基于數(shù)據(jù)挖掘與藥效篩選的中醫(yī)藥干預(yù)抗結(jié)核藥物所致肝損傷核心方藥研究

施錚,王璐瑤,韋英杰,汪晶,魯晏武,潘揚(yáng),余黎,虞舜

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥文獻(xiàn)研究所,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院·養(yǎng)生康復(fù)學(xué)院,江蘇 南京 210023;3.江蘇省中醫(yī)藥研究院,江蘇 南京 210028;4.寧波市中醫(yī)院皮膚科,浙江 寧波 315010;5.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023)

結(jié)核病至今仍是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]?？菇Y(jié)核化學(xué)療法是干預(yù)結(jié)核病的有效手段,但多數(shù)一線化療藥物都有潛在肝毒性,易產(chǎn)生抗結(jié)核藥物肝損傷(Antituberculosis drug-induced liver injury,ATDILI)[2],最終導(dǎo)致化療中斷,甚則治療失敗。中醫(yī)藥療法干預(yù)ATDILI具有明顯優(yōu)勢(shì),自20世紀(jì)90年代以來(lái),臨床報(bào)道多,但治法各異,令人莫衷一是,急需運(yùn)用新方法、新思路進(jìn)行系統(tǒng)整理與挖掘[3]。本文擬將數(shù)據(jù)挖掘與藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合,分析中醫(yī)藥干預(yù)ATDILI的用藥規(guī)律,篩選核心方藥。

1 數(shù)據(jù)挖掘

1.1 資料與方法

1.1.1 處方來(lái)源 搜索中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(CBM)、讀秀、維普、PubMed、Web of Science等數(shù)據(jù)庫(kù),收集中醫(yī)藥干預(yù)ATDILI的臨床報(bào)道、學(xué)術(shù)專(zhuān)著。檢索時(shí)限均從建庫(kù)至2020年6月15日。由2名研究者獨(dú)立篩選文獻(xiàn)、評(píng)價(jià)方法學(xué)質(zhì)量,提取數(shù)據(jù),并交叉核對(duì),若遇分歧,則討論或咨詢第3名研究者判定,缺乏的信息盡量與作者聯(lián)系予以補(bǔ)全。檢索式與檢索流程見(jiàn)圖1。共篩選出118篇文獻(xiàn)，其中一些報(bào)道對(duì)不同證型采用不同方劑辨證施治，共342首中醫(yī)藥干預(yù)ATDILI的方劑。

1.1.2 數(shù)據(jù)整理與錄入 將342首方劑,參照《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)藥名進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化處理,冷背異名如“南嶺蕘花”,則參考《中華本草》轉(zhuǎn)化為“了哥王”,系統(tǒng)整理清洗后錄入,統(tǒng)一藥物的別名、異名,完成錄入后,再交專(zhuān)人校對(duì)。

1.1.3 數(shù)據(jù)分析 方劑數(shù)據(jù)挖掘運(yùn)用中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)(V2.5),對(duì)用藥頻次進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì);基于關(guān)聯(lián)規(guī)則挖掘本研究的藥物配伍規(guī)律。

1.2 結(jié)果

1.2.1 用藥頻次 342首處方,涉及藥物229種,總頻次3 835次,按降序排列,可得到頻次在25以上的藥物41味,見(jiàn)表1。

表1 高頻藥物Table 1 High frequency drugs

1.2.2 關(guān)聯(lián)規(guī)則 設(shè)置支持度個(gè)數(shù)為88,置信度為0.8,將藥對(duì)降序排序,得到頻次≥88的藥對(duì),共有17條,涉及中藥11味,見(jiàn)表2。共得到關(guān)聯(lián)規(guī)則11條,見(jiàn)表3,網(wǎng)絡(luò)圖展示見(jiàn)圖2。設(shè)置支持度個(gè)數(shù)為122,置信度為0.8,降序排列,得到頻次≥122的藥對(duì),共有4條,涉及中藥5味,網(wǎng)絡(luò)圖展示見(jiàn)圖3。將圖3獲得的高頻、高置信度的5味中藥組合視為本研究的核心方，與頻次最高的前8味單藥，納入下一步藥效篩選研究。

表2 支持度個(gè)數(shù)88條件下藥對(duì)組合Table 2 Drug pairs in the support degree number of 88

表3 常用藥物規(guī)則分析Table 3 Analysis of common drug rules

圖2 支持度個(gè)數(shù)為88時(shí)藥物關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of drug associations in the support degree number of 88

圖3 支持度個(gè)數(shù)為122時(shí)藥物關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of drug associations in the support degree number of 122

2 藥效篩選

2.1 材料與方法

2.1.1 儀器 體式顯微鏡(SMZ-800N,日本NIKON公司);熒光顯微鏡(Leica DMI 3000B,德國(guó)Leica公司);分析天平(MT5,瑞士METTLER TOLEDO公司);生化培養(yǎng)箱(SPX-80,寧波海曙賽褔實(shí)驗(yàn)儀器廠);氮吹儀(N-EVAP-11,美國(guó)Organomation公司)。

2.1.2 藥品與試劑 異煙肼(INH,美國(guó)Sigma-Aldrich公司,批號(hào):MKCJ5583);甘草酸二銨注射液(DG,10 mL∶50 mg,正大天晴藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):191219104);醋柴胡(BupleurumchinenseDC.,安徽省金芙蓉中藥飲片公司,批號(hào):02-19060101)、茯苓[Poriacocos(Schw.) Wolf.,安徽存真中藥飲片有限公司,批號(hào):200301]、炒白芍(PaeonialactifloraPall.,安徽省金芙蓉中藥飲片公司,批號(hào):01-19080101)、茵陳(ArtemisiacapillarisThunb.,安徽嘉佑中藥飲片有限公司,批號(hào):20200401)、炙甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.,江蘇華洪藥業(yè)科技有限公司,批號(hào):200526)、丹參(SalviamiltiorrhizaBge.,安徽存真中藥飲片有限公司,批號(hào):200602)、郁金(CurcumawenyujinY. H. Chen et C. Ling,安徽存真中藥飲片有限公司,批號(hào):200301)、炒白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.,安徽存真中藥飲片有限公司,批號(hào):191102),均購(gòu)買(mǎi)于南京南中醫(yī)大國(guó)醫(yī)堂門(mén)診部,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定。斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)基:5 mmol·L-1NaCl、0.17 mmol·L-1KCl、0.33 mmol·L-1CaCl2、0.33 mmol·L-1MgSO4。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Tuebingen品系斑馬魚(yú)、CZ320[ihb175Tg,Tg(-1.7apoa2:GFP)]品系肝臟特異性熒光標(biāo)記斑馬魚(yú),均為4～6月齡,購(gòu)買(mǎi)于南京堯順禹生物科技有限公司。

2.1.4 核心方藥提取物的制備 取核心方藥:高頻藥物8種(柴胡、茯苓、白芍、茵陳、炙甘草、丹參、郁金、白術(shù))、核心方1種(柴胡、茯苓、白芍、炙甘草、茵陳，1∶1∶1∶1∶1)各20 g,分別第1次加入10倍體積純凈水煎煮1 h,將液體過(guò)濾后倒出,第2次加入10倍體積純凈水煎煮1 h,將液體過(guò)濾后倒出。合并2次濾液,加純水至400 mL(合生藥量50 mg·mL-1),取20 mg生藥量藥液吹干備用,臨用前用培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋,分別配制不同濃度的供試液。

2.1.5 斑馬魚(yú)幼魚(yú)的收集處理方法 斑馬魚(yú)的養(yǎng)殖參照Z(yǔ)ebrafish Book[4]。Tuebingen品系斑馬魚(yú)雌雄分開(kāi)飼養(yǎng),定時(shí)喂以孵化的豐年蝦卵,飼養(yǎng)條件按照光照14 h/黑暗10 h,水溫28 ℃的循環(huán)水系統(tǒng)。于收集魚(yú)卵前1日16:00按雌雄比1∶1挑選健康性成熟的斑馬魚(yú)放入產(chǎn)卵缸中,次日9:00—10:00收集受精卵。將受精卵挑選、清洗后移入胚胎培養(yǎng)用水中培養(yǎng),并滴入亞甲基藍(lán)消毒。在受精卵發(fā)育至72 hpf,得到3 dpf幼魚(yú),挑選發(fā)育正常的幼魚(yú),移入24孔板中,每孔8尾,同一濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。將3 dpf幼魚(yú)暴露在不同濃度的供試液中,每孔2 mL溶液。連續(xù)給藥3 d,每天換液。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。CZ320品系斑馬魚(yú)復(fù)篩,每孔3尾幼魚(yú),設(shè)3個(gè)重復(fù)孔,其余與Tuebingen品系相同。

2.1.6 核心方藥干預(yù)斑馬魚(yú)ATDILI模型的藥效觀察 設(shè)置空白對(duì)照組(胚胎培養(yǎng)基)、模型組(INH 8 mmol·L-1)、陽(yáng)性藥物組(INH與DG4、20、100、500 μg·mL-1聯(lián)合給藥)以及INH與待篩選核心方藥(高頻藥物8種,核心方1種,見(jiàn)“2.1.4”)水提液50、100、200、400、800 μg·mL-1聯(lián)合給藥組,共51組,每組72尾幼魚(yú),在給藥72 hpe記錄Tuebingen斑馬魚(yú)死亡數(shù)和畸形數(shù),計(jì)算死亡率和畸形率。在體視顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)的形態(tài)變化情況。選用死亡率最低，且死亡率相同時(shí)畸形率最低的濃度組，使用CZ320品系斑馬魚(yú)驗(yàn)證初篩結(jié)果,每組27尾幼魚(yú),在熒光顯微鏡下觀察肝臟形態(tài)變化情況。

2.1.7 數(shù)據(jù)分析 使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn);計(jì)量資料在滿足正態(tài)分布和方差齊性的前提條件下,進(jìn)行組間方差分析,組間比較采用Tukey's檢驗(yàn),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 結(jié)果

2.2.1 核心方藥對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)ATDILI模型死亡率、畸形率的影響 與空白對(duì)照組相比,ATDILI模型組的死亡率、畸形率均顯著上升(P<0.01);與模型組相比,隨著給藥濃度的增加,待篩選藥物死亡率、畸形率均顯著下降(P<0.05，P<0.01),至高濃度時(shí)(400～800 μg·mL-1)，死亡率、畸形率又有所上升，見(jiàn)表4～5。

表4 核心方藥對(duì)斑馬魚(yú)ATDILI模型死亡率的影響Table 4 Effects of core prescriptions and drugs on mortality in zebrafish ATDILI models

表5 核心方藥對(duì)斑馬魚(yú)ATDILI模型畸形率的影響Table 5 Effect of core prescriptions and drugs on malformation rate in zebrafish ATDILI models

(續(xù)表)

2.2.2 核心方藥對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)形態(tài)學(xué)變化的影響 與空白對(duì)照組相比,模型組出現(xiàn)魚(yú)鰾缺失或減小、卵黃囊吸收延滯、脊柱彎曲、心包水腫;與模型組相比,隨著給藥濃度增加(100～200 μg·mL-1),多數(shù)待篩選藥物組形態(tài)學(xué)變化均有不同程度改善,至高濃度時(shí)(400～800 μg·mL-1)惡化。見(jiàn)圖4。

注：Control.空白對(duì)照組；INH.INH 8 mmol·L-1;DG和中藥水提物濃度單位為μg·mL-1；黑色箭頭指示心包水腫;紅色箭頭指示魚(yú)鰾缺失或減小;黃色箭頭指示卵黃囊吸收延滯;藍(lán)色箭頭指示脊柱彎曲。圖4 斑馬魚(yú)幼魚(yú)形態(tài)圖Fig.4 Morphological diagram of zebrafish larval

2.2.3 核心方藥對(duì)CZ320品系斑馬魚(yú)ATDILI模型的影響 與空白對(duì)照組相比,模型組的斑馬魚(yú)肝臟熒光面積顯著下降,熒光光密度顯著降低(P<0.01)。與模型組相比,待篩選藥物組的斑馬魚(yú)肝臟熒光面積顯著上升,熒光光密度顯著增強(qiáng)(P<0.01)。見(jiàn)圖5。

注：Control.空白對(duì)照組；INH.INH 8 mmol·L-1圖5 72 hpe斑馬魚(yú)幼魚(yú)的肝臟熒光情況比較Fig.5 Comparison of liver fluorescence of 72 hpe juvenile zebrafish

3 討論

3.1 用藥分類(lèi)

根據(jù)用藥頻次統(tǒng)計(jì)，本研究中補(bǔ)虛藥(共1 115次,29.07%)、清熱藥(共634次,16.53%)、利水滲濕藥(共524次,13.66%)位居前3位,單味藥以柴胡頻次最高,體現(xiàn)了補(bǔ)虛、清熱、利濕是治療ATDILI的最常用治法。余下排序?yàn)榛钛鏊?、疏肝藥、理氣藥、化痰止咳平喘藥等。①補(bǔ)虛藥:ATDILI多因稟賦虛弱,感染癆蟲(chóng)在先,加之化療療程長(zhǎng),藥毒侵襲,損傷肝脾,久病入腎,以致脾肺氣虛、肝腎陰虛,故以補(bǔ)氣藥(共564次,14.71%)補(bǔ)脾肺之氣,扶正祛邪；以補(bǔ)血藥(共321次,8.37%)補(bǔ)血養(yǎng)血以柔肝斂陰；以補(bǔ)陰藥(共215次,5.61%)補(bǔ)養(yǎng)因癆蟲(chóng)受損之肺陰、因藥毒受損之胃陰及肝腎之陰。②清熱藥:清熱藥占第2位,化療藥物藥毒侵肝,絡(luò)脈瘀阻,氣火失調(diào),以致濕熱內(nèi)生,瘀血內(nèi)阻,以藥毒、濕熱、氣滯、血瘀為標(biāo),故以清熱涼血藥(共221次,5.76%)清熱涼血,活血散瘀,除肝經(jīng)瘀熱;以清熱解毒藥(共169次,4.41%)清熱解毒兼利濕;以清熱燥濕藥(共130次,3.39%)清熱燥濕,瀉肝火,解肝毒。③利水滲濕藥:以利濕退黃藥(共267次,6.96%)最多,入肝膽經(jīng),清利濕熱,利膽退黃,使?jié)駸岬们?黃疸得除;以利水退腫藥(共238次,6.21%)利水滲濕,健脾瀉熱。

3.2 常用藥對(duì)分析

常用藥對(duì)降序排列,柴胡為核心,見(jiàn)表2。①柴胡-白芍頻次最高,其源于《傷寒論》之四逆散,肝為剛臟,體陰用陽(yáng),柴胡疏肝解郁、白芍柔肝養(yǎng)血,二者并用,為調(diào)肝的基本藥對(duì)。②柴胡-茯苓排第2位,其源于《圣濟(jì)總錄》之柴胡茯苓湯,為疏肝健脾之常用藥對(duì)。藥毒傷肝,肝病傳脾的病機(jī)特點(diǎn)在本研究中十分突出,柴胡-茯苓即為此而設(shè)。③柴胡-炙甘草排第3位,其源于《傷寒論》之小柴胡湯,柴胡疏肝,甘草緩肝急、解肝毒、補(bǔ)脾氣,該藥對(duì)疏肝理氣,解毒緩中,使脾氣充,肝氣調(diào),氣滯消,瘀熱散。高頻組合主要可以分為:疏肝-補(bǔ)虛(如柴胡-白芍)、疏肝-利水滲濕(如柴胡-茵陳)、疏肝-活血化瘀(如柴胡-郁金)、補(bǔ)虛-補(bǔ)虛(如炙甘草-白芍)、疏肝-清熱(如柴胡-赤芍),體現(xiàn)了補(bǔ)虛、清熱、利濕的治法下,重用柴胡的用藥特點(diǎn)。

3.3 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

為了探尋本研究用藥共性,參考已有報(bào)道[5],不同參數(shù)提取數(shù)據(jù)的預(yù)讀與臨床實(shí)際,將支持度個(gè)數(shù)設(shè)為88、122,置信度設(shè)為0.8。①支持度個(gè)數(shù)為88時(shí)(占總方藥25%),以柴胡為中心,常與補(bǔ)虛藥(炙甘草、白芍、白術(shù))、清熱藥(赤芍、黃芩)、利水滲濕藥(茯苓、茵陳)、活血化瘀藥(郁金、丹參)、收澀藥(五味子)等合用。②支持度個(gè)數(shù)為122時(shí)(占總方藥35.7%),柴胡、茯苓、白芍、炙甘草、茵陳,是本研究最核心用藥組合,可看作核心方。此方為《太平惠民和劑局方》“逍遙散”加減方,在逍遙散的基礎(chǔ)上,去當(dāng)歸、薄荷、生姜,加茵陳。柴胡疏肝理氣;茯苓利水滲濕,健脾和胃;白芍養(yǎng)血柔肝;炙甘草益氣解毒,調(diào)和諸藥;茵陳蒿清熱利濕。全方共奏疏肝健脾,清利濕熱之功。適用于肝郁脾虛兼內(nèi)生濕熱者,暗合前文補(bǔ)虛、清熱、利濕,注重肝脾同治的治法。由于本研究的處方來(lái)源很多沒(méi)有記載明確劑量,為便于研究,綜合藥典劑量、本研究納入的有劑量數(shù)據(jù)的臨床報(bào)道,將比例定為柴胡、茯苓、白芍、炙甘草、茵陳1∶1∶1∶1∶1。

綜上,根據(jù)數(shù)據(jù)挖掘,推測(cè)ATDILI的病因病機(jī)應(yīng)為:癆病在先,化療后藥毒傷肝,病位主要在肝、脾,病久必累及腎。本虛標(biāo)實(shí),以藥毒、濕熱、氣滯、血瘀為標(biāo),以肝、脾、肺、腎氣血虧虛為本。ATDILI的治療以補(bǔ)虛、清熱、利濕為總原則,注重肝脾同治。以疏肝解郁,健脾養(yǎng)血,清利濕熱為基本治法,兼顧活血化瘀、理氣化痰、止咳平喘。

3.4 核心方藥的藥效驗(yàn)證篩選

斑馬魚(yú)產(chǎn)卵多、繁殖快、胚胎透明，與人類(lèi)基因有87%同源性[6]。在毒性篩選中,斑馬魚(yú)與傳統(tǒng)模型相比，既有相似的神經(jīng)、血管、代謝系統(tǒng),又有相似的活性代謝產(chǎn)物,并且實(shí)驗(yàn)周期短、成本低、用藥量少,更符合倫理[7]。斑馬魚(yú)模型可以高效地對(duì)數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果進(jìn)行高通量篩選驗(yàn)證。斑馬魚(yú)適用于中藥保肝研究已經(jīng)得到反復(fù)驗(yàn)證[8],并廣泛用于ATDILI研究[9-10]。斑馬魚(yú)受精卵16 hpf發(fā)育出肝細(xì)胞前體,50 hpf形成肝臟并易于識(shí)別,60～72 hpf肝臟生長(zhǎng)到適當(dāng)大小,故肝毒性篩選多采用3 dpf的斑馬魚(yú)作為評(píng)價(jià)模型[10]。綜合有關(guān)文獻(xiàn)[9,11]與預(yù)實(shí)驗(yàn),本研究采用8 mmol·L-1INH給藥72 hpe建立斑馬魚(yú)ATDILI模型,結(jié)果顯示,柴胡、茯苓、白芍、茵陳、炙甘草、丹參、郁金、白術(shù)以及核心方隨著給藥濃度增加,ATDILI模型斑馬魚(yú)幼魚(yú)的畸形率、死亡率均顯著下降(P<0.05)。至高濃度時(shí),畸形率、死亡率又有上升。形態(tài)學(xué)上各藥物干預(yù)組均發(fā)育好于模型組。與模型組相比,待篩選藥物組的斑馬魚(yú)肝臟熒光面積顯著上升(P<0.01),熒光光密度顯著增強(qiáng)(P<0.01)。本研究基于數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)得到的核心方藥,在斑馬魚(yú)模型上均顯示出一定的保肝作用。且核心方組的畸形率、熒光面積均優(yōu)于陽(yáng)性藥DG與各單味藥,體現(xiàn)了核心方的保肝優(yōu)勢(shì),其具備作為新藥開(kāi)發(fā)的潛力。而在單味中藥的篩選中,茵陳、白芍、丹參、白術(shù)組畸形率、熒光面積均優(yōu)于陽(yáng)性藥組,顯示對(duì)ATDILI具有較強(qiáng)的保肝作用,下一步可以繼續(xù)篩選這些單味中藥中的活性單體保肝成分。數(shù)據(jù)挖掘具有低成本、高通量的優(yōu)勢(shì),本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果又在一定程度上驗(yàn)證了數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的可靠性與適用性。

本研究的ATDILI藥效篩選模型也存在一定的局限:①斑馬魚(yú)在基因、生物學(xué)特征上與哺乳動(dòng)物仍存在一定差異性,其不一定能夠完全反映藥物在人類(lèi)體內(nèi)代謝的真實(shí)情況。②ATDILI模型僅適用于篩選在培養(yǎng)基中溶解度較高的藥物,本研究曾經(jīng)試圖建立INH-利福平聯(lián)用ATDILI模型,但由于利福平溶解度低而失敗,目前同類(lèi)研究均存在這一不足[10]。因此筆者在未來(lái)的研究中會(huì)專(zhuān)注于:①使用經(jīng)典的哺乳動(dòng)物模型對(duì)斑馬魚(yú)模型篩選的核心方藥藥效進(jìn)行驗(yàn)證[12-13]。②繼續(xù)改進(jìn)斑馬魚(yú)ATDILI模型。③納入更多數(shù)據(jù)挖掘出的高頻藥物、藥對(duì)、新方在斑馬魚(yú)ATDILI模型進(jìn)行篩選驗(yàn)證。④結(jié)合中藥化學(xué)技術(shù)與生物學(xué)技術(shù),發(fā)掘核心方藥的活性成分,同時(shí)探索作用機(jī)制。