心肌缺血再灌注損傷模型的實驗動物種屬選擇和建模方法比較

楊嘉俊，吳賢生

（廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，廣東佛山 528248）

心肌缺血/ 再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI）是指心肌組織在短暫缺血后恢復(fù)血流而導(dǎo)致組織進一步損傷的現(xiàn)象，是當(dāng)前世界人類健康和生活質(zhì)量的重大威脅，也是心血管疾病研究領(lǐng)域的熱點。

MIRI 動物模型可選擇的動物種屬較多，制備方法也有差異，并且細(xì)微的實驗條件變化往往影響試驗的可重復(fù)性。本文將比較和歸納各種MIRI 動物模型的特點，為研究者在開展MIRI 的相關(guān)研究選擇動物模型時提供參考依據(jù)。

1 動物選擇

1.1 大 鼠 大鼠作為最常見的實驗動物之一，其遺傳背景清楚、繁殖能力強、生長快速，易于購買且價格低廉。大鼠的冠狀動脈左旋降支變異較小，用于MIRI 模型制備時具有較好的重復(fù)性。上述優(yōu)點使得大鼠成為制備MIRI 模型的理想實驗動物，也是目前國內(nèi)外在開展MIRI 的整體實驗時使用最多的動物品種。此外，相比其他種屬實驗動物，大鼠因其在科學(xué)研究中使用頻率高，相應(yīng)的檢測試劑等也更齊全，為開展研究指標(biāo)的檢測提供更多便利。

1.2 小 鼠 小鼠作為另一種最常見的實驗動物，具有與大鼠相似的特點，并且價格較大鼠更加低廉。但是小鼠由于個體較小，在用于MIRI 研究時，對實驗操作技術(shù)要求更高以保證造模結(jié)果的一致性；同時受到體型過小的限制，可以采集和用于檢測的樣品量較少，限制了檢測指標(biāo)的種類。

1.3 兔 與其他種屬不同，兔具有2 個獨立的胸腔氣室。在不損傷胸腔隔膜的前提下，兔可以依靠右側(cè)肺部維持自主呼吸，因此在制備MIRI 模型時無需以呼吸機維持肺部通氣，可以減少因氣管插管和維持肺部通氣造成的肺損傷，提高動物術(shù)后存活率和增大模型的可重復(fù)性。兔具有發(fā)達的耳部血管，方便術(shù)后靜脈給藥干預(yù)和術(shù)后不同時間點采集和檢測血液指標(biāo)。

1.4 犬 犬體積大小適中，性情溫順，是心血管外科最常用的實驗動物。犬血管豐富，方便研究過程中血液指標(biāo)采集，是藥物代謝研究的良好實驗動物。犬心臟冠脈粗大，除了可以采用常規(guī)的線扎法外，也可以采用球囊封堵法阻斷冠脈血流，可精準(zhǔn)控制冠脈的開放，減少手術(shù)造模對動物心臟和肺部的損傷。此外，較大的心臟也更利于進行體外MIRI的研究。

1.5 豬 小型豬的體型與實驗犬相似，線扎法、球囊封堵法等造模方法同樣適用于小型豬。并且和犬及其他常用的實驗動物相比，豬的心臟大小、結(jié)構(gòu)和冠狀動脈的解剖結(jié)構(gòu)、生理特點等都與人更相近，因此成為臨床異體心臟移植手術(shù)的首選供體選擇，在MIRI 模型制備時相比其他種屬動物更具研究價值。但小型豬性情不如實驗犬溫順，術(shù)后給藥干預(yù)和指標(biāo)采集等操作對實驗操作人員的要求更高。

1.6 其他種系動物 除上述常見動物種屬外，非人靈長類也可用于MIRI 的研究，其造模方法與犬、小型豬相似。但當(dāng)前國內(nèi)外非人靈長類的資源極其緊缺，近年來極少見使用非人靈長類的MIRI 研究報道。樹鼩因與靈長類具有較近的親緣關(guān)系而被更多的研究者關(guān)注，并且被應(yīng)用到MIRI 的研究。豚鼠心臟動作電位、Ca2+流量與人類極為相似，常用于離體MIRI 的研究。

2 動物模型的制備方法

2.1 大、小鼠MIRI 模型 大鼠MIRI 模型的制備主要分為使用呼吸機維持肺部通氣的常規(guī)操作法和不使用呼吸機維持肺通氣的快速操作法。常規(guī)操作法中，通常使用戊巴比妥鈉或烏來糖麻醉大鼠后，進行氣管插管，并以呼吸機維持肺部通氣。待大鼠呼吸平穩(wěn)后，剪開胸腔，剪開心包膜，結(jié)扎冠狀動脈左旋降支（LAD），阻斷心肌血流。心肌缺血時間到達預(yù)設(shè)值后，剪開結(jié)扎線，恢復(fù)LAD 供血。術(shù)后排出胸腔氣體，閉胸，完成造模。快速操作法則是不采用機械維持肺部通氣，在開胸后迅速擠出大鼠心臟，結(jié)扎LAD，心臟復(fù)位后以血管鉗等暫時閉胸。心肌缺血時間到達預(yù)設(shè)值后，再次開胸恢復(fù)冠脈血流。大鼠在MIRI 的研究中使用數(shù)量最多，研究者對大鼠MIRI 模型也做了優(yōu)化和調(diào)整，例如張衛(wèi)強等通過在結(jié)扎線下墊凹槽型塑料軟圓管，減少了再灌注剪線時對心肌的損傷；王平安等通過預(yù)埋魚線和冠脈結(jié)扎，到達預(yù)設(shè)時間后抽出魚線完成冠脈復(fù)通，提高了造模效率。小鼠的MIRI 模型制備方法與大鼠MIRI 模型制備方法大體一致，采用快速操作配合預(yù)埋魚線/導(dǎo)管的方法，可以提高造模效率。

2.2 兔MIRI 模型 兔MIRI 模型的制備方法與大鼠MIRI 模型制備方法相似，主要操作為開胸后以線扎法阻斷冠脈血流，到達預(yù)設(shè)缺血時間后通過剪線或者抽出預(yù)埋的軟管回復(fù)冠脈血流以制備MIRI模型。但與大鼠MIRI 模型相比，兔MIRI 模型的制備存在2 個較大的差異。（1）兔的胸腔由縱膈分為互不相同的左右兩部分，在不損傷縱膈時，兔可以在剪開左側(cè)胸腔后依靠右肺維持自主呼吸。李卓等發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)使用呼吸機維持肺部通氣相比，依靠兔右肺自主呼吸條件下制備MIRI 模型，動物術(shù)后存活率，MIRI 模型術(shù)后可顯著提高。（2）與大鼠相比，兔LAD 變異較大，在制備MIRI 模型時，通常需排除LAD 過短而不適合制備MIRI 模型的個體。張磊等考慮到人及哺乳類動物90%以上的房室結(jié)動脈及2/3 的竇房結(jié)動脈均起源于右冠狀動脈，通過結(jié)扎右冠脈的方法制備MIRI 模型，成功制備了右心MIRI 模型。

2.3 犬和小型豬MIRI 模型 （1）線扎法：犬和小型豬的線扎法制備方法與大鼠MIRI 造模方法相似，動物麻醉后進行氣管插管，以呼吸機維持肺部通氣。待呼吸平穩(wěn)后開胸腔，通常在LAD 中遠(yuǎn)端穿線/管，結(jié)扎LAD 阻斷血流。到達缺血預(yù)設(shè)時間后，恢復(fù)LAD 供血，制備MIRI 模型。

（2）球囊封堵法：動物麻醉后，在冠狀動脈造影的引導(dǎo)下，可以將球囊探入心臟冠狀動脈左旋降支中，通過控制球囊的充盈實現(xiàn)阻斷或恢復(fù)冠狀動脈從而制備MIRI 模型。本方法可以無需氣管插管、無需使用呼吸機維持肺部通氣和開胸腔，造模操作對動物肺部損傷小，動物術(shù)后恢復(fù)快速，死亡率小。但球囊封堵法對實驗條件，尤其是影像學(xué)檢查的要求高，通常需要介入科醫(yī)生輔助。

（3）心臟體外循環(huán)（Cardiopulmonary Bypass，CPB）術(shù)后MIRI 模型：動物麻醉后進行氣管插管，以呼吸機維持肺部通氣。待呼吸平穩(wěn)后開胸腔，心臟插管并鏈接人工心肺機，建立心臟體外循環(huán)。通過阻斷和開放心臟的升主動脈，阻斷心臟血流，建立MIRI 模型。本模型主要用于CPB 手術(shù)時心肌的保護策略研究。

2.4 豚鼠離體心臟MIRI 模型 豚鼠麻醉后，氣管插管，以呼吸機維持肺部通氣。剪開胸腔，暴露主動脈并完成在體插管。插管成功后剖下豚鼠心臟，轉(zhuǎn)入37 ℃保溫槽中，以KH 液進行逆向灌流。在離體心臟穩(wěn)定后，阻斷灌流管，使得全心缺血，達到預(yù)設(shè)的缺血時間后可恢復(fù)灌流，制備MIRI 模型。

3 模型制備中的影響因素

3.1 動物種屬 不同種系的動物生物學(xué)特點和心臟解剖結(jié)構(gòu)之間存在差異，研究者應(yīng)根據(jù)研究目的和條件選擇合適種屬的動物和相應(yīng)的造模方法。小鼠和大鼠常用于評價藥物的MIRI 的治療作用，而體型更大的犬和豬更多用于心外科MIRI 研究中。結(jié)扎冠脈是制備MIRI 中的重要環(huán)節(jié)，直接決定造模的成敗。不同種屬動物心臟冠脈的解剖結(jié)構(gòu)直接影響結(jié)扎部位的選擇。使用大、小鼠制備MIRI 模型時，通常選擇冠狀動脈左前降支。兔和犬則擁有相對更為粗大的左冠狀動脈回旋支，也可考慮結(jié)扎左冠狀動脈回旋支制備MIRI 模型。

3.2 麻醉方式和肺部通氣 異氟烷對梗死心肌的保護作用最早于1997 年被確認(rèn)，隨后越來越多研究證實了吸入麻醉對MIRI 的保護作用。王曼等使用開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備小型豬MIRI 模型時發(fā)現(xiàn)，與單純靜脈麻醉組比較，靜脈- 吸入復(fù)合麻醉組小型豬手術(shù)過程中血液二氧化碳分壓和氧分壓更加穩(wěn)定，心肌損傷程度也更小。王曉蕾等用七氟烷后處理可改善MIRI 大鼠心肌的血流，對受損心肌具有保護作用。在選擇MIRI 模型制備條件時，研究者應(yīng)考慮麻醉對造模結(jié)果的影響，并應(yīng)當(dāng)使得各組在相同的實驗條件下完成造模。

采用非機械通氣制備兔MIRI 模型時，兔左肺暫時失去通氣功能，緊靠右肺維持呼吸，因此麻醉劑的選擇和麻醉深度對造模的成功率有著重要影響。速眠新Ⅱ和戊巴比妥鈉聯(lián)用通常對兔呼吸具有較重的抑制作用，可以考慮使用速眠新Ⅱ和舒泰50聯(lián)合麻醉以減輕呼吸抑制。

3.3 缺血時間 Lindsey 等認(rèn)為，以降低MI 后心衰發(fā)生率為目的的研究，應(yīng)當(dāng)考慮非灌注模型，而以研究MI 保護作用為目的的研究，更適合采用灌注模型。短時間缺血，當(dāng)心肌恢復(fù)血流灌注后可以迅速恢復(fù)正常；更長時間的缺血（例如30 min 以上）則通常引起心肌細(xì)胞不可逆損傷。關(guān)雷等認(rèn)為出于節(jié)省實驗時間的考慮，MIRI 模型的缺血時間應(yīng)選擇30～40 min 為宜。王燕等通過比較不同缺血時間對豚鼠離體心臟MIRI 損傷的影響，認(rèn)為缺血50 min后再進行灌注，可以明顯加重離體心肌的損傷。研究者應(yīng)根據(jù)研究的目的選擇合適的心肌缺血時間，例如評價藥物保護作用時可以考慮使用較短的缺血時間條件，避免造模過深而造成心肌損傷不可逆。

4 小結(jié)

MIRI 研究中，可選擇的實驗動物種屬較豐富，且有各自的生理特征和優(yōu)缺點。研究者應(yīng)當(dāng)結(jié)合自己的研究目的、實驗條件和研究指標(biāo)選擇合適的實驗動物，并設(shè)計合適的造模方法。MIRI 模型制備時，麻醉條件、心肌缺血時間、術(shù)后觀察時間和造模操作的熟練程度等條件差異往往對實驗結(jié)果有著較大影響，甚至決定了模型的成敗。在MIRI 藥物研發(fā)和防治策略中，需要藥物研發(fā)人員、臨床醫(yī)師和動物實驗技術(shù)人員緊密配合，以提供穩(wěn)定的、重復(fù)性高的實驗條件。