潛伏相關(guān)核抗原在卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染過程中的作用

路正東,晏巍振 綜述 王林定,周 暢 審校

卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi′s sarcoma associated herpesvirus,KSHV),又稱為人類皰疹病毒8型,是一種雙鏈DNA病毒,常導(dǎo)致感染者出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞腫瘤,即卡波氏肉瘤(Kaposis sarcoma,KS )。臨床上常表現(xiàn)為皮膚多發(fā)性斑點(diǎn)狀或斑塊狀等內(nèi)皮細(xì)胞侵襲性表現(xiàn)[1]。KSHV在宿主體內(nèi)常處于潛伏和裂解兩種狀態(tài),潛伏相關(guān)核抗原(latency-associated nuclear antigen,LANA)是維持其潛伏期的關(guān)鍵蛋白,也是潛伏期含量最高的蛋白。潛伏期間的KSHV可在LANA的介導(dǎo)下,將基因組連接到宿主染色體上,從而使病毒基因組和宿主細(xì)胞同步復(fù)制[2]。目前,臨床上常在裂解期進(jìn)行治療,主要原因是KSHV在潛伏期對(duì)抗病毒藥物具有很強(qiáng)的耐藥性和逃避宿主免疫殺傷的能力,而裂解期的治療效果則相對(duì)欠佳,故LANA可作為未來的研究重點(diǎn)。該文就LANA蛋白的作用機(jī)制和研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 概述

1.1 KSHVKSHV是一種致癌病毒,可導(dǎo)致KS等多種惡性腫瘤。KSHV基因組包含一個(gè)大約140 kb長(zhǎng)的中央獨(dú)特編碼區(qū)和兩側(cè)高GC含量的非編碼末端重復(fù)序列(terminal repeat units,TR)[3],主要負(fù)責(zé)病毒蛋白表達(dá)。潛伏感染期間,病毒基因組在宿主細(xì)胞核中轉(zhuǎn)換為一個(gè)環(huán)狀集合體,使病毒的轉(zhuǎn)錄翻譯能力高度受限,無法僅靠自身完成病毒的復(fù)制,必須通過和宿主細(xì)胞的基因結(jié)合才能產(chǎn)生下一代病毒。該機(jī)制使得病毒在宿主體內(nèi)維持一個(gè)非常低的水平,難以激活宿主的免疫反應(yīng),保證了病毒基因組的長(zhǎng)久存在。

1.2 KSKS是一種高度血管化及增生性的內(nèi)皮細(xì)胞源性腫瘤,來源于淋巴內(nèi)皮細(xì)胞,以炎癥和廣泛的新血管生成為特征,具有特殊的雙階段生命周期[4]。感染早期,常常出現(xiàn)充分延長(zhǎng)的梭形細(xì)胞大量增殖的特征性表現(xiàn),隨著感染的加劇,梭形細(xì)胞數(shù)量增加,最終在晚期占主導(dǎo)地位,在血管縫周圍形成交織束,產(chǎn)生肉眼可見的結(jié)節(jié)。臨床表現(xiàn)為免疫逃避、炎癥和血管生成的混合癥狀。

1.3 LANA基因和蛋白LANA是一種含有1 162個(gè)氨基酸,220～230 kDa大小的多功能蛋白質(zhì),分為N端、C端和中央天冬氨酸/谷氨酸的重復(fù)序列[5]。C端結(jié)構(gòu)域直接與KSHV基因組的保守TR序列結(jié)合。富含賴氨酸的N端中的染色質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(chromatin-binding domain, CBD)與宿主染色體對(duì)接,從而使KSHV基因組和宿主染色體形成一個(gè)整體結(jié)構(gòu)。當(dāng)宿主細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂時(shí),連接在宿主染色體上的KSHV基因組同步進(jìn)行復(fù)制,使得KSHV基因組持續(xù)存在于宿主細(xì)胞中,這是LANA最具特征性的功能之一。除了介導(dǎo)自身復(fù)制外,LANA蛋白還可以與多種腫瘤抑制蛋白相結(jié)合,降低這些蛋白的抑癌作用[6]。此外,LANA也被認(rèn)為與促進(jìn)血管的生成及宿主免疫系統(tǒng)逃逸有關(guān),能夠保證KSHV的持久存在。因此,在KSHV的潛伏期間,LANA作為一種高度表達(dá)且作用廣泛的致癌蛋白,在KSHV感染的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用。

2 LANA的作用機(jī)制

2.1 介導(dǎo)自身復(fù)制KSHV潛伏期的特征是在高度有序的核遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)中保證自身的存在,同時(shí)保持有限的病毒基因復(fù)制,不產(chǎn)生感染性子代。過去的研究[7]證明,LANA以宿主細(xì)胞中的組蛋白H2A和H2B (H2A/B)為連接點(diǎn),將病毒片段連接到細(xì)胞染色體上,與宿主細(xì)胞DNA同時(shí)復(fù)制并分離病毒基因片段到新生成的宿主子細(xì)胞核中。除了連接作用,LANA蛋白還具有調(diào)節(jié)作用,促進(jìn)病毒基因組的連接和復(fù)制,保證病毒的長(zhǎng)期存活和基因的穩(wěn)定復(fù)制。

2.1.1募集核小體組裝蛋白1 (nucleosome assembly protein 1,NAP1) NAP1L1是核小體組裝蛋白1的成員之一,由391個(gè)氨基酸蛋白組成,在轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制中發(fā)揮了組蛋白結(jié)合和核小體組裝等多種作用。病毒基因在S期復(fù)制時(shí),NAP1L1會(huì)與LANA蛋白中靠近CBD的氨基末端結(jié)合,結(jié)合有NAP1L1的LANA蛋白會(huì)募集于KSHV的TR區(qū)域并與其結(jié)合,從而發(fā)揮NAP1L1的復(fù)制與組裝作用[8]。在KSHV基因復(fù)制過程中,除了負(fù)責(zé)復(fù)制和組裝外,NAP1L1也可以使病毒基因染色質(zhì)化,降低其活性,負(fù)調(diào)控病毒裂解基因的轉(zhuǎn)錄,減少級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生,確保KSHV持續(xù)處于潛伏期狀態(tài)。在LANA蛋白的募集作用下,NAP1L1還可以抑制部分基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄,如RTA和K1基因,研究[9]表明NAP1L1與LANA一起表達(dá)時(shí),RTA啟動(dòng)子和K1啟動(dòng)子的活性都有所下降,但詳細(xì)機(jī)制尚不明確,可能是由NAP1L1破壞協(xié)同激活子p300與其它組蛋白的復(fù)合物結(jié)構(gòu)所導(dǎo)致。這些研究證明了LANA募集的NAP1L1在調(diào)節(jié)部分啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性及自我復(fù)制的重要性。

2.1.2寡聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定結(jié)合性 相關(guān)成像顯示,在潛伏感染期間,LANA蛋白中與KSHV基因TR序列結(jié)合的部位,即LANA DNA結(jié)合域(DNA binding domain,DBD),會(huì)形成包括十聚體、五聚體和螺旋體等多種高階寡聚體結(jié)構(gòu)[10]。在KSHV的復(fù)制過程中,LANA寡聚體結(jié)構(gòu)與TR區(qū)緊密結(jié)合,隨后招募細(xì)胞復(fù)制起始因子到該區(qū),如起源識(shí)別復(fù)合體,該因子對(duì)病毒DNA復(fù)制和片段維持具有重要作用。同時(shí),寡聚體結(jié)構(gòu)可以自動(dòng)調(diào)節(jié)ORF73基因的轉(zhuǎn)錄,在KSHV基因組的TR序列和ORF73序列之間存在一個(gè)使用染色質(zhì)構(gòu)象捕獲(chromatin conformation capture,3C)的DNA環(huán),該環(huán)結(jié)構(gòu)可以有效維持病毒的潛伏期,而寡聚體結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)該DNA環(huán)的形成。若LANA DBD未形成寡聚體結(jié)構(gòu),LANA與TR結(jié)合的穩(wěn)定性下降,病毒基因組易發(fā)生重排,DNA組易丟失,無法在宿主體細(xì)胞中完成正常復(fù)制。此外,3C DNA環(huán)也可能丟失,從而使病毒脫離潛伏期進(jìn)入活躍期,無法建立持久的潛伏感染。LANA DBD寡聚結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性也會(huì)影響KSHV的復(fù)制能力,簡(jiǎn)單的寡聚體結(jié)構(gòu)可以有效驅(qū)動(dòng)病毒DNA的有效連接和類宿主染色質(zhì)化,從而達(dá)到感染期間的持續(xù)潛伏狀態(tài)。低寡聚體結(jié)構(gòu)也可以促進(jìn)核小體復(fù)合體的合成,通過克服LANA蛋白與核小體結(jié)合的能障[11],提供LANA蛋白結(jié)合于宿主DNA及合成核小體復(fù)合體的驅(qū)動(dòng)力。

2.2 促血管產(chǎn)生促血管產(chǎn)生是KS腫瘤的一個(gè)重要標(biāo)志,KS腫瘤的早期階段也存在高度血管化,即組織學(xué)變化表現(xiàn)為血管裂隙增生、紅細(xì)胞外滲和大量水腫。一般而言,血管產(chǎn)生是一種可暫時(shí)緩解病情的代償性表現(xiàn),但在部分情況下,血管增生反而會(huì)進(jìn)一步加重病情。KSHV感染過程中可誘導(dǎo)多種血管生成細(xì)胞因子,包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)、血管生成素-2等,以兩種不同的分泌方式誘導(dǎo)血管生成[12]。異常血管的產(chǎn)生有利于KSHV的轉(zhuǎn)移,進(jìn)而加重病情,同時(shí)也會(huì)為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)移。

2.2.1上調(diào)表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域7(epidermal growth factor-like domain 7,EGFL7) EGFL7是一種促血管生成細(xì)胞因子,也被稱為血管內(nèi)皮抑制素,屬于VEGF家族。EGFL7在內(nèi)皮性病變部位高度上調(diào),常導(dǎo)致宿主出現(xiàn)病理性的血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞增殖。研究[13]表明,與正常人相比,KS腫瘤病人的EGFL7水平升高,且LANA的表達(dá)是導(dǎo)致該因子上調(diào)的主要原因。LANA對(duì)EGFL7表達(dá)的調(diào)控表現(xiàn)為隔離死亡域相關(guān)蛋白(death-associated protein,Daxx),降低Daxx與EGFL7的結(jié)合,從而減少Daxx對(duì)于EGFL7的抑制作用。Daxx是一種多功能蛋白,可與多種宿主細(xì)胞蛋白結(jié)合,參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和凋亡等多種細(xì)胞活動(dòng)。Daxx通過與禽紅母細(xì)胞病病毒E26癌基因同源物1 (avian erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1,Ets-1)結(jié)合從而抑制Ets-1活性,Ets-1是正調(diào)控EGFL7表達(dá)所需的核心轉(zhuǎn)錄因子。而LANA Glu/ Asp結(jié)構(gòu)域與Daxx結(jié)合后,具有對(duì)Daxx的隔離能力以及消除其對(duì)Ets-1的抑制作用的能力。Co-IP和免疫印跡實(shí)驗(yàn)[14]表明,LANA與Daxx的結(jié)合破壞了Daxx與Ets-1之間的聯(lián)系,使EGFL7表達(dá)上調(diào),促進(jìn)血管的生成和內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng);除此之外,該實(shí)驗(yàn)也證明當(dāng)LANA蛋白過表達(dá)時(shí),不僅隔離了過表達(dá)的內(nèi)源性Daxx,還隔離外源性Daxx,這加大了相關(guān)臨床治療的難度。除了促血管生成作用,EGFL7還參與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。臨床研究[15]表明,KSHV感染的原發(fā)性滲出性淋巴瘤細(xì)胞(BC3和BCBL1)的EGFL7蛋白上調(diào),提示EGFL7可能在KSHV誘導(dǎo)的惡性腫瘤中起重要作用。

2.2.2上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1) HIF-1血管生成因子由組成型表達(dá)的β亞基和氧調(diào)節(jié)的α亞基組成,α亞基在正常氧張力下不穩(wěn)定,但在低氧張力環(huán)境或一些激活的異常生長(zhǎng)因子作用下穩(wěn)定。KSHV感染后,LANA會(huì)使α亞基在宿主體內(nèi)異常穩(wěn)定表達(dá),α亞基的兩個(gè)同源物HIF-1α和HIF-2α表達(dá)明顯上調(diào),增加HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性。在LANA的影響下,HIF因子與鄰近內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合,上調(diào)VEGF等蛋白表達(dá),促進(jìn)新血管的生成及KS腫瘤的生長(zhǎng)。LANA除了直接調(diào)節(jié)HIF-1外,也能調(diào)控丙酮酸激酶M2型(pyruvate kinase M2,PKM2)來間接調(diào)節(jié)HIF。PKM2作為HIF-1的輔助激活因子被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中,促進(jìn)HIF-1α的合成,其含量的增加保證了HIF-1對(duì)于新血管生成的高效調(diào)控。相關(guān)研究[16]表明,抑制KSHV細(xì)胞中PKM2會(huì)導(dǎo)致HIF-1所調(diào)控的基因表達(dá)減少;使用PKM2 siRNA抑制PKM2可以阻斷HIF -1依賴的VEGF啟動(dòng)子的激活、表達(dá)和分泌。

2.3 延長(zhǎng)KSHV生存時(shí)間

2.3.1酸性結(jié)構(gòu)域讀取器抑制p53的作用 近期研究[17]表明,LANA包含兩個(gè)串聯(lián)的、部分重疊的酸性結(jié)構(gòu)域序列,位于第332～465氨基酸,與SET易位蛋白(SE translocation,SET)癌蛋白酸性結(jié)構(gòu)域序列同源。該結(jié)構(gòu)域可以模擬SET結(jié)合的過程,優(yōu)先與非乙?；痯53的羧基末端相互作用形成免疫共沉淀,抑制p53活性。同時(shí),LANA還可能結(jié)合其它蛋白質(zhì)來對(duì)病毒的持久性產(chǎn)生影響。例如,cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CBP)可以和p53結(jié)合,使p53出現(xiàn)乙?；?顯著降低LANA與p53的相互作用;LANA可以與CBP相互作用并抑制其乙?；傅幕钚?從而保證自身對(duì)于p53的抑制作用,防止宿主細(xì)胞被p53蛋白破壞,避免自身凋亡,延長(zhǎng)了感染細(xì)胞與KSHV自身的生存時(shí)間。雖然LANA片段中的第845～895氨基酸中也存在較低的同源酸性序列,但病毒的持久潛伏狀態(tài)仍主要依賴于LANA第332～465片段中的酸性結(jié)構(gòu)域讀取器[18]。如果缺少相關(guān)的酸性結(jié)構(gòu)域讀取器,那病毒將無法保持持久的潛伏感染狀態(tài)。此外,LANA的富酸性結(jié)構(gòu)域可以直接與Daxx相互作用,促進(jìn)血管的生成,也可以為自身的長(zhǎng)期存在提供有利的條件。

2.3.2LANA操縱G1-S進(jìn)程 在細(xì)胞周期中,E2F基因的表達(dá)是細(xì)胞周期進(jìn)入S期所必需的,對(duì)于維持正常的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及復(fù)制具有重大意義。正常情況下,Cdk4/6-cyclin D和Cdk2-cyclin E在表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)等多種細(xì)胞因子作用下激活,激活的復(fù)合物會(huì)磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma,RB)家族蛋白,抑制其對(duì)于E2F轉(zhuǎn)錄因子的失活影響[19]。在感染細(xì)胞中,LANA與RB相互作用并增強(qiáng)對(duì)于E2F轉(zhuǎn)錄因子的失活作用,使細(xì)胞周期無法正常進(jìn)入S期。LANA還可以與糖原合酶激酶(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)相互作用,GSK-3β參與磷酸化和周期調(diào)節(jié)因子的降解,導(dǎo)致G1-S進(jìn)程延長(zhǎng)。在細(xì)胞周期中,毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)(ataxia telangiectasia mutated,ATM)/毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)相關(guān)(ataxia telangiectasia and related,ATR)蛋白和細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1(checkpoint kinase1,Chk1)/細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶2(checkpoint kinase2,Chk2)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的自身凋亡,通過磷酸化p53蛋白來阻滯G1-S的進(jìn)程。研究[20]表明,LANA可以直接與Chk2相互作用,阻斷ATM/ ATR介導(dǎo)的自身凋亡,延長(zhǎng)G1-S進(jìn)程。除了作用于Chk2,LANA蛋白也與ATM/ATR結(jié)合,降低其對(duì)murine double minute2 (Mdm2)因子的失活作用。此外,LANA也可以直接結(jié)合并阻斷p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而抑制p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,延長(zhǎng)宿主細(xì)胞周期。LANA還可以正向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期依賴啟動(dòng)子,并通過維持周期蛋白依賴激酶抑制劑p16的過表達(dá)來誘導(dǎo)G1-S細(xì)胞周期的延長(zhǎng)。在高LANA含量的細(xì)胞中,Chk1/Chk2蛋白明顯上調(diào),p53蛋白活性降低,KSHV感染細(xì)胞存活率明顯上升。

2.3.3逃避宿主免疫監(jiān)測(cè) KSHV可以抑制多種免疫系統(tǒng)途經(jīng),躲避宿主免疫監(jiān)測(cè)是重要的輔助發(fā)病模式之一,LANA可以促使CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生干擾蛋白酶體來抑制主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類(major histocompatibility complex,MHC-I)的表達(dá),也可以通過抑制CD4+T細(xì)胞來阻斷Ⅱ類反式激活蛋白(class Ⅱ transactivator,CIITA)轉(zhuǎn)錄和其與調(diào)節(jié)因子X(regulatory factor X,RFX)復(fù)合物相互作用,從而下調(diào)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類(major histocompatibility complex,MHC-Ⅱ)基因的反應(yīng)[3]。LANA通過與KSHV的mRNA形成g-四鏈復(fù)合物則是上述免疫逃逸反應(yīng)的主要影響因素。LANA在與自身mRNA結(jié)合形成四鏈復(fù)合物后,可以有效減少mRNA翻譯來抑制氨基酸抗原的合成,降低抗原的呈遞,以此來逃脫宿主的免疫系統(tǒng)。相關(guān)研究[21]顯示,當(dāng)KSHV陽(yáng)性細(xì)胞中g(shù)-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定時(shí),LANA的抗原提呈被下調(diào)。LANA還可以抑制會(huì)對(duì)g-四重體的合成起負(fù)向調(diào)節(jié)作用的異質(zhì)核核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNPs),以此來發(fā)揮免疫逃逸作用。hnRNPs是一種RNA結(jié)合蛋白家族,主要調(diào)節(jié)基因表達(dá),包括mRNA剪接、維持mRNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)運(yùn)以及蛋白質(zhì)翻譯的調(diào)節(jié)。hnRNPs可與g-四聯(lián)體選擇性結(jié)合,潛在破壞g-四重復(fù)合物,而LANA則可以顯著抑制上述的破壞作用[22]。潛伏期KSHV感染的宿主細(xì)胞中,LANA水平和hnRNP A1與LANA mRNA的相對(duì)結(jié)合量常呈反比關(guān)系。當(dāng)LANA在細(xì)胞核中的濃度足夠高時(shí),相對(duì)結(jié)合量則較低,以此確保hnRNP A1不會(huì)破壞g-四重體,抑制mRNA輸出到細(xì)胞質(zhì),使其無法翻譯,降低可用于抗原提呈的蛋白質(zhì)水平。由于g-四環(huán)復(fù)合物在病毒生命周期中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用,作為KSHV的藥物治療靶點(diǎn)具有重要意義。

3 展望

LANA具有介導(dǎo)自身復(fù)制、上調(diào)EGFL7促血管生成、逃避宿主免疫系統(tǒng)等多種功能?；贚ANA能夠阻斷Daxx與Ets-1的相互作用、上調(diào)EGFL7和促進(jìn)血管生成這一機(jī)制,采用人為調(diào)控EGFL7進(jìn)行靶向治療或聯(lián)合治療,減少血管的生成,阻斷KSHV相關(guān)惡性腫瘤的發(fā)展。除此之外,LANA蛋白能夠直接結(jié)合并阻斷Chk1/Chk2蛋白的誘導(dǎo)凋亡、減少p53蛋白的磷酸化及抑制p53,從而逃避宿主免疫系統(tǒng)。以該機(jī)制為研究方向,可有效促進(jìn)抗原的提呈,使KSHV及時(shí)被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別,阻滯KSHV的復(fù)制,提高機(jī)體的免疫能力。對(duì)LANA蛋白主導(dǎo)下的多種機(jī)制進(jìn)行深入研究,可以為開發(fā)新型抗病毒藥物和早期抗感染藥物提供重要依據(jù)。