附睪中非編碼小RNA（sncRNA）的研究進(jìn)展

許嬌霞，張家新，周 璇，何小龍

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

許嬌霞，張家新，周 璇，等.附睪中非編碼小RNA（sncRNA）的研究進(jìn)展［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2023，44（2）：61-65.

精子在睪丸生成后，經(jīng)附睪頭運(yùn)輸?shù)礁讲G尾的過(guò)程中，發(fā)生了形態(tài)、胞質(zhì)和細(xì)胞核的變化，結(jié)構(gòu)不斷完善，最終獲得運(yùn)動(dòng)能力和受精能力［1］。精子功能上的轉(zhuǎn)化并不是由其內(nèi)部機(jī)制決定的，而是由精子經(jīng)過(guò)附睪所遇到的外在因素所致，即附睪微環(huán)境。附睪上皮細(xì)胞和精子之間的通訊方式比較特殊，附睪通過(guò)主細(xì)胞的分泌作用將蛋白、非編碼RNA （ncRNA）選擇性地積聚到細(xì)胞外囊泡中，即附睪小體，而后由附睪小體運(yùn)送至精子［2］，因此，精子在經(jīng)過(guò)附睪時(shí)會(huì)被不斷修飾進(jìn)而達(dá)以成熟［3］。

ncRNA 是一個(gè)龐大而又異質(zhì)的RNA 家族，它們沒(méi)有被翻譯成蛋白質(zhì)，以RNA 的形式直接發(fā)揮作用，從基因表達(dá)調(diào)節(jié)、基因組防御到表觀遺傳［4］。ncRNA 在生物領(lǐng)域的多個(gè)方面具有重要作用，如在人類腫瘤、非腫瘤等方面的疾病治療，在動(dòng)物胚胎發(fā)育、肌肉生長(zhǎng)、脂肪沉積、免疫應(yīng)答及皮膚毛囊調(diào)控等領(lǐng)域［5］?？筛鶕?jù)ncRNA 的大小將其分為兩類：>200 nt 的為非編碼的長(zhǎng)RNA（lncRNA），lncRNA 對(duì)轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯、蛋白質(zhì)定位、細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性、基因組印記、細(xì)胞周期和凋亡等重要的生物學(xué)過(guò)程至關(guān)重要［6］；<40 nt 的為非編碼小RNA （sncRNA），sncRNA 通常在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上沉默RNA 來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)。sncRNA 不僅可以建立和調(diào)節(jié)組織自身的基因表達(dá)模式，且對(duì)于調(diào)節(jié)精子中父系表觀遺傳信息及后代的發(fā)育也有著至關(guān)重要的作用［7］。同時(shí)sncRNA 中的微RNA （miRNA）PIWI 蛋白相互作用蛋白（piRNA）、tRNA 源性片段（tRF）及來(lái)源于28S rRNA 的新小RNA（rsRNA-28S）在調(diào)控雄性生殖方面作用扮演重要角色。到目前為止，研究最多的是miRNA，它在哺乳動(dòng)物附睪中起關(guān)鍵調(diào)控作用，可以與內(nèi)分泌信號(hào)協(xié)同調(diào)控附睪不同節(jié)段的基因差異表達(dá)，且高度保守［8］。此外，最新研究表明，sncRNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用以及對(duì)精子成熟的影響都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)上皮細(xì)胞中的穩(wěn)態(tài)基因［2］。鑒于此，該文將對(duì)附睪上皮和精子中sncRNA 的調(diào)控功能展開論述。

1 附睪

附睪是一條長(zhǎng)而彎曲的小管，附睪的上皮組織是由不同類型的細(xì)胞組成，包括主細(xì)胞、基底細(xì)胞、亮細(xì)胞、暈細(xì)胞和頂細(xì)胞，主細(xì)胞最多，約占整個(gè)附睪管上皮細(xì)胞的80%。附睪可根據(jù)其節(jié)段分為三部分：頭、體、尾。在附睪頭和附睪體內(nèi)，主細(xì)胞具有蛋白質(zhì)合成和分泌的能力。附睪每個(gè)區(qū)域的上皮形態(tài)、管腔直徑和管腔環(huán)境都有所不同，這要?dú)w因于特定區(qū)域基因的不同表達(dá)。Browne 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，人附睪上的miRNA 可調(diào)控附睪的區(qū)域化基因的表達(dá)和功能。此外，在激素的調(diào)節(jié)下，不同發(fā)育階段對(duì)附睪的組織結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)也會(huì)產(chǎn)生顯著的影響［10］。這種嚴(yán)格把控基因的時(shí)空表達(dá)特性揭示了附睪中有著嚴(yán)格而又多層次的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)涉及轉(zhuǎn)錄因子、sncRNA 和DNA 甲基化。

在睪丸形成但并未成熟的精子進(jìn)入附睪后，附睪管腔內(nèi)環(huán)境通過(guò)直接分泌或附睪小體運(yùn)輸來(lái)介導(dǎo)上皮細(xì)胞和精子之間蛋白質(zhì)或RNA 的轉(zhuǎn)移和交換［11］。附睪小體釋放后，與鄰近的上皮細(xì)胞相互作用，進(jìn)行旁分泌調(diào)節(jié)，從而對(duì)精子成熟產(chǎn)生間接影響［12］。另外，附睪小體還可以通過(guò)向精子傳遞復(fù)雜的蛋白質(zhì)和脂類對(duì)精子的成熟產(chǎn)生更直接的影響，這些相互作用涉及選擇性黏附和瞬時(shí)融合機(jī)制，最終導(dǎo)致精子膜結(jié)構(gòu)和胞質(zhì)的成分發(fā)生顯著變化。大多數(shù)附睪小體中的蛋白在精子通過(guò)附睪過(guò)程中轉(zhuǎn)移到精子亞細(xì)胞或膜結(jié)構(gòu)域，參與受精能力的獲得、運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)和氧化應(yīng)激的保護(hù)［13］。而后Gay 等［14］還使用標(biāo)記硫脲嘧啶滲入法（TU）檢測(cè)小鼠附睪上新合成RNA 的轉(zhuǎn)移情況，并通過(guò)SLAM-Seq 的方法對(duì)新合成的RNA 進(jìn)行了標(biāo)記和測(cè)序，研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了sncRNA 就是由附睪上皮產(chǎn)生的附睪小體轉(zhuǎn)移至精子上的［2］。在附睪腔環(huán)境中，附睪小體可將miRNA［11］、tRF［2］及rsRNA-28S 包裹并攜帶，從而介導(dǎo)上皮細(xì)胞和精子之間sncRNA 的傳遞作用于精子［11］。

2 附睪中sncRNA 的表達(dá)特征

大多數(shù)sncRNA 都是通過(guò)調(diào)控靶基因發(fā)揮其功能的。例如miRNA 先是與RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體RISC 結(jié)合，然后抑制靶基因mRNA 的翻譯或者切斷堿基配對(duì)直接到達(dá)3′非翻譯區(qū)（3′-UTR），從而達(dá)到沉默基因的效果。由于miRNA 序列通常不能與靶序列完美互補(bǔ)，因此，每個(gè)miRNA 都可能有數(shù)百個(gè)靶向mRNA［15］，類似的調(diào)控機(jī)制也被證明適用于piRNA 和tRF。

在人類等物種的附睪中應(yīng)用微陣列和高通量測(cè)序的方法已經(jīng)鑒定出幾百個(gè)miRNA 的復(fù)雜圖譜［10］，其中一些miRNA 顯著富集于附睪或是附睪特有的。在小鼠、大鼠和人附睪組織的所有區(qū)域中有79 個(gè)miRNA（約占所有miRNA 的21%）均具有保守性［8］。據(jù)估計(jì)在人類和小鼠細(xì)胞中，tRF 群體含有150 多個(gè)不同序列的tRF，表達(dá)量顯著高于在同一組織中大多數(shù)的miRNA。而且tRF 在附睪尾部的成熟精子中大量積累而成為主要的sncRNA 種群，因此，tRF 在男性生殖健康領(lǐng)域至關(guān)重要［16］。而piRNA 在成熟精子的sncRNA 譜中占到17%［17］，這些研究發(fā)現(xiàn)提示sncRNA 可能在維持附睪內(nèi)環(huán)境平衡中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。而且sncRNA 發(fā)揮作用時(shí)對(duì)mRNA 的互補(bǔ)性要求低，所以每個(gè)sncRNA 都可能調(diào)控許多功能上無(wú)關(guān)靶基因的表達(dá)。

哺乳動(dòng)物附睪中sncRNA 的表達(dá)還具有時(shí)空性。例如在小鼠［8］、大鼠［18］、人［9］、馬的上皮細(xì)胞中，miRNA 家族表現(xiàn)出一定程度的區(qū)域表達(dá)模式。例如在馬的附睪頭、附睪體近端和遠(yuǎn)端、附睪尾分別檢測(cè)到11 個(gè)、6 個(gè)、8 個(gè)、19 個(gè)miRNA，這說(shuō)明附睪區(qū)域之間的miRNA 譜存在差異［19］。在某些情況下，miRNA 豐度的節(jié)段性變化明顯，例如在小鼠中從附睪頭到附睪尾miR-204-5p 降低了39 倍，miR-196b-5p 升高了45 倍［8］。miR-573 和miR-155 在人的附睪頭大量表達(dá)，而在附睪尾miR-1204 和miR-770 大 量 表 達(dá)［9］。而 且 附 睪 中 的miRNA 還會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而發(fā)生變化，例如人的新生兒附睪中miRNA 的表達(dá)最高，隨著生長(zhǎng)發(fā)育逐漸降低［10］。Chu 等［7］還對(duì)青年小鼠和老年小鼠附睪中的sncRNA 進(jìn)行了比較，觀察到：隨著年齡的增長(zhǎng)，附睪中miRNA 比例下降，tRF 和piRNA比例增加，因此，sncRNA 在附睪不同節(jié)段的差異表達(dá)對(duì)附睪形成獨(dú)特的節(jié)段性微環(huán)境具有重要的調(diào)控作用。

為了觀測(cè)小鼠精子從形成到成熟過(guò)程中sncRNA 的變化，Chu 等［7］將睪丸中生精細(xì) 胞與附睪頭和附睪尾中精子的小RNA 圖譜進(jìn)行了整合，發(fā)現(xiàn)精子進(jìn)入附睪后，精子上piRNA 的高比例轉(zhuǎn)變?yōu)閠RF 和rsRNA-28S 的高比例［20］。精子轉(zhuǎn)錄停止的特性，很有可能是這種附睪中sncRNA 含量變化和腔環(huán)境相互作用的結(jié)果。而附睪尾中成熟的精子存在piRNA 的序列，這一發(fā)現(xiàn)揭示了精子在經(jīng)過(guò)附睪時(shí)，附睪液中的sncRNA 對(duì)其進(jìn)行了修飾［2，20］。最近Hutcheon 等［17］研究發(fā)現(xiàn)piRNA 不同于其他類型的sncRNA，精子尾部上的piRNA并不是從附睪上獲得的，因?yàn)楦讲G上并不存在piRNA，而且附睪小體中所包含的piRNA 也很少，因此，附睪和精子的體外共孵不會(huì)使得piRNA 的大量轉(zhuǎn)移［2］。所以附睪小體不太可能解釋附睪尾部成熟精子中piRNA 的積累。鑒于此，引發(fā)了科學(xué)家們的另外一種推測(cè)，即精子可能含有piRNA前體轉(zhuǎn)錄物，用于piRNA 的合成［17］。綜上所述，附睪上皮細(xì)胞中sncRNAs 的多樣性及其表達(dá)水平的時(shí)空差異會(huì)影響許多潛在的靶基因，這些基因在很大程度上與哺乳動(dòng)物的生理和病理過(guò)程有關(guān)。

3 sncRNA 對(duì)附睪上皮功能的影響

在附睪上皮細(xì)胞中，miRNA 占總sncRNA 的最大比例，可調(diào)控組織的發(fā)育，還參與了附睪節(jié)段高度區(qū)域化基因表達(dá)的建立和維持。例如miR-34和miR-449 可調(diào)控附睪輸出小管中纖毛的分化，一旦將其敲除，纖毛缺失引發(fā)精子凝集、管腔阻塞，最終導(dǎo)致雄性不育［21］。不同物種的附睪中，miRNA 表達(dá)的時(shí)空性與其靶基因mRNA 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)［10，18］。在人類附睪中，隨著年齡的增長(zhǎng)，附睪中的miRNA 隨著靶向mRNA 的增加而減少［10］。大鼠附睪中的miR-335、miR-29a 和miR-200家 族 表 現(xiàn) 出 與 靶 基 因RASA1、NASP、TCF8 和CTNNB1 相反的時(shí)空表達(dá)模式［18］，這些miRNA 主要參與對(duì)附睪上皮細(xì)胞增殖和附睪發(fā)育的調(diào)控。此外，miR-200 家族在成年大鼠附睪頭上比附睪尾上優(yōu)先表達(dá)。miR-200 家族還有很多功能，例如細(xì)胞的抗凋亡作用和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)［18］。

附睪中的miRNA 也參與應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控，有研究敲除小鼠附睪頭區(qū)域Dicer1（一種負(fù)責(zé)miRNA 成熟的關(guān)鍵酶）后發(fā)現(xiàn)，Dicer1 的局部敲除導(dǎo)致上皮細(xì)胞去分化、類固醇激素信號(hào)和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)失去平衡［22］，Dicer1 還參與β-防御素基因亞群的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這些基因是編碼附睪抗菌防御系統(tǒng)的關(guān)鍵元素［23］。Zhang 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，miR-7578 還可以抑制炎癥。除了miRNA，附睪中其他的sncRNA對(duì)應(yīng)激反應(yīng)也有一定的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，piRNA 中的PIWI1 和PIWI2 在老年小鼠的附睪中具有很高的表達(dá)，通過(guò)沉默其附睪頭上抗氧化基因GPX5，促發(fā)氧化應(yīng)激使得piRNA 顯著下降，繼而引起其靶基因表達(dá)的升高［25］。此外，還發(fā)現(xiàn)在發(fā)生感染或炎癥時(shí)，tRF 和rsRNA-28S 的表達(dá)水平也會(huì)隨之改變，這些研究結(jié)果表明sncRNA 參與應(yīng)激反應(yīng)［20］。而后續(xù)的研究表明，暴露于多種應(yīng)激環(huán)境下的附睪，其精子和附睪小體的sncRNA 分布也會(huì)受到影響［26］。

4 sncRNA 對(duì)附睪精子功能的影響

附睪miRNA 除了在上皮細(xì)胞中調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的原位效應(yīng)外，還可以通過(guò)附睪小體釋放到附睪管腔中，然后與其他上皮細(xì)胞或精子產(chǎn)生效應(yīng)。附睪中的一些miRNA 還會(huì)選擇性地富集在附睪小體上，例如miR-202、miR-204 和miR-1224等［19］。這些附睪小體上攜帶的miRNA 被證明是細(xì)胞間的通信介質(zhì)，且參與附睪基因表達(dá)的旁分泌調(diào)節(jié)［11］。而當(dāng)這種附睪通過(guò)附睪小體向精子轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程受到影響時(shí)，例如生殖道炎癥，這會(huì)影響精子獲得tRF 和rsRNA-28S［20］，同樣很多研究表明，輸精管切除術(shù)后逆轉(zhuǎn)和少精子癥患者，附睪中附睪小體攜帶的sncRNA 不進(jìn)行傳遞［27］。由此可見，附睪分泌的sncRNA 在醫(yī)學(xué)上也可作為診斷某些雄性生殖疾病的指標(biāo)。

附睪小體攜帶著由附睪合成的sncRNA（包括miRNA、tRF 以及rsRNA-28S）轉(zhuǎn)移至經(jīng)過(guò)的精子上，然后精子將這些重要的表觀遺傳信息傳遞給合子，參與早期胚胎的調(diào)控，并對(duì)后代的發(fā)育有很大的影響［19］。研究發(fā)現(xiàn)，將附睪頭的精子與卵子結(jié)合后，合子很快死亡，但將附睪尾特定sncRNA 純化后注射到合子內(nèi)，可以避免致死，這一研究進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了精子在附睪運(yùn)輸過(guò)程中獲得sncRNA 重要的生物學(xué)意義［28］。父本的代謝異常會(huì)影響sncRNA 的含量，尤其是精子中tRF，可通過(guò)調(diào)節(jié)胚胎早期發(fā)育的代謝基因表達(dá)作為補(bǔ)償，從而降低父本的代謝異常給后代帶來(lái)的不利影響［29］。男性生殖道的炎癥也會(huì)改變成熟精子中的sncRNA，例如tRF 和rsRNA-28S，這可能是一種父本傳遞給后代的免疫表觀遺傳信息［20］。

miRNA 在調(diào)節(jié)精子成熟方面也起到關(guān)鍵的作用。附睪上皮細(xì)胞中miRNA 譜在區(qū)域差異性表達(dá)，而miRNA 還可通過(guò)附睪小體從附睪上皮運(yùn)輸?shù)骄?，這提示miRNA 不僅參與附睪功能的調(diào)控作用，還可調(diào)控精子的成熟。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)馬附睪尾部的精子多了66 個(gè)新獲得的miRNA，例如miR-122、miR-388、miR-128 和miR-376a 等，經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)它們的靶向途徑對(duì)精子成熟都具有影響作用［19］。研究發(fā)現(xiàn)，將雄性小鼠miR-7a2 敲除后，其精子活力低且不育［29］。Ni 等［30］嘗試將人工合成的miRNA模擬物（agomir）注射到成年大鼠的附睪尾中，發(fā)現(xiàn)這會(huì)引起一系列分子變化，如附睪中羧酸酯酶CES7 mRNA 和蛋白的表達(dá)顯著降低，這些變化導(dǎo)致精子獲能缺陷，從而影響了精子的成熟?；谶@些研究，通過(guò)條件性敲除Dicer1 后，機(jī)體喪失生育能力［25］，由此可見miRNA 對(duì)精子成熟起著至關(guān)重要的作用。

5 結(jié)語(yǔ)

越來(lái)越多的研究表明，sncRNA 對(duì)于附睪功能和精子在附睪的成熟發(fā)揮著重要作用。這些發(fā)現(xiàn)突出了附睪組織及其管腔中sncRNA 的生物意義，有助于對(duì)附睪精子成熟過(guò)程、雄性不育有更深入的了解，為提高雄性動(dòng)物繁殖效率提供依據(jù)。