低溫大氣壓等離子體對(duì)脫礦牙本質(zhì)膠原保護(hù)作用的體外研究

贠 寧，王丹楊*，丁 鵬，謝 娜，吳昊宸，李 璇，朱曼琪

（1.西安醫(yī)學(xué)院 口腔醫(yī)學(xué)院 口腔修復(fù)學(xué)教研室，西安 710021；2.西安醫(yī)學(xué)院 口腔醫(yī)學(xué)院 口腔內(nèi)科學(xué)教研室，西安 710021；3.西安醫(yī)學(xué)院校醫(yī)院（未央?yún)^(qū)未央湖醫(yī)學(xué)院社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心），西安 710021）

牙本質(zhì)是一種結(jié)構(gòu)特殊且成分復(fù)雜的牙體硬組織，由具有三維框架結(jié)構(gòu)的牙本質(zhì)小管和管周、管間牙本質(zhì)組成，其主要成分為70%無機(jī)物、20%有機(jī)物和10%水[1]。有機(jī)物中約90%為I型膠原蛋白，10%為非膠原蛋白[1]。當(dāng)牙本質(zhì)遇到酸性物質(zhì)引起礦物質(zhì)大量丟失之后，就會(huì)導(dǎo)致膠原纖維網(wǎng)暴露，脫礦的膠原纖維十分敏感，會(huì)在細(xì)菌代謝產(chǎn)物和基質(zhì)金屬蛋白酶的攻擊下發(fā)生水解，引發(fā)齲病，降低牙本質(zhì)粘接修復(fù)的持久性[2]。

低溫常壓等離子體（Non-Thermal Atmospheric Pressure Plasma，NTAPP）是近年來一種新興的表面處理技術(shù)，可以產(chǎn)生大量帶電粒子、各種離子、自由基和活性氧等活性物質(zhì)，并且在能量轉(zhuǎn)換時(shí)對(duì)周圍環(huán)境的加熱作用較弱，因此可保持較低溫度，使得等離子體技術(shù)可以應(yīng)用于敏感性較高的生物組織[3]。已有研究證實(shí)，等離子體處理可誘導(dǎo)明膠在液態(tài)和固態(tài)時(shí)發(fā)生交聯(lián)，還能夠增加膠原纖維表面含氧官能團(tuán)[4]，有利于保存牙本質(zhì)膠原纖維的三維形貌。但NTAPP是否是通過增加膠原交聯(lián)度的方式增韌膠原，尚需研究進(jìn)一步證實(shí)。

本研究擬探討NTAPP處理脫礦牙本質(zhì)后，對(duì)膠原纖維的交聯(lián)度及膠原耐降解性的影響，以期為NTAPP在牙酸蝕癥、齲病的治療和牙本質(zhì)粘接領(lǐng)域的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

場發(fā)射掃描電鏡（JSM-7500F，Jeol，日本）、低速金剛石切割機(jī)（沈陽科晶自動(dòng)化設(shè)備制造有限公司）、低溫常壓等離子體發(fā)生裝置（CTP-2000K，南京蘇曼等離子科技有限公司）、示波器（MSO1104Z，蘇州普源精電科技有限公司）、冷凍離心機(jī)（5804 R，Eppendorf，德國）、全自動(dòng)樣品快速研磨儀（Tissuelyser-48，上海凈信科技）、電子天平（Sartorius，德國）、冷凍干燥機(jī)（ES2030，Hitachi，日本）及酶標(biāo)儀（Thermo Multiskan－GO，美國）。

1.2 主要試劑和材料

茚三酮試劑（鼎國生物試劑有限公司，北京）、磷酸（國藥集團(tuán)，北京，中國）、37%磷酸酸蝕劑（Vericom公司，韓國）、高純度氦氣（99.999%，西安天盛氣體有限公司）及去離子水。

收集新鮮無齲的第三磨牙（西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院口腔科），患者知情同意，刮除附著軟組織，清洗后生理鹽水中4℃保存，于1周內(nèi)使用。本研究由西安醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審查通過，批準(zhǔn)號(hào)為XYLS2020142，患者均簽署知情同意書。

1.3 膠原交聯(lián)度測試

1.3.1 NTAPP射流產(chǎn)生

本研究使用的NTAPP設(shè)備采用連續(xù)正弦波驅(qū)動(dòng)的介質(zhì)阻擋放電原理，電源輸入功率為8 W，峰值電壓Vpp為7.0 kV，頻率為54.9 kHz，放電氣體為高純度氦氣（He），氣體流量為3 L/min。

1.3.2 牙本質(zhì)粉制備

15顆新鮮離體牙用慢速切割機(jī)在流水降溫條件下，截取冠部牙本質(zhì)，體式顯微鏡檢查無釉質(zhì)殘留，片切成1 mm厚的牙本質(zhì)片，液氮中凍存30 min，隨后用全自動(dòng)樣品快速研磨儀將牙本質(zhì)片磨成牙粉（60 Hz，90 s），研磨罐內(nèi)加有液氮以保持試件在低溫下粉碎。牙粉過篩后，選取直徑小于20μm的牙粉，用10%的磷酸溶液4℃下浸泡24 h至完全脫礦，無菌去離子水反復(fù)沖洗離心牙本質(zhì)粉5次（3000 rpm/2 min，4℃），最后一次沖洗離心后棄掉上清液（14000rpm/10min，4℃），冷凍干燥備用。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。空白對(duì)照組的牙粉不做任何處理；陽性對(duì)照組稱取10 mg全脫礦牙粉，用4 mL 5%的戊二醛浸泡120 s，清洗、離心及凍干備用；實(shí)驗(yàn)組牙粉置于微孔板中并滴加50μL無菌去離子水混合均勻，NTAPP在8 W 3L條件下處理15 s（2.5 mg/次，n=4次），具體操作步驟如前所述[5]，同樣清洗、離心、凍干備用。

1.3.3 交聯(lián)度測試

每組稱量2.5 mg處理后的牙粉做茚三酮染色實(shí)驗(yàn)，各組分別加入1 mL無菌去離子水，靜置60 min后加入3mL茚三酮試劑（2%茚三酮-無水乙醇溶液），100℃水浴加熱20 min，冷卻至室溫后加入5 mL 60%乙醇溶液，在570 nm波長下用酶標(biāo)儀測量吸光度，每組設(shè)3個(gè)平行樣本（200μL/樣），以平均值作為該組該次樣本的測量值。以梯度濃度的甘氨酸溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)各組吸光度，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算自由α-氨基酸的含量。根據(jù)公式計(jì)算各組交聯(lián)度[5]。

式中：M0和Mt分別表示交聯(lián)處理前后牙本質(zhì)膠原中自由α-氨基酸的量。

1.4 牙本質(zhì)膠原耐次氯酸鈉溶解作用的檢測

1.4.1 試件制備

流水沖洗下，11顆新鮮離體牙用慢速切割機(jī)去除咬合面釉質(zhì)層，截取冠部牙本質(zhì)，每顆牙可制取3片1.5 mm×1.5 mm×6 mm大小的牙本質(zhì)片，每個(gè)牙片背面刻2道刻痕以區(qū)分試件正反面。32個(gè)試件隨機(jī)分為陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組（n=16片）。牙本質(zhì)表面用37%的磷酸凝膠酸蝕15 s，流水沖洗60 s，對(duì)照組試件置于去離子水中備用。無塵紙巾吸干實(shí)驗(yàn)組試件表面水分后，置于NTAPP噴嘴下方3 cm處，使射流均勻噴刷牙面15 s。隨后各組牙本質(zhì)片分別浸泡于3.5 mL 5%的NaClO溶液中0、30、60、120 s（n=4片），然后流水下沖洗4 h。

1.4.2 膠原顯微形貌觀察

將處理后的牙本質(zhì)試件，用2.5%戊二醛0.1 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS）固定4 h，PBS沖洗3次，乙醇梯度脫水，真空干燥、噴金，在場發(fā)射掃描電鏡（FE-SEM）下觀察脫礦牙本質(zhì)膠原的超微結(jié)構(gòu)。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，對(duì)膠原的交聯(lián)度進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.001。

2 結(jié)果

2.1 交聯(lián)度

各處理組的交聯(lián)度如圖1所示，5%戊二醛處理120 s的交聯(lián)度為68.17%，NTAPP處理15 s組的交聯(lián)度稍低于戊二醛組，為65.92%，但2組間無顯著性差異（P＞0.001）。

圖1 各處理組脫礦膠原交聯(lián)度（X±s，n=4）

2.2 次氯酸鈉溶解后各組膠原纖維形貌

由圖2可見，隨著NaClO處理時(shí)間延長，各組膠原纖維網(wǎng)均出現(xiàn)不同程度降解現(xiàn)象。對(duì)照組未經(jīng)NaClO處理前，牙本質(zhì)小管間、管周及小管內(nèi)膠原纖維網(wǎng)完整，如圖2（a）所示。經(jīng)NaClO處理30s后，小管間膠原纖維間隙消失，管內(nèi)膠原出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，部分管周膠原纖維降解，如圖2（b）所示。經(jīng)NaClO處理60s后，膠原纖維降解現(xiàn)象加劇，僅某些小管內(nèi)可見單根完整的膠原纖維，如圖2（c）所示。經(jīng)NaClO處理120s后，膠原纖維完全降解，牙本質(zhì)小管口開放呈較大的漏斗狀，根管壁可見側(cè)支開口，如圖2（d）所示。

NTAPP處理15 s組未經(jīng)NaClO處理（如圖2（e）所示）和經(jīng)NaClO處理30s（如圖2（f）所示），膠原纖維網(wǎng)形貌與對(duì)照組未經(jīng)NaClO處理相似，無明顯改變。經(jīng)Na－ClO處理60s后，管間和部分管周膠原纖維網(wǎng)降解，小管內(nèi)和部分管周膠原纖維網(wǎng)結(jié)構(gòu)仍較完整，如圖2（g）所示。經(jīng)NaClO處理120s后，膠原纖維進(jìn)一步降解，未降解的膠原纖維出現(xiàn)斷裂和卷曲現(xiàn)象，如圖2（h）所示。

圖2 NaClO處理不同時(shí)間各組膠原纖維FE-SEM圖像

3 討論

本研究證實(shí)經(jīng)過NTAPP處理后，可以增加牙本質(zhì)膠原的交聯(lián)度，提高牙本質(zhì)膠原的耐降解性，其效果與戊二醛處理結(jié)果相當(dāng)。

經(jīng)NTAPP處理后的具體機(jī)制可能與等離子體射流產(chǎn)生的紫外線相關(guān)，有研究表明，紫外線輻射可以使明膠鏈發(fā)生交聯(lián)作用[6]：有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)紫外線能夠打破膠原蛋白的弱內(nèi)在交聯(lián)，并產(chǎn)生自由基，其結(jié)合光敏劑產(chǎn)生的活性氧可誘導(dǎo)分子間共價(jià)鍵形成分子間交聯(lián)[7]。

本研究評(píng)價(jià)了NTAPP處理對(duì)提高脫礦牙本質(zhì)膠原交聯(lián)度及脫礦牙本質(zhì)膠原纖維耐NaClO溶液降解的能力。眾所周知，戊二醛是一種用于制備植入性生物材料的膠原固定劑，本研究使用NTAPP處理脫礦牙本質(zhì)膠原后，其交聯(lián)度與戊二醛處理結(jié)果相當(dāng)，提示NTAPP具有較好的促交聯(lián)作用。NaClO對(duì)蛋白質(zhì)具有非特異性降解作用[8]。由圖1可知，經(jīng)NTAPP處理后，膠原的降解程度減緩，提示NTAPP處理可改善牙本質(zhì)膠原纖維的強(qiáng)度。等離子體能夠產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，其中的紫外線可引起明膠分子間交聯(lián)，并在膠原和明膠氨基酸（如酪氨酸和苯丙氨酸）的芳香殘基上形成自由基[6，9]。其次，等離子體產(chǎn)生的自由基可與OH相互作用，在聚合纖維上形成羥基化合物，隨后可通過氫鍵增加交聯(lián)數(shù)量[10]。此外，等離子體中的電子也與基質(zhì)相互作用，在聚合物鏈中形成自由基，引發(fā)聚合鏈中瞬間形成自由基，進(jìn)而啟動(dòng)交聯(lián)過程[4]。本研究結(jié)果正是通過NTAPP增加膠原交聯(lián)度的作用，提升了膠原的耐降解性。

4 結(jié)論

在適宜的條件下，NTAPP處理可有效增加脫礦牙本質(zhì)膠原的交聯(lián)度，增強(qiáng)脫礦膠原纖維耐NaClO溶解的能力。本研究中，最適宜的處理時(shí)間是15 s。該研究結(jié)果為NTAPP在牙酸蝕癥、齲病的治療和牙本質(zhì)粘接領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的思路。