; 6.馬兜鈴酸D(S); 8.馬兜鈴酸B;9.馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ;10.馬兜鈴酸Ⅰ圖1 蜜馬兜鈴多批次炮制品特征圖譜疊加圖Fig.1 The overlayed characteristic spectrum of multi batch of processe of Aristolochia Contorta Bge.

注:A.蜜馬兜鈴飲片對照特征圖譜;B.混合對照品特征圖譜；2.木蘭花堿;5.7-羥基馬兜鈴酸A;6.馬兜鈴酸D(S);8.馬兜鈴酸B;9.馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ;10.馬兜鈴酸Ⅰ圖2 蜜馬兜鈴飲片對照特征圖譜與特征峰指認(rèn)Fig.2 Comparative characteristic spectrum and identification of characteristic peaks of Aristolochia Contorta Bge.

2.5 蜜馬兜鈴前處理炮制參數(shù)考察

參考2015年版《中國藥典》蜜馬兜鈴炮制項(xiàng)下的要求“取凈馬兜鈴,搓碎,照蜜炙法(通則0213)炒至不粘手?！泵壑朔?通則0213)規(guī)定“蜜炙時(shí),應(yīng)先將煉蜜加適量沸水稀釋后,加入待炮炙品中拌勻,悶透,置炒制容器內(nèi),用文火炒至規(guī)定程度時(shí),取出,放涼。”[1]根據(jù)以上規(guī)定,對蜜馬兜鈴炮制蜜用量、煉蜜稀釋倍數(shù)、潤制時(shí)間和炒制時(shí)間進(jìn)行考察,初步確定蜜馬兜鈴的炮制工藝參數(shù)。

2.5.1 蜜馬兜鈴蜜用量考察 取馬兜鈴藥材20 g,平行4份,搓碎,加稀釋后的煉蜜(煉蜜用量為0、2.5、5、10 g,加煉蜜用量3倍的沸水稀釋)拌勻,潤制,烘干。取樣測定,各特征峰峰面積結(jié)果如圖3所示。

圖3 蜜馬兜鈴不同蜜用量各特征峰面積柱形圖Fig.3 Column chart of characteristic peak area about honey dosage of the processing of Aristolochia Contorta Bge.

隨著蜜用量的增加,蜜馬兜鈴中10個(gè)特征峰的峰面積均呈現(xiàn)下降趨勢。其中,蜜馬兜鈴中5種馬兜鈴酸毒性成分的總峰面積隨著蜜用量的增加依次減少,相比于蜜用量為0的樣品,煉蜜用量為2.5、5、10 g時(shí),5種馬兜鈴酸毒性成分的總峰面積變化率分別為-6.09%、-16.46%、-27.86%,其余5個(gè)色譜峰總峰面積變化率為-1.92%、-7.23%、-22.73%。蜜用量為0、2.5、5、10 g，蜜制烘干后的蜜馬兜鈴飲片質(zhì)量分別為19.17、20.19、22.37、25.34 g,折算為每1 g飲片對應(yīng)的峰面積后,較生品下降了4.57%、12.09%、24.38%,推測蜜用量在樣品毒性成分的峰面積中主要起到物理稀釋的作用,實(shí)際上飲片峰面積的減少非化學(xué)反應(yīng)引起,因此仍以藥典規(guī)定蜜用量為宜。最終確定蜜馬兜鈴按藥典的蜜用量,即每100 kg待炮炙品用煉蜜25 kg。

2.5.2 蜜馬兜鈴煉蜜稀釋倍數(shù)考察 取煉蜜5 g,平行4份,分別加入0、5、15、30 g的沸水稀釋;另取馬兜鈴藥材20 g,平行4份,搓碎,潤制,烘干。取樣測定,各特征峰峰面積結(jié)果如圖4所示。

圖4 蜜馬兜鈴不同蜜稀釋倍數(shù)各特征峰面積柱形圖Fig.4 Column chart of characteristic peak area about honey diluted of the processing of Aristolochia Contorta Bge.

當(dāng)沸水加入量為蜜用量的1、3倍時(shí),蜜馬兜鈴中10個(gè)特征峰的峰面積整體變化趨勢較小,相比于煉蜜未稀釋的樣品,蜜馬兜鈴中5種馬兜鈴酸毒性成分的總峰面積的變化率分別為-8.16%、-5.98%,其余5個(gè)色譜峰總峰面積變化率為2.30%、1.83%;但當(dāng)沸水加入量為蜜用量的6倍時(shí),此時(shí)藥材已呈現(xiàn)“傷水”狀態(tài),稀釋用量過大,未能吸收完全,5種馬兜鈴酸毒性成分的總峰面積的變化率為-29.15%,其余5個(gè)色譜峰總峰面積變化比率為-3.48%。因此,優(yōu)選加入煉蜜用量3倍的沸水進(jìn)行稀釋。

2.5.3 蜜馬兜鈴潤制時(shí)間考察 取馬兜鈴藥材20 g,平行4份,搓碎,加入煉蜜拌勻,分別潤制0、60、120、180 min,烘干。取樣測定,各特征峰峰面積結(jié)果如圖5所示。

圖5 蜜馬兜鈴不同潤制時(shí)間各特征峰面積柱形圖Fig.5 Column chart of characteristic peak area about humid time of the processing of Aristolochia Contorta Bge.

隨著潤制時(shí)間的延長,蜜馬兜鈴中10個(gè)特征峰的峰面積均呈現(xiàn)下降的趨勢。與未潤制樣品相比,潤制60、120、180 min后,蜜馬兜鈴中5種馬兜鈴酸毒性成分的總峰面積的變化率分別為-3.55%、-5.52%、-7.96%,其余5個(gè)色譜峰總峰面積的變化率為-0.91%、-6.13%、-2.12%。因此,優(yōu)選蜜馬兜鈴的潤制時(shí)間為60 min。

2.5.4 蜜馬兜鈴炒制功率和炒制時(shí)間預(yù)實(shí)驗(yàn)考察 取馬兜鈴藥材50 g,搓碎,加入稀釋后的煉蜜(煉蜜用量12.5 g,加37.5 g沸水稀釋)拌勻,潤制60 min后,采用電陶爐(功率為800、1 000 W)進(jìn)行炒制,分別于炒制8、11、14、17、20 min時(shí)取樣測定,如圖6所示。

圖6 蜜馬兜鈴不同炒制功率和時(shí)間各特征峰面積柱形圖Fig.6 Column Chart of characteristic peak area about different processing power and time of Aristolochia Contorta Bge.

隨著炒制時(shí)間的延長,蜜馬兜鈴中10個(gè)特征峰的峰面積均呈現(xiàn)下降的趨勢。與生品相比,功率為800 W炒制8、11、14、17 min后,蜜馬兜鈴5種馬兜鈴酸毒性成分的總峰面積的變化率分別為-12.41%、-16.02%、-25.32%、-41.52%,其余5個(gè)色譜峰總峰面積的變化率為-8.44%、-10.12%、-15.38%、-29.29%。與生品相比,功率為1 000 W炒制8、11、14、17 min后,蜜馬兜鈴5種馬兜鈴酸毒性成分的總峰面積的變化率分別為-17.45%、-19.75%、-47.45%、-63.16%,其余5個(gè)色譜峰總峰面積的變化率為-7.12%、-14.21%、-33.62%、-44.60%。

綜上確定了蜜馬兜鈴炮制的蜜用量為每100 kg待炮炙品用煉蜜25 kg,煉蜜加入3倍沸水稀釋,潤制時(shí)間為60 min,炮制的功率越大,蜜馬兜鈴炮制變化程度越劇烈,且炮制通則規(guī)定文火炮制,因此選用800 W炮制適宜。由于預(yù)實(shí)驗(yàn)炮制過程中取樣點(diǎn)數(shù)較少,未能全面掌握蜜馬兜鈴炮制過程的成分及外觀性狀等變化規(guī)律,優(yōu)選炮制工藝,因此炒制時(shí)間在后文中會進(jìn)一步結(jié)合其他因素進(jìn)行詳細(xì)研究。

2.6 蜜馬兜鈴炮制過程特征圖譜的變化規(guī)律

2.6.1 蜜馬兜鈴炮制過程樣品制備 取馬兜鈴藥材(MDL15)4 kg,搓碎,加入稀釋后的煉蜜(煉蜜用量1 kg,加3 kg沸水稀釋)拌勻,潤制60 min后投入炒藥機(jī)(溫度設(shè)置為200 ℃,與預(yù)實(shí)驗(yàn)800 W功率的飲片出鍋溫度基本一致)進(jìn)行炒制,分別于炒制9、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37 min取樣,即得14份蜜馬兜鈴樣品,記為MZ02～MZ15,見表2,其中MZ01為馬兜鈴生品。

表2 蜜馬兜鈴飲片炮制過程取樣信息表Table 2 Sample information table of the processing ofAristolochia Contorta Bge.

2.6.2 蜜馬兜鈴炮制過程樣品相似度評價(jià) 使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件(2012,130723)》進(jìn)行共有峰匹配,以MZ01的色譜圖為參照圖譜,將時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1 min,采用中位數(shù)法,采用多點(diǎn)校正法-全譜峰進(jìn)行匹配,見圖7。計(jì)算MZ02～MZ15樣品與生品(MZ01)特征圖譜的相似度,分別為0.996、0.999、0.996、0.987、0.979、0.966、0.966、0.962、0.961、0.960、0.960、0.961、0.959、0.956。表明隨著炒制時(shí)間的延長,炮制品與生品的相似度逐漸降低。

注:2.木蘭花堿;5.7-羥基馬兜鈴酸A; 6.馬兜鈴酸D; 8.馬兜鈴酸B;9.馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ;10.馬兜鈴酸Ⅰ圖7 蜜馬兜鈴炮制過程樣品特征圖譜疊加圖Fig.7 The overlayed characteristic spectrum of multi batch of the processing of Aristolochia Contorta Bge.

2.6.3 蜜馬兜鈴炮制過程樣品特征峰峰面積變化規(guī)律 進(jìn)一步對炮制過程中樣品的10個(gè)特征峰峰面積的變化規(guī)律進(jìn)行分析,以生品各特征峰的峰面積作為基準(zhǔn),計(jì)算炮制過程樣品各特征峰與生品相對應(yīng)的特征峰峰面積的比值,結(jié)果見表3,5個(gè)馬兜鈴酸類成分的總峰面積,隨著炮制時(shí)間的延長,呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。表明延長炮制時(shí)間,有利于減輕蜜馬兜鈴的毒性。

表3 蜜馬兜鈴炮制過程樣品特征峰峰面積相對生品比值結(jié)果Table 3 Results of ratio of characteristic peak area of the processing of Aristolochia Contorta Bge.

2.7 蜜馬兜鈴炮制過程樣品外觀色度值與模式識別研究

按參考文獻(xiàn)[7]對炮制過程中的15個(gè)樣品粉末的色度值進(jìn)行測定,并將蜜馬兜鈴的表觀指標(biāo)色度值[明度值(L*)、紅綠色值(a*)、黃藍(lán)色值(b*)]以及水分值導(dǎo)入Simca 14.1進(jìn)行主成分分析(PCA)和聚類分析(HCA)。

表4 蜜馬兜鈴炮制過程樣品色度值與水分值Table 4 Chromatic value and moisture value of the processing of Aristolochia Contorta Bge.

圖8 蜜馬兜鈴炮制過程樣品粉末圖Fig.8 Sample powder chart of the processing ofAristolochia Contorta Bge.

2.7.2 蜜馬兜鈴炮制過程樣品PCA及HCA 結(jié)果如圖9～10所示。由PCA和HCA均可將蜜馬兜鈴炮制過程的樣品大致分為5類:第1類為無變化期(近生品階段),即為MZ01～MZ02(炒制0、9 min);第2類為蜜炙前期(近炒黃),即為MZ03～MZ06(炒制13、15、17、19 min);第3類為蜜炙中后期(炒黃),即為MZ07～MZ10(炒制21、23、25、27 min);第4類為炒焦前期(介于炒黃和炒焦之間),即為MZ11 ～ MZ13(炒制 29、31 min);第 5 類為炒焦中后期 (炒焦),即為 MZ14～ MZ15(炒制33、35、37 min)。

圖9 蜜馬兜鈴炮制過程樣品PCA得分圖Fig.9 PCA score chart of the processing ofAristolochia Contorta Bge.

圖10 蜜馬兜鈴炮制過程樣品聚類譜系圖Fig.10 Cluster pedigree chart of the processing ofAristolochia Contorta Bge.

2.8 蜜馬兜鈴炮制過程樣品外觀性狀與效毒成分綜合評價(jià)

2.8.1 蜜馬兜鈴炮制過程樣品(果皮與種子)外觀評分 根據(jù)以上聚類結(jié)果的分類,將生品與14批隔點(diǎn)取樣的蜜馬兜鈴飲片的果皮與種子進(jìn)行區(qū)分,如圖11所示。分別對炮制品的不同部位外觀性狀進(jìn)行評分,并按果皮∶種子(5∶6)質(zhì)量比例進(jìn)行飲片的總評分。

圖11 蜜馬兜鈴炮制過程樣品Fig.11 Processing samples of Aristolochia Contorta Bge.

評分標(biāo)準(zhǔn):本研究采用“德爾菲法”對各樣品從顏色、質(zhì)地、氣味三者對不同部位進(jìn)行綜合評分,相較傳統(tǒng)主觀評價(jià),可最大程度降低感官差異造成的評分誤差。顏色以黃棕色,顏色較亮為佳,滿分40分;質(zhì)地以輕脆為佳,滿分30分;氣味以“氣味減弱,味微苦”為佳,滿分30分。綜合評分=(果皮顏色+果皮質(zhì)地+果皮氣味)×5/(5+6)+(種仁顏色+種仁質(zhì)地+種仁氣味)×6/(5+6),評分結(jié)果見表5。

表5 蜜馬兜鈴炮制過程樣品飲片評分表Table 5 The sample score of the processing of Aristolochia Contorta Bge.

2.8.2 蜜馬兜鈴炮制過程樣品內(nèi)在效毒成分評分 參考張定堃等[9]對附子品質(zhì)綜合指數(shù)中效毒值的定義,進(jìn)一步對蜜馬兜鈴炮制過程樣品的化學(xué)成分進(jìn)行分析,其中以木蘭花堿作為有效成分,以5個(gè)馬兜鈴酸類的成分作為毒性成分,分別計(jì)算木蘭花堿峰面積與5個(gè)馬兜鈴酸類成分峰面積的效毒值,結(jié)果見表6。效毒比值越大,反映蜜馬兜鈴藥效更強(qiáng),毒性更弱,用藥安全性更高,品質(zhì)更優(yōu),故以5個(gè)毒性成分中效毒值的最大值作為內(nèi)在質(zhì)量的最優(yōu)值,評分記為100,5個(gè)毒性成分中效毒值非最大值的則按照“炒制時(shí)間樣品各成分的效毒值/效毒值的最大值”計(jì)算得相應(yīng)的評分,如表6所示。結(jié)果表明木蘭花堿/7-羥基馬兜鈴酸A的效毒值在35 min最大,木蘭花堿/馬兜鈴酸D的效毒值在37 min最大,木蘭花堿/馬兜鈴酸B的效毒值在35 min最大,木蘭花堿/馬兜鈴內(nèi)酰胺的效毒值在29 min最大,木蘭花堿/馬兜鈴內(nèi)酰胺的效毒值在31 min最大,即不同毒性成分毒性最弱的炮制時(shí)間存在一定的差異。

表6 蜜馬兜鈴炮制過程樣品5個(gè)毒性成分的效毒值及評分Table 6 Toxicity value and score of five toxic componentsof the processing of Aristolochia Contorta Bge.

2.8.3 蜜馬兜鈴炮制過程樣品外觀與內(nèi)在質(zhì)量綜合評價(jià) 以蜜馬兜鈴炮制過程樣品的外觀性狀得分與內(nèi)在效毒成分的得分按照比例1∶1進(jìn)行綜合得分分析,其中5個(gè)內(nèi)在質(zhì)量成分按照比例1∶1∶1∶1∶1的比例,按公式外觀與內(nèi)在質(zhì)量綜合得分=藥材外觀綜合評分×50%+木蘭花堿/7-羥基馬兜鈴酸A效毒值評分×10%+木蘭花堿/馬兜鈴酸D效毒值評分×10%+木蘭花堿/馬兜鈴酸B效毒值評分×10%+木蘭花堿/馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ效毒值評分×10%+木蘭花堿/馬兜鈴酸Ⅰ效毒值評分×10%計(jì)算,所得結(jié)果及排名如下。由表7可知,蜜馬兜鈴以炮制23 min的綜合得分最高,表明此時(shí)炮制的外觀以及內(nèi)在的質(zhì)量均達(dá)到最優(yōu)。炮制綜合得分排名前5依次為:炮制23 min、炮制27 min、炮制21 min、炮制19 min及炮制25 min。在實(shí)際操作過程中難實(shí)現(xiàn)精確的時(shí)間控制,結(jié)合綜合得分排名,蜜馬兜鈴炮制工藝研究確定炮制時(shí)間為23～27 min。

表7 蜜馬兜鈴炮制過程樣品外觀與內(nèi)在質(zhì)量綜合得分與排序Table 7 Comprehensive score and ranking of appearance and internal quality of the processing of Aristolochia Contorta Bge.

3 討論

3.1 特征圖譜前考察

蜜馬兜鈴特征圖譜選取甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇作為提取溶劑,結(jié)果顯示70%甲醇、70%乙醇、50%乙醇作為提取溶劑時(shí)“總峰面積/稱樣量”較大,其中70%甲醇對蜜馬兜鈴特征圖譜峰1～4的提取效率最高,色譜峰整體響應(yīng)較為均衡;對比加熱回流與超聲2種不同的提取方式,結(jié)果顯示加熱回流提取效率高于超聲處理;對比提取時(shí)間(15、30、45 min)對蜜馬兜鈴特征圖譜影響,結(jié)果顯示加熱回流30 min對10個(gè)特征成分的提取已較為完全。

3.2 蜜馬兜鈴及炮制過程樣品特征圖譜

17批次的蜜馬兜鈴飲片共有10個(gè)特征峰,指認(rèn)了5個(gè)毒性的馬兜鈴酸類成分和1個(gè)非毒性成分木蘭花堿,17批次炮制品的相似度>0.88,特征圖譜的相似度高,表明不同批次蜜馬兜鈴化學(xué)成分基本一致,不同批次間的穩(wěn)定性較好。炮制前處理研究發(fā)現(xiàn)蜜用量對毒性成分的影響由稀釋引起,加蜜用量1、3倍沸水稀釋,減毒效果較小,加蜜用量6倍沸水稀釋，毒性成分下降比例較大,但藥材“傷水”嚴(yán)重。藥材潤制60 min后毒性成分基本不再減少,且已完全潤透。故確定蜜馬兜鈴潤制時(shí)采用的前處理確定蜜用量為每100 kg待炮炙品用煉蜜25 kg,煉蜜加入蜜用量的3倍的沸水稀釋,潤制時(shí)間為60 min。采用不同功率炮制時(shí)發(fā)現(xiàn),功率較大者炮制減毒的效果越明顯,但非毒性成分也下降迅速,且飲片容易炒焦,不利于生產(chǎn)控制。進(jìn)一步采用炒藥機(jī)對炒制時(shí)間進(jìn)行研究,以生品為參照時(shí),14個(gè)炮制品相似度依次降低。隨著炮制時(shí)間的延長,炮制過程樣品10個(gè)特征峰的峰面積整體呈現(xiàn)下降的趨勢,與生品相比,5個(gè)毒性成分明顯下降,其余成分下降趨勢相對穩(wěn)定,即蜜炙時(shí)間越長,越利于減輕馬兜鈴的毒性。

3.3 蜜馬兜鈴炮制過程外觀、效毒成分研究及綜合評價(jià)

僅從特征圖譜峰面積上進(jìn)行工藝的篩選較為片面,本文進(jìn)一步對蜜馬兜鈴炮制過程樣品粉末的色度值進(jìn)行測定分析,炮制21 min后,飲片粉末色差為5.92，可被肉眼識別,有利于區(qū)分不同炮制階段。隨著炮制時(shí)間的延長,L*、b*呈現(xiàn)下降趨勢,表明隨著時(shí)間延長，顏色特征加深逐漸明顯。結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析手段將蜜馬兜鈴炮制過程的樣品分為5類,從外觀性狀上看,以第3類(炮制21～27 min)飲片炮制程度為宜。且以此為參照,對炮制過程飲片的不同部位(果皮、種仁)的外觀性狀進(jìn)行評分,結(jié)合炮制過程樣品化學(xué)成分的效毒性質(zhì),確定炮制23～27 min的蜜馬兜鈴?fù)庥^性狀和內(nèi)在質(zhì)量較為理想。

含有馬兜鈴酸類成分的中藥材眾多,如關(guān)木通、廣防己、青木香、天仙藤、馬兜鈴、細(xì)辛、魚腥草等。藥物的毒性是相對而言的,在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下,大量有毒藥物合理使用可做到安全有效,規(guī)范的炮制方法能夠大幅降低使用含馬兜鈴酸類中藥的臨床風(fēng)險(xiǎn),保證蜜馬兜鈴臨床用藥的安全性和有效性。目前部分地方炮制規(guī)范依舊保留了蜜馬兜鈴的飲片應(yīng)用,亟待系統(tǒng)開展蜜馬兜鈴飲片炮制研究,闡明炮制“減毒增效”的科學(xué)內(nèi)涵。本研究建立了相應(yīng)的特征圖譜,計(jì)算有效成分木蘭花堿與5個(gè)馬兜鈴酸類的毒性成分的效毒值,結(jié)合飲片外觀性狀和內(nèi)在效毒成分質(zhì)量進(jìn)行綜合評價(jià),確定了蜜馬兜鈴最佳的炮制工藝,可為毒性中藥飲片的炮制減毒研究提供參考。