循環(huán)腫瘤細胞在肝細胞癌中的臨床綜合應(yīng)用進展

歐偉森，劉高敏，徐繼威

1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524023；2.梅州市人民醫(yī)院 肝膽外一科，廣東 梅州 514031

2020年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，原發(fā)性肝癌是我國目前第4 位常見的惡性腫瘤以及第2位的腫瘤致死病因[1]，對我國百姓的身心健康造成十分嚴重的威脅。原發(fā)性肝癌以肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）發(fā)生率最高，占75%～85%，因其侵襲性和轉(zhuǎn)移性很強，在疾病的初期就會侵犯到血管，從而導(dǎo)致遠處轉(zhuǎn)移。HCC目前主要依靠B超和AFP進行初步篩選，但二者缺乏足夠的敏感度和特異度：B超等影像學(xué)檢查的特異度＞90%，敏感度為65%～80%；當(dāng)AFP的閾值為400 μg/L時，特異度為99%，敏感度為32%[2]。待到確診HCC時，往往已發(fā)展至中晚期。因此迫切需要一種新型的腫瘤標(biāo)志物來開啟診治HCC的新紀元。

作為液體活檢的代表，循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）最先由Ashwort在1869年定義，即從惡性腫瘤原發(fā)部位脫落，通過血管或淋巴系統(tǒng)進入到血液循環(huán)的細胞[3]。CTC能否助力HCC的診治，是當(dāng)前探討的熱點問題[4]。

1 CTC對HCC早期診斷預(yù)測

AFP是當(dāng)前早期診斷HCC的最常用指標(biāo)，但缺乏足夠的敏感性和特異性。而CTC在疾病臨床表現(xiàn)前7～9 周即可被檢測到[5]，因此其可能先于臨床癌癥診斷[6]，這對于早期診斷不明確、AFP陰性或影像學(xué)不典型的高?；颊哂兄毺氐膬?yōu)勢[7]。Qi等[8]在2例HBV患者中檢測到了低水平的CTC，并且在隨訪的5 個月內(nèi)都出現(xiàn)了CT/MRI可檢測到的微小HCC腫瘤。因此CTC的檢測可能是極早期發(fā)現(xiàn)HCC的重要技術(shù)。目前最新的檢測方法主要有：（1）基于EpCAM和ASGPR的雙靶向功能化石墨烯薄膜，用于特異性識別HCC-CTC[9]；（2）基于GPC3免疫磁性材料熒光系統(tǒng)（C6/MMSN-GPC3）的新型CTC捕獲平臺，捕獲效率比傳統(tǒng)EpCAM免疫磁珠提高83.3%～350.0%[10]；（3）敏感度約85.7%的全自動集成微流控系統(tǒng)[11]；（4）敏感度和特異度分別為88.2%和100.0%的CTC計數(shù)聯(lián)合GNB4/Riplet甲基化檢測[12]；（5）利用抗ASGPR抗體和抗EpCAM抗體功能化的微流控協(xié)同芯片，敏感度和特異度分別為97.8%和100.0%[13]；（6）新型Ep-LMS/Vi-LMS-GPC3-LMS CTC檢測系統(tǒng)，敏感度和特異度分別為98.1%和96.9%[14]；（7）在檢測早期和AFP陰性HCC方面表現(xiàn)良好的ChimeraX-i120平臺[15]；（8）ImagesteamX Mark Ⅱ流式細胞儀[16]。綜上所述，隨著檢測技術(shù)的不斷成熟，或許在不久的將來，CTC將有可能取代AFP的首選地位，更早期、更靈敏、更高效地用于HCC的早期篩查、診斷。

2 CTC對HCC腫瘤分期的參考

癌癥的分期直接影響到治療的選擇和預(yù)后預(yù)測。目前國際上主流的HCC分期系統(tǒng)是巴塞羅那臨床肝癌（BCLC）分期系統(tǒng)、TNM分期系統(tǒng)。而CTC則可以提供一種新型的參考指標(biāo)。Yu等[17]發(fā)現(xiàn)，存活陽性CTC計數(shù)與TNM分期（P=0.002）和BCLC分期（P＜0.001）顯著相關(guān)。有學(xué)者則發(fā)現(xiàn)HCC患者的CTC在BCLC A期和BCLC B/C期的陽性率分別為69.8%和87.5%[18]。更有研究進一步確認間充質(zhì)CTC≥1 可作為判斷BCLC分期的臨界值[19]。早在2010年美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）就已經(jīng)在第7版《腫瘤分期指南》中將CTCs列入TNM分期系統(tǒng)；在第八版中，除保留cM0（i+）分期外，更進一步明確了CTC檢測的臨床價值。

3 CTC對HCC患者個體化治療的指導(dǎo)價值

HCC具有明顯的腫瘤異質(zhì)性，這是影響患者預(yù)后的重要因素之一，也是為其制訂相應(yīng)個體化治療的依據(jù)之一[7]。CTC是循環(huán)中潛伏的癌細胞，能夠在治愈性切除后引起腫瘤復(fù)發(fā)，因此靶向消除CTC對于根治癌癥顯得十分重要。通過分析PD-L1+CTC與抗PD-1治療反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)可知，接受PD-1檢查點抑制劑納武利尤單抗的5 例患者有治療反應(yīng)[20]。有學(xué)者更是開發(fā)出了多點共擊納米裝置（GV-Lipo/SF/DT），可以特異性靶向治療細胞并在捕獲CTC后將其殺死，從而消除腫瘤的“根”和“籽”[21]。一項研究納入了47例接受三聯(lián)療法[PD-1 抑制劑聯(lián)合調(diào)強放療（IMRT）和抗血管生成治療]的HCC患者，發(fā)現(xiàn)基線時＜2個PD-L1 CTC的HCC患者接受三聯(lián)療法的客觀緩解率（ORR）和總體生存率（OS）更好；并證實PD-L1 CTCs可以作為接受三聯(lián)療法的HCC患者的預(yù)測生物標(biāo)志物[22]。FGL1是LAG-3的主要配體且通過二者結(jié)合來抑制腫瘤T細胞的功能，其可作為新發(fā)現(xiàn)的潛在免疫治療靶點[23]。這類治療靶點對于個體化治療決策顯得尤為重要，它可以幫助醫(yī)師選擇適當(dāng)?shù)乃幬镏委煟云诟纳品磻?yīng)結(jié)果。目前的研究已為HCC患者的靶向或免疫治療提供了理論甚至是現(xiàn)實基礎(chǔ)，但仍需要進一步的前瞻性研究加以驗證。至于是否行肝切除術(shù)，Qi等[24]提出解剖性肝切除可能僅在低CTC計數(shù)和E/M-CTC陰性的患者中比非解剖性肝切除更有益，因此術(shù)前CTC分析可以更好地指導(dǎo)HCC患者切除方法的選擇。與單純肝切除術(shù)相比，接受PA-TACE治療的M-CTC陽性患者的無復(fù)發(fā)生存期（RFS）和OS均有顯著改善[25]。

4 CTC對HCC患者療效的評價

HCC的治療效果目前主要參考AFP及影像學(xué)檢測；對于采用系統(tǒng)抗腫瘤治療的HCC患者，大多采用RECIST 1.1進行療效評價[26]。Li等[27]的研究出現(xiàn)了HCC患者接受索拉非尼治療后CTC數(shù)量明顯減少的跡象，從而認為CTC數(shù)量變化是接受索拉非尼治療的HCC患者疾病無進展生存時間（PFS）的獨立預(yù)測因子。血清AFP、甲胎蛋白異質(zhì)體3（AFP-L3）及CTC三者聯(lián)合可用于預(yù)測微波消融（MWA）后的療效[28]。MWA治療后CTC顯著下降從而證實MWA對HCC患者有殺滅腫瘤細胞的作用；而在接受C-TACE治療的患者中與MWA相比此作用沒有顯著差異[29]。但Wu等[30]卻發(fā)現(xiàn)TACE治療1、4周后CTC水平顯著下降。通過對123例HCC患者的血液樣本在肝切除前和肝切除后1個月進行檢測，Sun等[31]首次報道了HCC患者肝切除后不久觀察到CTC負荷顯著降低，這很可能歸因于原發(fā)腫瘤的手術(shù)切除；他們還認為，EpCAM+CTC可作為監(jiān)測治療反應(yīng)的實時參考指標(biāo)，準(zhǔn)確而早期的決策有利于根據(jù)個體腫瘤的特征定制出最有效的治療方案。HCC患者通過系統(tǒng)治療后進行CTC檢測，若其數(shù)量減少，說明治療方式有效；在整個過程中實時動態(tài)監(jiān)測CTC的數(shù)量變化，可協(xié)助醫(yī)生了解治療效果，及時治療并調(diào)整方案。

5 CTC對HCC術(shù)前術(shù)后轉(zhuǎn)移的分析

CTC是原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤之間的關(guān)鍵中間體，可以反映腫瘤侵襲性和轉(zhuǎn)移潛力，并且可以成為肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的預(yù)測標(biāo)志物[11]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在腫瘤侵襲和播散中具有關(guān)鍵作用，且EMT先于腫瘤形成[32]，而轉(zhuǎn)錄因子Twist可能在HCC進展的早期階段促進了EMT的發(fā)生[33]。截至2018 年第一項繪制CTC擴散途徑并表征局部腫瘤患者CTC的綜合研究中，科研人員發(fā)現(xiàn)不同血管部位的CTC在上皮和間充質(zhì)組成上表現(xiàn)出空間異質(zhì)性，這將有助于揭示HCC轉(zhuǎn)移的新機制[34]。Li等[35]推測，門靜脈腫瘤血栓可能是CTCs全身擴散的結(jié)果，是微轉(zhuǎn)移形成的基礎(chǔ)；并且推測CTCs中的Twist和Vimentin表達可能是評估轉(zhuǎn)移的臨床早期預(yù)測因子。有研究甚至表明CTC計數(shù)與血管浸潤程度呈正相關(guān)，其預(yù)測HCC轉(zhuǎn)移的敏感度和特異度分別為82.93%和52.38%[36]。而根治性手術(shù)后CTC計數(shù)≥3、負荷持續(xù)升高可能反映著肝外微轉(zhuǎn)移的存在[37]。HCC早期即可發(fā)生肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移，并且切除術(shù)后5年腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高達40%～70%，這可能與手術(shù)前存在的微小播散灶或多中心發(fā)生有關(guān)[26]。通過CTC對HCC患者的分析，我們可評估患者術(shù)前有無發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，從而為其提供最優(yōu)化的治療手段。另一方面，相較于AFP，CTC在患者術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面更具有顯著的預(yù)測價值。如果將這兩者進行聯(lián)合監(jiān)測，將有利于提高HCC患者肝切除術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測效果[38]。

6 CTC對HCC患者預(yù)后的預(yù)測與評價

預(yù)后評估是患者經(jīng)系統(tǒng)治療后的關(guān)鍵步驟之一，其重點在于尋找預(yù)測指標(biāo)，CTC是HCC患者預(yù)后指標(biāo)的佼佼者。Meta分析則充分證明了HCC患者中CTC陽性者的OS要低于陰性者[39]。Liu等[40]在2013 年開發(fā)出基于高核質(zhì)比的新型CTC檢測方法，可用于高敏感性HCC患者的預(yù)后預(yù)測，特別是在短時間內(nèi)評估患者是否會復(fù)發(fā)。通過隨訪數(shù)據(jù)分析，有學(xué)者認為其臨界值在CTC計數(shù)≥3[37]、≥5[38]，此外還有各種CTC亞型，例如glypican-3陽性CTC[41]、Nanog CTCs[42]、CTC-WBC集群[43]等。并且，Twist+CTC[33]、M-CTC[44]或聯(lián)合Ki-67[45]的預(yù)后評估要優(yōu)于單獨的CTC。CTC狀態(tài)及超聲組學(xué)評分[46]和術(shù)前CTC-NLR[47]則分別被視為HCC患者根治后早期復(fù)發(fā)（ER）和OS的預(yù)測因素。在肝移植方面，截至2021年誕生了第一項全面評估肝移植術(shù)后HCC患者圍手術(shù)期CTC檢測臨床意義的研究，結(jié)果表明CTC計數(shù)是預(yù)測HCC患者肝移植后復(fù)發(fā)的一個有用的生物標(biāo)志物，移植后連續(xù)監(jiān)測CTC計數(shù)可能提供比單獨使用傳統(tǒng)監(jiān)測方法更早的治療干預(yù)機會[48]。同樣，有研究發(fā)現(xiàn)術(shù)前EpCAM+CTC檢測以及術(shù)前和術(shù)后第1天EpCAM+/CD90+CTC檢測可預(yù)測活體肝移植（LD-LT）后HCC患者的復(fù)發(fā)，并可指導(dǎo)其術(shù)后監(jiān)測和免疫抑制[49]。

7 小結(jié)與展望

傳統(tǒng)的腫瘤確診“金標(biāo)準(zhǔn)”仍舊是依靠細胞組織病理活檢，但該方法存在著很多問題，如創(chuàng)傷性大、取材困難等缺點。相對而言，CTC具有無創(chuàng)、實時、方便、快捷、能夠持續(xù)監(jiān)測疾病的進程，以及對療效檢測、患者預(yù)后和復(fù)發(fā)情況進行判斷和評估等優(yōu)點，因此在未來對癌癥的診療中或許大有作為。但由于現(xiàn)階段檢測技術(shù)有待提升，暫時也沒有統(tǒng)一的檢測標(biāo)準(zhǔn)，我們還需要多中心、大樣本、足夠時長的隨訪，不斷積累足夠的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)來支撐CTC在HCC臨床診療中的實際應(yīng)用。