細胞焦亡在肝臟損傷中作用的研究進展①

孫 偉 劉杉杉 陸安法 羅 杰 高俊波 何思雨 （銅仁職業(yè)技術學院，銅仁 554300）

程序性細胞死亡（programmed cell death， PCD）在宿主生長發(fā)育以及抵抗外界因素干擾的過程中起重要的作用［1］。常見的PCD包括細胞凋亡、壞死、焦亡、鐵死亡、自噬和效應性細胞死亡等多種類型。其中，對于細胞凋亡的研究最為明確。然而，目前對細胞焦亡的研究尚處于起步階段，有待于更加廣泛和深入的研究［2］。細胞焦亡又被稱為炎癥細胞壞死，是一種新發(fā)現(xiàn)的PCD，主要以細胞腫脹、胞膜破裂、炎癥因子和細胞內(nèi)容物釋放為主要特征。細胞發(fā)生焦亡后，在致炎因子的刺激下，細胞會釋放大量的促炎因子IL-1β和IL-18［3］。肝臟作為機體內(nèi)最大的實質器官，具有維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、能量供應、維持新陳代謝、促進生長發(fā)育以及免疫調節(jié)等多種功能［4］。肝臟獨特的功能和解剖位置，使其對外源性物質高度敏感，因此成為各種有毒有害物質作用的靶點。病毒性肝炎、酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）、非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）以及中毒性肝病等多種肝臟疾病與細胞焦亡密切相關。本文主要對細胞焦亡激活的機制和細胞焦亡在肝臟相關疾病的研究進展進行綜述，以期為研究細胞焦亡在肝損傷致病機理的作用提供一定的參考。

1 細胞焦亡激活的機制

1.1 經(jīng)典途徑 在經(jīng)典細胞焦亡途徑中，主要依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）激活，炎癥小體起重要作用。炎癥體是一組蛋白質復合物，可被多種損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns， DAMPs）和病原相關分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）所識別，控制IL-1β和IL-18等促炎細胞因子的生成［5］。不同的炎癥小體所感知的內(nèi)外界刺激信號有所差異，但在各種因素的作用下具有招募并激活Caspase-1的作用［6］。黑色素瘤缺乏因子-2（absent in melanoma 2，AIM-2）和NLRC4識別具有特異性，分別與雙鏈DNA和菌體特異性蛋白相結合［7-8］。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）是由NLRP3、ASC和pro-Caspase-1三部分所組成，是目前研究最透徹的炎癥小體［9］。NLRP3可被細菌、病毒、DAMPs、穿孔素等多種因素激活［10-11］。NLRP1可以感知細菌細胞壁的組成部分胞壁酰二肽，在抵抗細菌感染中發(fā)揮作用［12］。

研究表明，Gasdermin家族蛋白D（GSDMD）是調節(jié)細胞焦亡的關鍵底物［13］。經(jīng)炎癥小體活化后的Caspase-1可將GSDMD裂解成22 kD和31 kD大小并具有活性的N端與C端片段，GSDMD-N可裂解細胞膜上含有磷脂酰肌醇/心磷脂的脂質體，在細胞膜上進行“打孔”［14］。同時，Caspase-1可完成對pro-IL-1β和pro-IL-18前體物質切割、成熟，形成具有活性的促炎因子IL-1β和IL-18。IL-1β和IL-18可穿過GSDMD-N在胞膜上形成的“孔道”分泌到細胞外，從而誘導炎癥反應的發(fā)生。NLRP1炎癥小體同樣具有激活經(jīng)典細胞焦亡路徑的作用，但GSDMD蛋白是否參與了NLRP1炎癥小體依賴的經(jīng)典細胞焦亡路徑尚不明確。

1.2 非經(jīng)典路徑 在非經(jīng)典細胞焦亡途徑中， 細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可直接與Capase-4/5/11結合，誘導細胞發(fā)生焦亡（圖1）。活化后的Caspase-4/5/11在將GSDMD裂解成N、C兩個片段的同時，可通過與NLRP3炎癥小體結合，進一步活化下游因子Caspase-1，最終將成熟的IL-1β分泌到細胞外。此外，Pannexin-1通道蛋白可在Caspase-4/5/11作用下，打開P2X7細胞膜通道并釋放ATP，在細胞膜上形成“孔洞”，誘導細胞發(fā)生焦亡。Pannexin-1通道蛋白激活后，可促進細胞內(nèi)K+離子釋放，進而激活NLRP3炎癥小體，同樣具有促進IL-1β分泌的效應［16］。無論是經(jīng)典途徑還是非經(jīng)典途徑，GSDMD蛋白的裂解都起到了十分關鍵的作用［17］。

圖1 細胞焦亡激活的模式圖［15］Fig.1 Patterns map of pyroptosis activation［15］

1.3 其他引起細胞焦亡激活的因子 最新研究表明，Gasdermin家族蛋白E（GSDME）同樣具有介導細胞焦亡的作用［18］。與GSDMD不同的是，GSDME可被細胞凋亡關鍵因子Caspase-3在特異位點進行切割，切割后的GSDME-N片段同樣具有穿透細胞膜的功能。Caspase-3在腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor，TNF-α）的作用下激活，誘導細胞發(fā)生凋亡。然而，如果該細胞可表達GSDME蛋白，那么細胞死亡方式會迅速轉向焦亡，甚至直接發(fā)生焦亡。在細胞中添加Caspase抑制劑或者將GSDME基因敲除和（或）降低，均會阻止細胞焦亡的發(fā)生。體內(nèi)試驗表現(xiàn)出相同的效果，化療藥物對GSDME基因敲除小鼠所產(chǎn)生的副作用會明顯降低［19］。通常認為，Caspase-3是細胞發(fā)生凋亡的重要標志物之一，這一發(fā)現(xiàn)將細胞凋亡和細胞焦亡兩種不同的PCD聯(lián)系在一起，對進一步探討細胞焦亡的發(fā)生機制具有重要作用。

2 細胞焦亡在肝臟損傷中的作用研究

細胞焦亡的發(fā)生有助于機體及時清除受損傷的細胞，然而過度的細胞焦亡可引起大量細胞死亡，造成嚴重的組織損傷，甚至會導致器官衰竭，與多種疾病的發(fā)生緊密關聯(lián)［20］。由于機體內(nèi)“肝-腸軸”的存在，菌群失調后腸道細菌代謝產(chǎn)物會進入肝臟，因此LPS是導致肝細胞焦亡發(fā)生的重要因素［21］。研究發(fā)現(xiàn)，細胞焦亡與病毒性肝炎、ALD、 NAFLD以及肝臟中毒等多種肝臟疾病有關，在肝臟損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［22］。因此，研究肝損傷過程中細胞焦亡發(fā)生的分子機制，對于闡明肝臟疾病發(fā)生的機制，尋找相關疾病的治療方案具有積極作用。

2.1 細胞焦亡與病毒性肝炎的關系 機體內(nèi)細胞焦亡與免疫調節(jié)之間的關系受到嚴格調控。然而，細胞過度發(fā)生焦亡會誘導機體出現(xiàn)強烈的免疫反應，引起大量細胞死亡，最終導致嚴重疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）可通過Caspase-1和Caspase-3兩種信號通路誘導細胞發(fā)生焦亡。HCV感染細胞及周圍細胞出現(xiàn)Caspase-1上調表達，這與HCV的發(fā)病機制密切相關。HCV RNA可直接誘導感染肝細胞內(nèi)NLRP3組裝和活化［23］。NLRP3激活后分泌的IL-18可刺激NK細胞合成IFN-γ，從而抑制HCV復制［24］。從發(fā)生焦亡的細胞中釋放出的DAMPs具有募集免疫細胞的功能，進而促進炎癥反應的發(fā)生［25］。現(xiàn)已證實，NLRP3激活后，肝臟枯否細胞分泌的IL-1β是HCV患者炎癥出現(xiàn)放大反應的來源。慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染可導致肝纖維化、肝硬化、肝功能衰竭以及肝癌［26］。HBV核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）參與細胞焦亡的發(fā)生。經(jīng)HBcAg治療的HBV患者外周血單核細胞IL-18的分泌顯著增加，而Caspase-1抑制劑可完全阻斷IL-18分泌。這與HBeAg陽性患者外周血單核細胞IL-18分泌量降低的報道基本一致［27］。YU等［28］發(fā)現(xiàn)，HBV通過抑制核轉錄因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）依賴的信號途徑，從而抑制NLRP3和IL-1β蛋白表達，同時能夠抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成。ROS作為細胞代謝的副產(chǎn)物，在調節(jié)信號傳導通路，應對細胞內(nèi)外環(huán)境變化起到重要作用［29］。ROS過度生成會破壞與抗氧化物質之間的平衡，最終導致機體出現(xiàn)氧化應激，進而造成細胞和組織損傷［30］。ROS水平的增加可促進炎癥小體和NF-κB等炎癥相關信號因子的釋放［31］。除了病毒性肝炎外，Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑也參與自身免疫性肝炎中。研究發(fā)現(xiàn)，人白細胞介素-1受體拮抗劑（rhIL-1Ra）可通過抑制NLRP3誘導的細胞焦亡信號通路，起到抑制肝臟炎癥發(fā)生的作用［32］。從細胞焦亡參與病毒性肝炎致病機理的角度出發(fā)，有望尋找出新的治療病毒性肝炎的有效措施。

2.2 細胞焦亡與ALD的關系 ALD是指由于酒精的大量攝入而造成的與肝損傷密切相關的一系列疾病。酒精過量攝入造成的ALD，與細胞焦亡等在內(nèi)的各種PCD密切相關。臨床上，ALD一般包括脂肪變性、纖維化、酒精性肝炎（alcoholic hepatitis，AH）、肝硬化和肝細胞癌［33］。先天性免疫細胞的激活、全身性炎癥的發(fā)生是ALD發(fā)病的主要因素。

RNA測序分析發(fā)現(xiàn)，Caspase-11/4激活后，活化的GSDMD可通過Caspase-11/4-GSDMD信號通路誘導細胞焦亡的發(fā)生，這可能是AH發(fā)病的機制之一［34］。有意思的是，在AH模型小鼠中，Caspase-1并未被激活，這有待于進一步驗證。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，采用抑制CCR2/5信號通路的藥物，可有效降低GSDMD裂解，有效緩解酒精對肝臟的損傷［34］。FU等［35］發(fā)現(xiàn)，通過抑制細胞焦亡的發(fā)生可緩解AH患者的臨床癥狀，并降低患病率。

ATP和可溶性尿酸等物質作為DAMP，可在酒精的作用下，從受損傷的原代肝細胞中釋放出來，并觸發(fā)炎癥小體依賴的炎癥因子的釋放［36-37］。細胞內(nèi)物質介導的細胞焦亡，具有刺激和維持ALD的炎癥反應循環(huán)狀態(tài)的作用。此外，殘留在肝細胞中的酒精代謝物也會促進ROS生成，導致線粒體功能發(fā)生障礙，從而增加肝細胞對炎癥細胞因子的敏感性［38］。從以上研究可知，降低或是抑制細胞焦亡的發(fā)生，對于緩解或治療ALD具有一定的積極作用。

2.3 細胞焦亡與NAFLD的關系 NAFLD是指在沒有大量攝入酒精、藥物或存在其他導致肝脂肪變性因素的情況下，脂質在肝臟組織內(nèi)積聚而誘發(fā)的炎癥脂肪性肝病，是一種與胰島素功能紊亂、遺傳關系緊密的代謝性肝損傷。NAFLD覆蓋了從單純性脂肪變性到脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）等廣泛的范圍，NASH可能導致肝臟出現(xiàn)纖維化，進一步發(fā)展成為肝硬化，并增加罹患肝癌的風險［39］。

NAFLD小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，骨髓源細胞和肝臟實質細胞中Caspase被激活，并逐漸出現(xiàn)炎癥反應和纖維化等病理變化［40］。其發(fā)病機理可能是肝細胞和免疫細胞釋放的脂肪酸和DAMP以及尿酸激活了NLRP3炎癥小體。研究表明，ROS對發(fā)生脂肪變性的肝細胞具有致命性損傷［41］。肝細胞受損后，線粒體結構完整性被破壞，會釋放出DNA、ROS和ATP等DAMPs，并可直接或間接與硫氧還蛋白結合蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）和P2X嘌呤受體7結合，從而激活NLRP3炎癥小體［42-43］。單純發(fā)生脂肪變性的動物很難觀察到活化的NLRP3，然而卻在NAFLD/NASH動物和人類模型多次得到證實［44］。越來越多的數(shù)據(jù)表明，細胞焦亡已經(jīng)成為聯(lián)系脂肪變性和NASH的紐帶［45］。細胞焦亡釋放的IL-1β對其他炎癥細胞因子的分泌具有級聯(lián)放大的效應，IL-1β信號通路介導的炎癥反應是導致肝臟發(fā)生炎癥、脂肪變性和纖維化等病變的關鍵分子，在NAFLD發(fā)病機制中起到重要作用［46］。然而，與細胞焦亡相關的另一種炎癥細胞因子IL-18在NAFLD/NASH疾病發(fā)展中起到了相反的作用。IL-18基因敲除后的小鼠肝臟中的糖異生基因表達水平明顯較高，更易患肥胖癥、貪食癥并對胰島素具有一定的抵抗作用［47］。細胞焦亡與NAFLD/NASH損傷的關系，還有待于進一步研究。

2.4 細胞焦亡與中毒性肝損傷的關系 短期攝入低濃度的有毒有害物質一般不會對機體造成明顯的損傷。然而，有毒有害物質長期攝入或者藥物的過量使用都會引發(fā)肝臟損傷，甚至會造成急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）。

臨床上，對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）的過量服用是ALF最常見的誘因之一。ALF主要以大量肝細胞功能紊亂為主要特征，從而引起嚴重的肝損傷［48］。APAP可通過線粒體氧化應激、核DNA斷裂和線粒體通透性轉變直接損傷肝細胞［49］。研究還發(fā)現(xiàn)，APAP誘導肝細胞死亡后，釋放的ATP和NAD在激活P2X7分子后，會觸發(fā)NLRP3炎癥小體，最終造成肝損傷［50］。因此，DAMPs介導的先天性免疫信號炎癥反應，激發(fā)了APAP誘導的肝毒性［51］。Cu是體內(nèi)必需的微量元素，然而過量攝入后會造成多個器官損傷。研究發(fā)現(xiàn)，長期暴露在Cu作用下的雞源性肝細胞，細胞存活率會顯著下降，且Caspase-1、IL-1β、IL-18和NLRP3等細胞焦亡相關因子表達水平顯著上調［52］。因此推斷Cu可能誘導了肝臟細胞焦亡的發(fā)生。苯并芘（α）是世界公認的致癌物，且分布廣泛。肝臟是苯并芘（α）代謝的主要場所。研究發(fā)現(xiàn)，苯并芘（α）可導致多種炎癥因子的分泌，誘導炎癥反應的發(fā)生。劉俊義［53］以HL-7702肝細胞為研究對象，結果顯示苯并芘（α）可誘導肝細胞焦亡，這可能是造成肝中毒損傷的重要機制之一。肝中毒性損傷時有發(fā)生，細胞焦亡為緩解肝毒性損傷提供了新的研究角度。

3 小結與展望

細胞焦亡是一種新發(fā)現(xiàn)的PCD，與肝臟疾病的發(fā)生密切相關。然而，細胞焦亡是如何引起肝臟損害以及細胞焦亡在肝臟疾病發(fā)生過程中起到怎樣的作用？這些問題還有待于進一步研究和闡述。細胞發(fā)生焦亡后，釋放的炎癥因子不僅可以增強機體對致病因子的抵抗力，還可以通過誘導細胞焦亡的發(fā)生從而抑制肝細胞的增殖和遷移。然而，過度的細胞焦亡發(fā)生會加重炎癥反應的生成，造成肝臟損傷，甚至會引起肝纖維化和癌變。因此，探討細胞焦亡與肝臟損傷的關系，可為肝病的防治提供新的思路和方法。