HS-SPME-GC-MS結(jié)合化學(xué)計(jì)量法分析刺五加不同部位的揮發(fā)性成分

何嘉偉,江漢美,黃振陽,曾格格,戴全武,劉天琪,韓蔓

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)湖北省藥用植物研發(fā)中心,湖北 武漢 430065)

刺五加為五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harms的干燥根和根莖或莖,性溫,味辛、微苦,歸脾、腎、心經(jīng)[1],為東北地區(qū)道地藥材,同時被收入國家衛(wèi)健委頒布的藥食同源目錄中,可作為保健食品的原料使用[2]。刺五加具有益氣健脾,補(bǔ)腎安神,強(qiáng)健筋骨的功效,現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗腫瘤、抗疲勞、保肝、降血糖等藥理作用[3-4]。隨著人們對刺五加的藥效和應(yīng)用研究深入,其已被開發(fā)為多種藥品及保健品[5]。

2020年版《中國藥典》將刺五加的根和根莖或莖收錄其中[1],但其非常規(guī)藥用部位如皮、葉、果也皆可入藥,且被證實(shí)具有多種藥理作用:刺五加皮、果具有抗癌、抗衰老、抗炎等作用,葉具有安神、降低血糖等作用[6-8]。目前對刺五加的研究多集中在其根部及多糖類、苷類(如紫丁香苷)、黃酮類等成分[9],對其揮發(fā)性成分的研究較少,皮、葉、果等非常規(guī)藥用部位還需進(jìn)一步地研究及開發(fā)利用。將刺五加不同部位中揮發(fā)性成分進(jìn)行系統(tǒng)性地檢測及比較分析,對拓展刺五加的藥用部位及全面評價刺五加的藥效和保健作用具有重要意義。

頂空固相微萃取(Headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)技術(shù)操作簡單、費(fèi)用低廉且減少了煎煮過程中造成的揮發(fā)性成分流失,能較真實(shí)地反映樣品中揮發(fā)性成分組成,現(xiàn)已應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等多個領(lǐng)域[10]。因此,本研究采用HS-SPME-GC-MS法,對刺五加不同部位的揮發(fā)性成分進(jìn)行測定,通過主成分分析(Principal component analysis,PCA)和聚類分析(Hierarchical cluster analysis,HCA)進(jìn)行比較,分析研究不同部位間揮發(fā)性成分的差異,為刺五加資源的深入開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

刺五加藥材(批號:20200302)購于百色市生物藥品有限公司,經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)楊紅兵教授鑒定為五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harms。后經(jīng)加工分別得到刺五加不同藥用部位:根(AS-R)、皮(AS-V)、莖(AS-S)、葉(AS-L)、果(AS-F)。

1.2 儀器

C-MAG HS-4型手動固相微萃取進(jìn)樣裝置,德國IKA公司;ThermoFisher Trace 1310型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國ThermoFisher公司;TG-1701 MS毛細(xì)管柱;頂空瓶(15 mL);65 μm聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯萃取纖維頭,美國Supelco公司;ALC-210.2型電子天平,北京賽多利斯天平有限公司。

1.3 樣品制備

將刺五加各部位樣品分別用粉碎機(jī)打成粉末并過16目篩,取出備用。

1.4 分析方法

1.4.1 GC條件 色譜柱:HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣:高純度氦氣(99.999%);流速:0.8 mL·min-1;進(jìn)樣口溫度:230 ℃;程序升溫:從50 ℃開始,以10 ℃·min-1升溫至230 ℃。

1.4.2 MS條件 EI源;離子源溫度230 ℃,電離電壓70 eV;四極桿溫度150 ℃;掃描質(zhì)量范圍m/z40～600。

1.5 HS-SPME條件的優(yōu)化

1.5.1 取樣量的優(yōu)化 精密稱取刺五加根粗粉0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g,在60 ℃下平衡10 min,選用65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭萃取15 min,按“1.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定,以色譜出峰總面積為主要指標(biāo),以質(zhì)譜鑒定出的化合物種類數(shù)為輔助指標(biāo),對樣品取樣量進(jìn)行優(yōu)化。

1.5.2 萃取溫度的優(yōu)化 精密稱取刺五加根粗粉0.8 g,其他條件不變,分別在40、60、80、100、120 ℃條件下對混合樣品進(jìn)行萃取,按“1.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定和分析。

1.5.3 萃取時間的優(yōu)化 精密稱取刺五加根粗粉0.8 g,在100 ℃下加熱平衡10 min,其他條件不變,選用65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭分別萃取10、15、20、25、30 min,按“1.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定和分析。

1.5.4 解析時間的優(yōu)化 精密稱取刺五加根粗粉0.8 g,在100 ℃下加熱平衡10 min,選用65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭萃取15 min,取出,立即插入色譜儀進(jìn)樣口,分別解析1、2、3、4、5 min,按“1.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定和分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對刺五加各部位的揮發(fā)性成分及其含量進(jìn)行PCA及HCA。

2 結(jié)果

2.1 HS-SPME條件優(yōu)化結(jié)果

考察結(jié)果見圖1,當(dāng)取樣量為0.8 g、萃取溫度為100 ℃、萃取時間為15 min、解析時間為3 min時分別有最佳的吸附效果。最終確定HS-SPME最佳條件為:精密稱取刺五加根粗粉0.8 g,置于15 mL頂空瓶中,插入裝有65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭的手動進(jìn)樣器,在100 ℃下加熱平衡10 min,再壓縮手柄伸出萃取頭萃取15 min,取出,立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口解析3 min。刺五加其他4個部位的實(shí)驗(yàn)條件同上。

圖1 各因素對刺五加揮發(fā)性成分萃取效果的影響Fig.1 Effect of various factors on the extraction effect of volatile components of Acanthopanax senticosus

2.2 刺五加不同部位的揮發(fā)性成分分析

采用HS-SPME-GC-MS法對刺五加各部位樣品揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測分析,用峰面積歸一化法從各總離子流圖中計(jì)算各組分相對含量,利用 NIST.14標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索色譜圖中存在的可能化合物,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析,并結(jié)合相對保留時間,初步鑒定出了78 種化合物,化學(xué)成分分析結(jié)果見表1,刺五加不同部位揮發(fā)性成分的總離子流圖見圖2。

表1 刺五加不同部位的揮發(fā)性成分及相對含量Table 1 Volatile components and relative contents in different parts of Acanthopanax senticosus

(續(xù)表一)

(續(xù)表二)

(續(xù)表三)

注:A.根;B.皮;C.莖;D.葉;E.果圖2 刺五加不同部位揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagram of volatile components in different parts of Acanthopanax senticosu

由表1及圖2中可知,從刺五加5個部位中共鑒定出揮發(fā)性成分167種。其中從根中分離出76個峰,并鑒定出71種成分;從皮中分離出70個峰,并鑒定出61種成分;從莖中分離出70個峰,并鑒定出59種成分;從葉中分離出59個峰,并鑒定出48種成分;從果中分離出63個峰,并鑒定出54種成分。各部位所鑒定出的成分總量分別占總揮發(fā)性成分的97.34%、96.31%、93.67%、95.99%、96.01%。

表1中的揮發(fā)性成分可分為烷類、烯類、醇類、酮類、芳香族類等化合物,刺五加各部位揮發(fā)性成分組成存在差異(表2、圖3),烯類、醇類、芳香族類化合物是5個部位主要的主要成分;皮、莖、葉、果中烯類和醇類化合物相對含量總和(79.59%、76.20%、75.45%、81.93%)顯著高于根(31.5%);根中芳香族類化合物相對含量(24.73%)要顯著高于其他4個部位，且以茴香腦為主(21.08%);同時根和果中醚類、有機(jī)酸類化合物相對含量之和(11.91%、6.25%)要高于其他3個部位;另外皮、莖、葉中檢測出部分氧化物類化合物(7.78%、2.63%、1.57%)。

表2 刺五加不同部位揮發(fā)性成分的種類及相對含量(%)Table 2 Types and relative contents of volatile components in different parts of Acanthopanax senticosus(%)

注:AS-R.根;AS-V.皮;AS-S.莖;AS-L.葉;AS-F.果圖3 刺五加不同部位揮發(fā)性成分種類差異圖Fig.3 Differences in the types of volatile components indifferent parts of Acanthopanax senticosus

2.3 刺五加不同部位的揮發(fā)性成分中共有成分和特有成分分析

刺五加根、皮、莖、葉、果中共有的揮發(fā)性成分有10種(圖4),包括萜品油烯、萜品烯、4-烯丙基苯甲醚、(-)-α-蒎烯、β-石竹烯、E-β-合金歡烯、α-律草烯、β-杜松烯、桉油烯醇、石竹素。其不同部位共有成分的相對含量存在較大差異,其中β-石竹烯在各部位中含量都較高;果中萜品油烯(8.13%)、E-β-金合歡烯(13.74%)含量均高于其他4個部位;莖中β-杜松烯(9.57%)含量顯著高于其他部位;皮和葉中桉油烯醇(6.03%、5.81%)含量高于其他3個部位。

注:AS-R.根;AS-V.皮;AS-S.莖;AS-L.葉;AS-F.果圖4 刺五加不同部位揮發(fā)性成分Venn圖Fig.4 Venn map of volatile components in differentparts of Acanthopanax senticosus

刺五加根中特有成分有45種,占其揮發(fā)性成分總量的57.16%,主要以酯類與芳香族化合物為主,包括E-藁本內(nèi)酯(2.39%)、川芎內(nèi)酯(1%)、茴香腦(21.08%)等。刺五加皮中特有成分有21種,占其揮發(fā)性成分總量的16.54%,包括紅沒藥醇氧化物(7.62%)、(-)-愈創(chuàng)醇(1.56%)等。刺五加莖中特有成分有13種,占其揮發(fā)性成分總量的5.99%,包括正十四烷(1.08%)、T-杜松醇(0.69%)等。刺五加葉中特有成分有10種,占其揮發(fā)性成分總量的5.48%,主要以酮類化合物為主(4.09%),包括胡椒酮(1.63%)、β-紫羅蘭酮(1.05%)等。刺五加果中特有成分有14種,占其揮發(fā)性成分總量的9.57%,主要特有成分有(+)-香橙烯(2.01%)、反式-α-香柑油烯(0.83%)等。

2.4 刺五加不同部位的揮發(fā)性成分HCA

通過SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對刺五加不同部位的10種共有成分的相對含量進(jìn)行HCA,采用Complete聚類法,以Euclidean距離為測度。繪制刺五加不同部位揮發(fā)性成分聚類熱圖,顏色的深淺代表各部位成分相對含量的高低,顏色越深,相對含量越高[11]。如圖5所示,刺五加的根與果聚為一類;皮和葉聚為一類,再與莖聚為一類。HCA結(jié)果說明刺五加根和果共有成分的種類和含量具有一定的相似度,與皮、葉和莖之間差異較大。

注:AS-R.根;AS-V.皮;AS-S.莖;AS-L.葉;AS-F.果圖5 刺五加不同部位揮發(fā)性成分聚類熱圖Fig.5 Cluster heat map of volatile components indifferent parts of Acanthopanax senticosus

2.5 刺五加不同部位的揮發(fā)性成分PCA

為了便于對刺五加5個部位間揮發(fā)性成分的相似性和差異性進(jìn)行科學(xué)準(zhǔn)確的評價,利用PCA對表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析。通過SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對5組樣品的167種揮發(fā)性成分及其含量進(jìn)行PCA。經(jīng)分析后,共提取5個主成分(表3),其中前2個主成分的特征值均>1,其方差貢獻(xiàn)率分別為50.04%、20.06%,2個主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了70.10%,故選取主成分一、二能夠反映樣品的整體信息。

表3 主成分的特征值及其貢獻(xiàn)率Table 3 The eigenvalues of principal componentsand their contribution rates

各特征向量揮發(fā)性成分相對含量數(shù)據(jù)再通過SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件標(biāo)準(zhǔn)化后,得到各部位的因子得分、主成分得分和綜合得分(表4)。由主成分綜合得分(Y)可知,刺五加不同部位揮發(fā)性得分存在顯著差異,其中刺五加根揮發(fā)性成分的綜合得分最高(1.25),其次為莖(-0.22)、果(-0.67)、葉(-0.87)、皮(-1.09)。

表4 刺五加不同部位揮發(fā)性成分因子得分、主成分得分和綜合得分Table 4 Factor scores, principal component scoresand composite scores of volatile componentsin different parts of Acanthopanax senticosus

分別以主成分一、二做PCA散點(diǎn)圖(圖6),通過分析各點(diǎn)之間的距離來判斷刺五加各部位揮發(fā)性成分的差異程度。由圖6可知,刺五加不同部位處于各自獨(dú)立的空間,表明刺五加各部位揮發(fā)性成分有顯著差異,與表4中綜合得分相對應(yīng)。此外皮、葉和莖的距離較近,根和果均位于第一象限,進(jìn)一步證實(shí)了HCA的分析結(jié)果。

注: AS-R.根;AS-V.皮;AS-S.莖;AS-L.葉;AS-F.果圖6 刺五加不同部位揮發(fā)性成分PCA散點(diǎn)圖Fig.6 PCA scatter plot of volatile components indifferent parts of Acanthopanax senticosus

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)從刺五加的根、皮、莖、葉、果中共鑒定出167種揮發(fā)性成分,各部位揮發(fā)性成分的種類和含量差異較大,其中烯類、醇類、芳香族類化合物占比較大。5個部位共有成分僅10種,其中含量較高的β-石竹烯具有抗炎抑菌、保護(hù)神經(jīng)的作用[12];α-律草烯具有抗炎、抗病毒的藥理作用[13];同時β-石竹烯和α-律草烯在皮、葉、果中的含量高于根及莖,因此刺五加的非藥用部位可作為抗炎類藥物進(jìn)一步研究。從刺五加各部位主要揮發(fā)性成分看,根中主要揮發(fā)性成分茴香腦能緩解胃腸平滑肌痙攣,改善胃腸功能紊亂,還有腦保護(hù)和減輕腦水腫、鎮(zhèn)痛抗炎等作用[14-15];莖中含量較高的桉油烯醇可起到平喘祛痰、抗菌的作用[16];葉的主要揮發(fā)性成分薄荷腦具有鎮(zhèn)痛、利膽及安神醒腦的作用[17-18];皮、葉、果中含量較高的芳樟醇具有抗焦慮、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜催眠等作用,在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域廣泛使用[19],因此刺五加還可作為改善睡眠的茶葉或飲品的原材料,可開發(fā)為功能性保健食品。

PCA和HCA分析結(jié)果能更直觀地反映出刺五加不同部位之間揮發(fā)性成分及含量的差異。結(jié)合綜合得分與PCA散點(diǎn)圖來看,刺五加藥用部位得分均高于非常規(guī)藥用部分,根的得分最高,其次為莖、果、葉、皮。HCA結(jié)果顯示根和果共有成分的種類和含量具有一定的相似度;皮、葉與莖共有成分的種類和含量具有一定的相似度,表明刺五加非常規(guī)藥用部位具有開發(fā)應(yīng)用的潛力。

目前對刺五加其他非藥用部位的研究仍較少,其皮、葉、果未得到充分的開發(fā)利用,但這些部位具有豐富的藥效成分及眾多藥理作用。因此,本實(shí)驗(yàn)首次運(yùn)用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)測定分析刺五加不同部位的揮發(fā)性成分,闡明其不同部位的關(guān)鍵成分及不同部位間揮發(fā)性成分的差異,為進(jìn)一步開發(fā)利用刺五加資源提供科學(xué)依據(jù)。