根際促生菌對鹽分脅迫下玉米生長的影響

唐古藞山，李 昂，周文林，吳婷婷，侯 爽，侯亞玲，2，曾文治，2

（1.武漢大學水利水電學院，武漢 430072；2.武漢大學水資源與水電工程科學國家重點實驗室，武漢 430072）

0 引言

土壤鹽堿化是一個世界性難題，全球鹽堿地面積約為9.5億hm2，約占地球面積的10%。我國鹽堿地面積約為0.99 億hm2，鹽漬化耕地面積約為0.076 億 hm2，約占總耕地面積的5%[1]。新疆地區(qū)地處內陸，擁有大面積耕地，然而，氣候因其獨特的“三山夾兩盆”地形而終年干燥，故耕地鹽漬化嚴重，土壤肥力低。因此，改善耕地鹽堿化問題，提高鹽堿耕地糧食作物產(chǎn)量，對西北旱區(qū)農業(yè)可持續(xù)發(fā)展和我國的糧食安全戰(zhàn)略有著重要意義。當前國內擁有的鹽堿化土壤防治技術主要有水利改良、物理改良和化學改良等。以上措施于實際生產(chǎn)中在特定條件下可有效改善或緩解土壤鹽漬化的現(xiàn)狀。然而，針對西北偏遠內陸地區(qū)，水利改良技術因其措施工程量大，水資源消耗過大，并且可能產(chǎn)生廢水處理等難題，經(jīng)濟性差[1]；物理方法常使用填土覆蓋等方法處理鹽堿地，只能一定程度上緩解鹽漬化，不能徹底解決問題；而化學方法改良較難避免耕地的二次污染。目前，微生物改良技術因其兼顧高效、因地制宜和良好的經(jīng)濟性等特點，成為近年來國內外鹽漬土改良的新方向[2]。

植物—土壤—微生物之間的相互作用很早就為人們所關注。植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是定殖于植物根際的一類細菌，能通過各種作用促進植物生長[3]。眾多學者研究發(fā)現(xiàn)PGPR 可提高作物抗旱，間接或直接提高作物抗鹽堿等逆境生存能力，可有效消除或減輕鹽分脅迫下對作物的有害影響，具有調節(jié)作物生理特性和促進作物生長的能力[4]。因此通過使用微生物改善作物生長微環(huán)境，同時結合研究區(qū)土壤鹽堿化的實際情況，調節(jié)鹽堿地土壤水鹽運移，提高作物耐鹽性。因此，對于西北旱區(qū)鹽堿地改良而言，開展PGPR 相關研究具有重要意義，有研究表明，PGPR 可促進作物吸收K+等，并使得Na+的吸收減少，從而提高作物的耐鹽能力[5]。根據(jù)莫文萍等的研究，PGPR 還能促進鹽堿地中作物的平均根長和莖長[6]；另外，對于緩解高鹽分對作物的毒害，提高作物的滲透調節(jié)能力，PGPR 也表現(xiàn)出較積極的影響[7]。上述研究表明，PGPR 不僅能夠提高鹽堿土地區(qū)作物的株高和莖長等表觀指標，還能促進根系吸收養(yǎng)分的能力和作物的滲透調節(jié)能力。然而，已有研究大多關注單一PGPR 對某些特定鹽分脅迫水平下作物生長的影響，較少考慮在不同的鹽分脅迫下，不同類型PGPR 對作物生長的影響。因此，本文以玉米為試驗作物，設置4 個不同鹽分水平（1.7、2.5、3.8、5.9 dS/m；記為S1、S2、S3、S4），2 種根際促生菌[枯草芽孢桿菌bacillus subtilis（BS）；巨大芽孢桿菌bacillus megaterium（BM）]和對照組（CK，不添加根際促生菌），開展室內盆栽實驗，以期為我國西北旱區(qū)鹽堿土的微生物改良提供理論依據(jù)與實用工具。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

室內盆栽試驗于湖北省武漢市武漢大學農田水利與水環(huán)境實驗室（30.54°N，114.36°E）進行。該實驗室通風條件良好，室內氣壓與室外氣壓一致（102 kPa），盆栽場地上方1.8 m處配備有植物生長鈉燈，可模擬田間常規(guī)日照強度。

1.2 試驗設計

以玉米為研究對象，添加根際促生菌的處理中，玉米種子經(jīng)75%的無水乙醇滅菌30 s，10%的次氯酸鈉溶液消毒15 min，隨之用無菌水沖洗3～4 次，然后在無菌水中過夜浸泡12 h，最后將種子在OD600=0.8 的細菌懸浮液中浸種2 h，對照組（CK）采用磷酸緩沖液浸種2 h。設置4 個鹽分水平，其飽和土壤浸提液的電導率（ECe）分別為1.7、2.5、3.8、5.9 dS/m，記為S1、S2、S3、S4；選用2 種根際促生菌，枯草芽孢桿菌bacillus Subtilis（BS） 和巨大芽孢桿菌bacillus megaterium（BM），同時設置無根際促生菌的對照組（CK）；土壤均經(jīng)120 ℃、30 min 高壓滅菌鍋反復滅菌2 次，每個處理設置3 盆重復試驗，每盆合理密植3 粒玉米種子，共計36 個試驗處理。在整個試驗過程中，通過稱重法使土壤的含水量為田間持水量的80%，發(fā)芽第7天，在根部注射5 mL的細菌懸液（OD600=0.8），對照處理注射5 mL的磷酸緩沖液。

1.3 觀測指標與方法

在拔節(jié)期（5～6片葉，莖節(jié)總長度2～3 cm）結束試驗，對玉米的株高、葉面積以及作物鮮重(地上部)進行測量。具體而言，利用直尺（精度為0.1 cm）測量玉米的株高和葉面積，測量時統(tǒng)計同一盆中長勢中等的3株指標，測定完株高和葉面積及時收取玉米幼苗，并測量玉米鮮重，精確至5位有效數(shù)字。

葉面積指數(shù)LAI計算[8]如下：

式中：0.75為葉面積的折減系數(shù)；ρ種為種植密度；L為葉片長軸最大長度；B為葉片短軸最大長度；m為測定株數(shù)。

此外，取生長點以下第2 或第3 片完全展開的功能葉，用純水沖洗表面，剪刀剪碎并加入預先用純水洗凈的100 mL 試管中，搖晃試管數(shù)下，用電導儀測定空白電導率（EC1）；將試管蓋嚴，靜置1 d，再測定24 h 后的初始電導率（EC2）；然后將試管密封，用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌25 min，殺死植物細胞，取出試管使其冷卻，充分搖晃，測定其高溫滅菌后電導率（EC3）。根據(jù)下式計算其電解質的滲透率（Sr）[9]：

與此同時，還需要測量根系的Na+和K+含量。具體而言，采用火焰光度法，以空白試劑溶液為參比稱取0.5 g 的葉片，放入SX-12-10型箱式電阻爐里進行烘干，烘干后加入5 mL蒸餾水再進行過濾，取得過濾清液，在型號為FP6410 的火焰光度計上分別以鈉濾色片和鉀濾色片測出Na+和K+的含量。

2 結果與分析

2.1 根際促生菌對不同鹽脅迫下玉米生長指標的影響

2.1.1 拔節(jié)期株高

在不同鹽分水平下，接種根際促生菌均能夠增加玉米拔節(jié)期的株高（見表1）。以不同鹽濃度下的各實驗處理玉米株高的均值為例，與對照組（CK）相比，在鹽分水平為S1、S2、S3和S4土壤中添加根際促生菌BS能夠使玉米株高分別增加8.63%、8.10%、7.01%和5.04%，而添加根際促生菌BM 能夠使玉米株高分別增加11.10%、0.54%、12.77%和2.59%。但是，僅在鹽分水平為S1 和S3 時，BM 處理與CK 存在顯著性差異，其他鹽濃度與處理組合中，添加根際促生菌后，玉米拔節(jié)期株高與CK相比，均不存在顯著性差異。

表1 各處理玉米生長指標Tab.1 Maize growth index of each treatment

此外，在不同的鹽分水平下，2種根際促生菌對玉米株高的影響不同。在鹽分水平為S1 和S3 時，BM 處理的株高大于BS 處理，而在鹽分水平為S2 和S4 時，BS 處理的株高大于BM處理（見表1）。但在4種鹽分水平下，BM 處理與BS處理的玉米拔節(jié)期株高均沒有顯著差異。

另一方面，鹽分與添加根際促生菌對玉米拔節(jié)期株高的影響存在交互效應（見圖1）。例如添加BS 和BM 處理中，玉米拔節(jié)期株高的分布范圍均較大，其極差分別為6.17 cm 和7.10 cm。而在鹽分水平S1至S4處理中，玉米拔節(jié)期株高的極差分別為2.69 cm、5.16 cm、7.27 cm 和6.87 cm。此外，鹽分水平S2時，玉米拔節(jié)期株高整體較其余3個鹽分水平偏低。

圖1 不同根際促生菌和鹽分處理下玉米拔節(jié)期株高的分布狀況Fig.1 Distribution of maize plant height at jointing stage under different rhizosphere growth-promoting bacteria and salt treatments

2.1.2 拔節(jié)期鮮重

與株高類似，接種根際促生菌能夠在不同的鹽分水平下增加玉米拔節(jié)期的鮮重（見表1），與對照組（CK）相比，當鹽分水平為S1、S2、S3和S4時，施用促生菌BS能夠使玉米平均鮮重分別增加4.46%、22.10%、24.09%和6.84%，而添加了促生菌BM 能相對應地使玉米平均鮮重增加11.76%、16.85%、10.58%和7.03%。但是，當鹽分水平為S1 和S4 時，BS 與BM處理對玉米平均鮮重的增加效應與CK 相比均不顯著；當鹽分水平為S2 時，BS 與BM 處理均顯著增加玉米平均鮮重；而當鹽分水平為S3時，僅BS處理顯著增加玉米的平均鮮重。

此外，鹽分水平為S1 時，BM 處理的平均鮮重大于BS 處理，這與株高的規(guī)律一致；但是在鹽分水平為S2和S3時，BS處理的平均鮮重大于BM處理，并隨著鹽分水平的增加，BS與BM 處理的平均鮮重逐漸接近（S4）。與株高一致，在4種鹽分水平下，BM處理與BS處理的玉米拔節(jié)期鮮重平均值都沒有顯著差異（見表1）。

盡管鹽分與添加根際促生菌對玉米拔節(jié)期鮮重的影響同樣存在交互效應（見圖2），但是BM 處理的極差顯著低于BS處理。具體而言，BM 處理中鮮重的極差為0.89 g/株，而BS處理中鮮重的極差高達2.65 g/株，是BM 處理的297.75%。而在鹽分水平S1至S4處理中，玉米拔節(jié)期鮮重的極差分別為1.13、1.71、2.17和1.54 g/株。與株高的規(guī)律相反，在S2處理中，玉米的拔節(jié)期鮮重整體上偏大。

圖2 不同根際促生菌和鹽分處理下玉米拔節(jié)期鮮重的分布狀況Fig.2 Distribution of fresh maize weight at the jointing stage under different rhizosphere growth-promoting bacteria and salt treatments

2.1.3 拔節(jié)期葉面積指數(shù)

與前述2項指標不同的是，根際促生菌對玉米拔節(jié)期葉面積指數(shù)的影響沒有明顯規(guī)律（見表1）。與對照組（CK）相比，BS處理在鹽分水平為S1和S4時使玉米葉面積指數(shù)降低了4.55%和0.93%，而在鹽分水平為S2 和S3 時，卻使玉米葉面積指數(shù)增加了29.90%和39.33%；相對應地，在鹽分水平為S1、S3 和S4 時， BM 處理使玉米葉面積指數(shù)增加了9.10%、19.05%、2.80%，卻在鹽分水平為S2 時，使玉米葉面積指數(shù)降低了8.25%。

在4 種鹽分水平下，2 種促生菌對玉米拔節(jié)期葉面積指數(shù)的影響規(guī)律不同（見表1）。當鹽分水平為S1、S3 時，僅BM處理顯著增加了玉米葉面積指數(shù)；當鹽分水平為S2時，2種促生菌對玉米葉面積指數(shù)的影響均顯著，且具體表現(xiàn)為BS 處理顯著提高玉米葉面積指數(shù)，而BM 處理顯著降低了玉米葉面積指數(shù)；在鹽分水平為S4時，2種促生菌對玉米葉面積指數(shù)的影響均不顯著。

鹽分與添加促生菌對玉米拔節(jié)期葉面積指數(shù)的影響也存在交互效應（見圖3）。如BS 和BM 處理中的玉米葉面積指數(shù)分布范圍均較大并且BS 處理的極差（0.76）大于BM 處理（0.52）。而在鹽濃度處理S1、S2、S3 和S4 中，玉米拔節(jié)期葉面積指數(shù)極差分別為0.56、0.76、0.53、0.15。此外，在S4 處理中，玉米的葉面積指數(shù)分布較其余鹽分處理較為集中。

圖3 不同根際促生菌和鹽分處理下玉米拔節(jié)期葉面積指數(shù)的分布狀況Fig.3 Distribution of leaf area index(LAI)in maize at jointing stage under different rhizosphere growth-promoting bacteria and salt treatments

2.2 根際促生菌對不同鹽脅迫下玉米生理指標的影響

2.2.1 拔節(jié)期根系Na+/K+

在不同鹽分水平下，接種根際促生菌都能夠降低玉米拔節(jié)期的根系Na+/K+（見表2）。以不同鹽分水平下的各試驗處理的玉米根系Na+/K+均值為例，與對照組（CK）相比，在鹽濃度分別為S1、S2、S3、S4 時，BS 處理對根系Na+/K+的降低分別為7.00%、6.90%、5.14%、8.25%，而BM 處理對玉米根系Na+/K+的降低分別為11.00%、4.09%、17.07%、4.17%。但是在鹽分水平為S4時，BM 處理較對照組無顯著性差異，其余各鹽分與促生菌組合的處理都相較對照組具有顯著性差異。

在鹽分水平不同時，2 種促生菌對降低玉米拔節(jié)期根系Na+/K+的作用效果不同（見表2）。在鹽分水平為S1 和S3 時，BM 處理比BS處理對根系Na+/K+的降低作用更好；當鹽濃度為S2時，BS處理和BM處理對降低玉米根系Na+/K+的作用效果持平，具體表現(xiàn)為BS+S2和BM+S2 2個處理并無顯著性差異；當鹽分水平達到S4 時，BS 處理對玉米根系Na+/K+的降低作用仍然具有顯著性，而BM 處理則不能顯著地降低玉米根系Na+/K+。

表2 各處理玉米生理指標Tab.2 Physiological indexes of maize in each treatment

鹽分與添加促生菌對玉米拔節(jié)期根系Na+/K+的影響存在交互效應（見圖4）。2 種促生菌處理下的玉米根系Na+/K+的極差差別巨大，具體而言即BS處理的極差（8.16）顯著大于BM 處理的極差（5.29）。在鹽分處理S1 至S4 中，玉米根系Na+/K+的極差分別為6.78、5.33、2.62、4.73，S1 處理的玉米根系Na+/K+極差大于其余鹽分處理。

圖4 不同根際促生菌和鹽分處理下玉米拔節(jié)期根系Na+/K+的分布狀況Fig.4 Distribution of Na+/K+ in maize roots at jointing stage under different rhizosphere growth-promoting bacteria and salt treatments

2.2.2 拔節(jié)期葉片電解質滲透率

在各種鹽分水平下，根際促生菌對玉米拔節(jié)期葉片電解質滲透率的影響規(guī)律不一（見表2）。以不同鹽分水平下的各試驗處理的玉米葉片電解質滲透率均值為例，與對照組（CK）相比，在鹽分水平分別為S1 和S2 時，土壤中添加促生菌BS 使各處理玉米拔節(jié)期葉片電解質滲透率分別增加了21.4%、118.18%，而促生菌BM 使玉米葉片電解質滲透率增加了28.57%、54.55%；在鹽分水平為S3 時，BS 處理和BM 處理分別使玉米葉片電解質滲透率降低了11.11%和17.07%；在鹽分水平為S4 時，BS 處理使玉米葉片電解質滲透率增加了77.78%，而BM 處理使玉米葉片電解質滲透率降低了4.17%。

根際促生菌對玉米拔節(jié)期葉片電解質滲透率的影響無明顯規(guī)律，僅在S2和S4處理下，相較于對照組，BS處理能夠顯著提高玉米拔節(jié)期葉片電解質滲透率，其余鹽分處理和促生菌處理的組合均較對照組（CK）沒有顯著性差異。

鹽分與添加促生菌對玉米拔節(jié)期葉片電解質滲透率的影響存在明顯交互效應（見圖5）。BS 和BM 處理的玉米葉片電解質滲透率極差均很大，分別為0.215、0.204。在4 種鹽分處理中，玉米葉片電解質滲透率極差為0.15、0.34、0.22、0.24，在有鹽分脅迫的處理中（S2、S3、S4），葉片電解質滲透率極差均比無鹽處理（S1）的大。

圖5 不同根際促生菌和鹽分處理下玉米拔節(jié)期電解質滲透率的分布狀況Fig.5 Distribution of electrolyte permeability in maize at the jointing stage under different rhizosphere growth-promoting bacteria and salt treatments

3 討論

作物的產(chǎn)量和生長質量往往取決于關鍵生育期對水分和養(yǎng)分的吸收能力，作物在拔節(jié)期迅速長高，葉片迅速增大，該階段是玉米的關鍵生育期之一，玉米的株高、葉面積和根系生長生理指標則受到耕種土壤的鹽濃度等環(huán)境因素的影響。PGPR 作為一種可以改良土壤環(huán)境和根系的吸收養(yǎng)分能力的常見添加劑，在已有的研究中，應用于作物幼苗的促生效果在水稻[10]、辣椒[11]、番茄[12]、白菜[13]等諸多經(jīng)濟及非經(jīng)濟類作物中。在當前新疆盆地地區(qū)高鹽漬化現(xiàn)狀下，探索PGPR 在不同鹽脅迫條件下對作物的促生作用，可為旱作物生產(chǎn)提供技術參考。

相關研究表明：玉米拔節(jié)期作物株高、鮮重和葉面積迅速增大，對水分吸收要求很高[14]，玉米在受到鹽脅迫時，作物生長發(fā)育會受到抑制，主要體現(xiàn)在生長速度減緩等方面[15]。促生菌可通過促進作物幼苗體內對脯氨酸和糖類物質的積累，從而降低作物的滲透勢[16]，從根系中Na+和K+含量的比值可以看出，PGPR 使得根系細胞改變了對K+、Na+等重要離子的選擇性吸收，降低細胞滲透率，達到抗鹽的目的，這與孫韻雅[17]等的研究結果一致。

從作物的生長指標來看，本研究表明在鹽分脅迫下，接種枯草芽孢桿菌（BS）和巨大芽孢桿菌（BM），可提高玉米拔節(jié)期的株高和地上部分鮮重，這與已有的研究[18]一致；但是本文發(fā)現(xiàn)接種枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌對葉面積指數(shù)的影響并不隨著鹽分水平的升高呈現(xiàn)出規(guī)律性變化，并且從整體葉面積指數(shù)均值出發(fā)，反而無鹽脅迫（S1 處理）時，玉米的葉面積指數(shù)才最大。

此外，從鹽分與添加促生菌對玉米拔節(jié)期的各項指標的交互效應方面考慮，一方面，在各種鹽分水平下，2種促生菌表現(xiàn)出了不同的作用效果，如枯草芽孢桿菌（BS）對玉米拔節(jié)期鮮重和葉面積指數(shù)的促進作用更易受到鹽分水平變化帶來的影響（見圖2、圖3），在鹽分過高時，上述影響被削弱，而巨大芽孢桿菌（BM）則對增加玉米拔節(jié)期株高的作用更易受到鹽分水平的影響，在無鹽和中鹽脅迫時會更有效地增加玉米株高。另一方面，在有相同鹽分脅迫的條件下，2種促生菌對玉米拔節(jié)期的各項指標的影響也差異巨大，在鹽分脅迫程度較低（S2）時，促生菌BS 對玉米拔節(jié)期的株高和葉面積指數(shù)促進作用要優(yōu)于促生菌BM；在中鹽脅迫條件（S3）下，促生菌BS 對玉米拔節(jié)期的鮮重和葉面積指數(shù)促進作用要優(yōu)于促生菌BM，而BM 則在該條件下對玉米的株高增長促進效果更好；在土壤高鹽環(huán)境下，促生菌BM 反而對玉米拔節(jié)期的鮮重增加的促進作用更優(yōu)于促生菌BS。

提高根系對水分的吸收能力和耐鹽性是解決作物受鹽堿脅迫的重要途徑之一。玉米拔節(jié)期的生長指標和根系Na+/K+密切相關，本試驗中玉米根系Na+/K+與株高、地上部分鮮重變化基本同步，加入促生菌處理的玉米根系Na+/K+較對照組減少。有研究表明，鹽堿脅迫會影響植物對水分的吸收和利用[19]，而枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌2種促生菌能較好地活化土壤中難溶的K+，因此促進植物生長[20]，本試驗驗證枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌能促進植物生長，與上述研究結論相符，作物的根系由于受到鹽分脅迫作用，會因對多種離子（K+等）的轉運和吸收能力降低而降低養(yǎng)分吸收的效率[21]，從而影響作物株高等生長指標，而根際促生菌可以通過調節(jié)作物根系K+含量，降低作物根系細胞的滲透勢，使得作物能夠正常地吸收土壤中的水分。

從作物生理指標來看，2種促生菌均能有效降低玉米拔節(jié)期根系Na+/K+，但2 者對玉米拔節(jié)期葉片電解質滲透率的影響卻并未呈現(xiàn)出規(guī)律性變化。因此，促生菌對鹽脅迫下的玉米拔節(jié)期的各項指標的影響似乎局限于地下部分，較難造成葉片的生理改變。

此外，試驗結果表明，在S2 和S3 水平時，促生菌對作物株高與鮮重的增加效果極為明顯，說明相較于未施用促生菌的玉米，PGPR 能夠使低、中鹽脅迫下的玉米在拔節(jié)期更快地積累有機物、養(yǎng)分和水分等，說明本試驗2種促生菌對作物促生效果最大邊際鹽脅迫濃度介于鹽分水平S2 與S3 之間，本試驗研究結果可為鹽脅迫作物的微生物改良提供一定的理論依據(jù)。

4 結論

作為對以往針對西北鹽堿地促生菌對作物的影響的研究[6-8]的延展，本研究基于室內盆栽實驗，以枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌為研究對象，針對不同鹽分水平，分析根際促生菌對玉米生長的影響。主要取得以下研究結論。

（1）促生菌對鹽脅迫下的玉米拔節(jié)期生長指標（株高、鮮重）有較好的促進作用，并在低、中鹽分濃度時促進效果最佳，而對葉面積指數(shù)未發(fā)現(xiàn)顯著的規(guī)律性影響。

（2）促生菌對鹽脅迫下的玉米拔節(jié)期根系Na+/K+有較好的降低作用，但對葉片電解質滲透率未發(fā)現(xiàn)顯著的規(guī)律性影響。

（3）枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌對作物的不同指標影響結果略有不同，枯草芽孢桿菌對作物拔節(jié)期的生長生理指標總體水平有更大的促進作用，而巨大芽孢桿菌對玉米拔節(jié)期的生長生理指標的促進作用相較于枯草芽孢桿菌更穩(wěn)定，受鹽分水平的影響較小。